Experimentelles Modell zur Evaluierung des Abklingens von Lungenentzündungen

Dieses Manuskript beschreibt die Etablierung eines infektiösen Modells der Lungenentzündung bei Mäusen und die entsprechende Charakterisierung der Verletzungsauflösung sowie Methoden zur Züchtung von Bakterien und zur intratrachealen Instillation. Ein neuartiger Ansatz mit Hilfe der hochdimensionalen Durchflusszytometrie zur Bewertung der Immunlandschaft wird ebenfalls beschrieben.

Dieses Protokoll liefert ein reproduzierbares Modell einer Lungenentzündung, das eine robuste, akute Lungenschädigung hervorruft. Ein weiterer Vorteil dieses Modells besteht darin, dass es genutzt werden kann, um infektiöses ARDS oder akutes Atemnotsyndrom bei Mäusen zu reproduzieren. Wie ich bereits erwähnt habe, ist dieses Modell hochgradig reproduzierbar, da die Mortalität und das Verletzungsniveau leicht titriert werden können, um frühe und späte Phasen der akuten Lungenschädigung und -auflösung zu bewerten, was als Plattform für die Bewertung therapeutischer Strategien dient.

Obwohl dieses Protokoll keinen neuartigen Ansatz für die Diagnose oder Behandlung von Lungenverletzungen bietet, ist es ein zuverlässiges Modell, mit dem neue Therapien getestet werden können, was besonders für Bereiche im Zusammenhang mit Immunologie, Lungenerkrankungen und Infektionskrankheiten nützlich ist. Einer der Vorteile dieser Technik ist ihre Reproduzierbarkeit. Bei Personen, die diese Technik zum ersten Mal anwenden, kann es jedoch zu Schwierigkeiten beim intratrachealen Einführen des Katheters kommen.

Aus diesem Grund sollten Menschen, die diese Technik erlernen, idealerweise mit dem Üben an eingeschläferten Tieren beginnen. Erwärmen Sie zu Beginn eine Blutagarplatte 10 Minuten lang bei 37 Grad Celsius in einem beheizten Schüttler oder Inkubator. Nehmen Sie ein neues Bakteriensuppenfläschchen aus dem Gefrierschrank und tauen Sie es durch leichtes Rühren in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad auf, bis das Fläschchen vollständig aufgetaut ist.

Vermeiden Sie es, den O-Ring oder die Kappe mit warmem Wasser zu berühren. Um die Bakterienkolonien manuell auf einer Platte zu zählen, führen Sie eine 1-mal-10-zu-sechste Verdünnung durch und plättieren Sie 200 Mikroliter von der letzten Verdünnung auf eine vorgewärmte Blutagarplatte. Inkubieren Sie die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius.

Am nächsten Tag bestimmen Sie die neue Bakterienkonzentration, indem Sie die angegebene Formel anwenden. Legen Sie die betäubte Maus auf eine saubere und sterilisierte Oberfläche. Hängen Sie die Maus an die Schneidezähne und kleben Sie die Vordergliedmaßen vorsichtig ab.

Rasieren Sie die Halsregion und desinfizieren Sie den Bereich mit Chlorhexidin und 70%igem Alkohol. Machen Sie dann mit einer chirurgischen Schere einen ein Zentimeter großen Schnitt an der oberflächlichen Mittellinie des Halses, um die Luftröhre sichtbar zu machen. Wenn viel Fettgewebe zu sehen ist, zerlegen Sie das Fettgewebe vorsichtig vertikal, um die Luftröhre sichtbar zu machen.

Ziehen Sie die Zunge vorsichtig nach außen und führen Sie einen 20-Gauge-Angiokatheter durch den Mund ein, wodurch der Katheter in die Luftröhre vorgeschoben wird. Üben Sie sanften Druck auf die Luftröhre aus, um die Intubation zu erleichtern. Schließen Sie die Maus nach der Intubation an ein Beatmungsgerät an, um die Intubation zu bestätigen.

Stellen Sie die Parameter des Beatmungsgeräts auf 200 Mikroliter Atemzugvolumen und 200 Hübe pro Minute ein. Trennen Sie die Maus nach Bestätigung der Intubation vom Beatmungsgerät und instillieren Sie vorsichtig 50 Mikroliter des bakteriellen Wirkstoffs durch den Angio-Katheter mit einer 200-Mikroliter-Pipette und einer Gelladespitze. Schließen Sie die Maus nach der Installation wieder an die Atemschutzmaske an, um die Atmung wieder aufzunehmen.

Lassen Sie die Maus 30 bis 60 Sekunden lang auf dem Atemschutzgerät, um die Atmung zu überwachen. Wenn ein langsames Atemmuster beobachtet wird, schließen Sie die Maus wieder an die Atemschutzmaske an. Schließen Sie den Schnitt, indem Sie einen Tropfen Kleber auf die Haut geben.

Bringen Sie die Hautfalten zusammen und üben Sie leichten Druck aus, bis der Kleber getrocknet ist. Legen Sie die euthanasierte Maus in Rückenlage auf ein sauberes OP-Brett und hängen Sie sie an die Schneidezähne. Nachdem Sie die Maushaut mit 70% Ethanol besprüht haben, führen Sie mit einer Schere eine kleine, oberflächliche Entfernung des Halses in der Mittellinie durch, um die Luftröhre sichtbar zu machen.

Kanülieren Sie die Luftröhre mit einem 20-Gauge-Katheter und fügen Sie vorsichtig einen Milliliter kalziumfreies PBS intratracheal mit einer Ein-Milliliter-Spritze hinzu. Lassen Sie die Lunge vollständig expandieren und saugen Sie dann die Flüssigkeit mit derselben Spritze ab. Wiederholen Sie den Vorgang zweimal für insgesamt zwei Milliliter.

Übertragen Sie die bronchoalveoläre Lavage (BAL) in ein Zwei-Milliliter-Aliquot. Öffnen Sie mit einer Schere die Brusthöhle, um Lunge, Herz und Luftröhre freizulegen. Präparieren Sie vorsichtig das Zwerchfell und entfernen Sie den Brustkorb, um sicherzustellen, dass das Lungengewebe nicht eingeklemmt wird.

Die Bauchschlagader durchschneiden, um eine Ausblutung zu ermöglichen. Perfundierten Sie das Lungengewebe, indem Sie mit einer Schere einen kleinen Schnitt von etwa ein bis zwei Millimetern in den rechten Ventrikel vornehmen und fünf Milliliter kaltes PBS mit einem 20-Gauge-Katheter injizieren. Nach erfolgreicher Perfusion färbt sich das Lungengewebe weiß und blass, und das PBS verlässt das intravaskuläre Kompartiment durch die Bauchaorta.

Entnehmen Sie dann vorsichtig die Lunge und präparieren Sie sie aus der Luftröhre. Wenn die Lunge für die Histologie verwendet wird, führen Sie alternativ vorsichtig einen 20-Gauge-Katheter ein, um die Lunge bis zu 25 Zentimeter mit Formalinlösung aufzublasen. Sobald die Lunge insuffliert ist, führen Sie einen etwa fünf Zentimeter langen 3/O-Nahtfaden unter die Luftröhre und binden Sie ihn zweimal fest, um sicherzustellen, dass das Formalin im Lungengewebe bleibt.

Trennen Sie die Lunge vorsichtig vom restlichen Gewebe und legen Sie sie in ein konisches 15-Milliliter-Röhrchen mit 10 Millilitern Formalinlösung. Zentrifugieren Sie den BAL bei 500 g bei vier Grad Celsius für fünf Minuten und entfernen Sie den zellfreien Überstand in einem separaten Röhrchen. Lysieren Sie die roten Blutkörperchen, indem Sie eine Minute lang 100 Mikroliter Lysingpuffer hinzufügen.

Neutralisieren Sie die Lysingreaktion durch Zugabe von einem Milliliter PBS. Zentrifugieren Sie das BAL und entfernen Sie den Überstand, bevor Sie das Pellet in 100 bis 300 Mikrolitern PBS wieder suspendieren. Führen Sie als Nächstes eine Zellzählung mit 0,4 % Trypanblau-Färbung durch automatisierte Zellzählung durch.

Präparieren Sie die Lunge vorsichtig aus dem Gewebe in einem konischen 15-Milliliter-Röhrchen, das fünf Milliliter kaltes PBS enthält. Entfernen Sie nach der Dissektion die Lunge aus dem PBS und trocknen Sie sie mit einem Papiertuch ab. Präparieren Sie die rechte und linke Lunge von anderen Geweben, die ebenfalls entnommen wurden, wie z. B. der Luftröhre.

Bereiten Sie einen Verdauungscocktail zu, wie im Textmanuskript beschrieben, und geben Sie die Lunge in ein C-Röhrchen, das einen Milliliter Verdauungscocktail enthält. Übertragen Sie den Schlauch in den Gewebedissoziator und befolgen Sie das standardisierte Protokoll für die Verarbeitung von Lungengewebe. Nach der Dissoziation 10 Milliliter kaltes PBS in die Tube geben und gut mischen.

Filtrieren Sie die einzellige Suspension mit einem 70-Mikron-Zellsieb auf einem konischen 50-Milliliter-Schlauch auf Eis. Die Suspension zentrifugieren und den Überstand entfernen. Geben Sie einen Millimeter Lysingpuffer für eine Minute bei Raumtemperatur hinzu.

Fügen Sie dann 10 Milliliter kaltes PBS hinzu, um die Lysereaktion zu stoppen und den Überstand zu entfernen. Resuspendieren Sie die Zellen in PBS und führen Sie eine Zellzählung mit Trypanblau-Färbung durch automatisierte Zellzählung durch. Nach bakterieller Lungenentzündung induzierter Lungenschädigung bei Mäusen wiesen die infizierten Gruppen im Vergleich zur nicht infizierten Kontrolle ein geringeres Körpergewicht auf.

Die Gruppe der Streptococcus pneumoniae oder Spn erholte sich in Richtung Ausgangswert, während Klebsiella pneumoniae oder Kpn-infizierte Mäuse nach sechs Tagen der Infektion eine langsame Erholung zeigten. Die BAL-Proteinkonzentration und die Gesamtzellzahl sowohl für die BAL als auch für die Lunge waren in den infizierten Gruppen deutlich höher. Repräsentative histologische Schnitte, die den Entzündungsprozess in beiden Modellen zeigten, wurden an den Tagen zwei, vier und sechs nach der Inokulation erhalten, die Hinweise auf eine anhaltende alveoläre Entzündung bei den Kpn-infizierten Mäusen zeigten, sogar an Tag 10.

Kpn-infizierte Mäuse setzten die Verletzung bis zum 10. Tag fort, während Spn-infizierte Mäuse die Lungenentzündung bis zum sechsten Tag abbildeten. Die Mehrfarben-Durchflusszytometrie der Immunzelllandschaft nach sechstägiger Spn-Infektion zeigte eine erhöhte Anzahl von Granulozyten, interstitiellen Makrophagen, Monozyten, B-Zellen und T-Zellen, einschließlich natürlicher Killerzellen. Beim Versuch dieser Methode ist das Einführen des Katheters der Schlüssel zu replizierbaren Infektionen.

Dies ist eine zuverlässige Methode, die als Plattform für die Identifizierung von Zielen für die Untersuchung und Auflösung akuter Lungenschäden dient.