Name: Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min
Description: Lernen Sie die Probenvorbereitung für MALDI-Massenspektrometrie-Bildgebung zur Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung von Lipidverteilungen in situ ohne Markierung.

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Yuki X. Chen, Kelly Veerasammy und Mayan Hein werden vom Sloan Foundation CUNY Summer Research Program (CSURP) unterstützt. Jun Yin wird durch das intramurale Forschungsprogramm der National Institutes of Health Projektnummer 1ZIANS003137 unterstützt. Unterstützt wurde dieses Projekt durch einen PSC-CUNY Award an Ye He und Rinat Abzalimov, der gemeinsam vom Professional Staff Congress und der City University of New York finanziert wurde.

1. Einbettung von Fliegenköpfen
HINWEIS: Der gesamte Vorgang dauert ~45-60 min.
<ol><li>Bereiten Sie die optimale Schnitttemperaturmischung (OCT-Compound) mit einer ebenen Oberfläche vor.<ol><li>OCT in ein Kunststoffkryomold (15 mm x 15 mm x 5 mm) bis zur Hälfte der Tiefe des Kryoms geben und Blasenbildung vermeiden. Lassen Sie die Form einige Minuten auf einer ebenen Oberfläche stehen und übertragen Sie sie dann auf Trockeneis.</li>
		<li>Halten Sie den Kryomold flach auf dem Trockeneis und lassen Sie das OCT eine ebene und ebene Oberfläche bilden. Warten Sie, bis das OCT vollständig in der Form verfestigt ist. Verwenden Sie die gefrorenen OCT-Stufen sofort oder lagern Sie sie bei −80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Betäuben Sie erwachsene Fliegen mit CO 2 (d. H. Ein CO2 -Pad).<ol><li>Bereiten Sie eine Petrischale vor, die ein Stück Labortuch enthält. Verwenden Sie Wasser, um einen Teil des Tuchs zu befeuchten, um die statische Elektrizität zu reduzieren. Halten Sie das Tuch halb nass und halb trocken.</li>
		<li>Verwenden Sie unter Sezierbereich 1 eine Pinzette, um den Fliegenkopf zu schneiden. Sammeln Sie jedes Mal 4-5 Köpfe und legen Sie sie auf den trockenen Bereich des Labortuchs. HINWEIS: Die Sammlung von 4-5 Köpfen dauert ~ 2 Minuten.</li>
	</ol></li>
	<li>Übertragen Sie die OCT-Stufe vom Trockeneis in den Präparierbereich.<ol><li>Nehmen Sie den OCT-Tisch von Trockeneis zu Mikroskop 2, übertragen Sie die Köpfe sofort auf den OCT-Tisch und ordnen Sie sie schnell an, was ~30 s dauert, um OCT-Schmelzen zu vermeiden. Lassen Sie ~ 1 mm Leerraum um jedes Fliegenhirn herum, um eine ausreichende Unterstützung durch das OCT und 4-5 mm Leerraum vom Rand des Blocks zu gewährleisten, um ausreichend Platz für die Handhabung des Abschnitts zu schaffen. Wenn der Rüssel zu lang ist, entfernen Sie die Spitze; Wenn es nicht zu lang ist, halten Sie es intakt. Stellen Sie die OCT-Stufe wieder auf das Trockeneis und lassen Sie sie ~3 Minuten einwirken, um sicherzustellen, dass die OCT-Stufe gefroren und fest bleibt.</li>
		<li>Wenn die OCT-Stufe wieder auf dem Trockeneis ist und auf die Erstarrung wartet, sammeln Sie eine weitere Runde Köpfe. Wiederholen Sie die Schritte 1.2 und 1.3, um weitere Samples auf den verbleibenden Platz auf der Bühne zu übertragen. HINWEIS: Acht Köpfe werden normalerweise für jeden Genotyp vorbereitet, und vier Genotypen werden in einer OCT-Stufe in diesem Labor verwendet.</li>
		<li>Verwenden Sie zwei Dissektionsmikroskope nebeneinander, um zu vermeiden, dass der Fokus geändert wird und die Zeit für den Transfer und die Anordnung der Köpfe auf dem OCT-Tisch verlängert wird, und um das Risiko des Schmelzens des OCT-Tisches zu verringern.</li>
	</ol></li>
	<li>Nachdem alle Fliegenköpfe ausgerichtet sind, lassen Sie die OCT-Bühne weitere 5-10 Minuten auf dem Trockeneis sitzen.</li>
	<li>Nehmen Sie die OCT-Stufe vom Trockeneis weg, legen Sie sie auf eine ebene Oberfläche (Bank) und fügen Sie dann schnell eine große Menge OCT-Verbindung hinzu, um alle Proben abzudecken, und füllen Sie die gesamte Kryoform, was ~ 3 s dauert.</li>
	<li>Übertragen Sie das Kryomold sofort zurück auf Trockeneis und frieren Sie den gesamten OCT-Block mit den eingebetteten Geweben ein. Lassen Sie die OCT-Bühne weitere 5-10 Minuten auf dem Trockeneis sitzen. Beschriften Sie die Proben am Rand der Kryoform.</li>
	<li>Lagern Sie die gefrorenen Proben bei −80 °C, bis sie zum Schneiden bereit sind.</li>
</ol>2. Kryosektion des Gewebes
HINWEIS: Tragen Sie beim Umgang mit Indiumzinnoxid (ITO)-Objektträgern immer Handschuhe, um eine Gewebekontamination zu vermeiden. Das Tragen einer Maske wird ebenfalls empfohlen, um zu vermeiden, direkt auf die Rutsche zu atmen.
<ol><li>Bestätigen Sie die ITO-beschichtete Seite, indem Sie die Leitfähigkeit der ITO-Objektträger mit einem auf Widerstand eingestellten Voltmeter testen. Markieren Sie die Seite mit einer Widerstandsmessung als die Seite, an der das Gewebe haften soll. Beschriften Sie es und legen Sie immer ein Labortuch auf den Boden des Objektträgers, um eine Kontamination des Objektträgers zu vermeiden.</li>
	<li>Lassen Sie das Gewebe in der Kryostatkammer für 30-45 min balancieren.<ol><li>Um das Schmelzen des OCT zu vermeiden, legen Sie alle notwendigen Werkzeuge wie Pinzette und einen dünnen Künstlerpinsel rechtzeitig in die Kryostatkammer, um sie vorzukühlen.</li>
	</ol></li>
	<li>Reinigen Sie den Kryostaten, vorzugsweise mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Rollplatte und den Tisch ab und entfernen Sie gebrauchte Klingen. Verwenden Sie zusätzliche saubere Tücher, um sicherzustellen, dass das Ethanol verdampft ist und dass alle Oberflächen trocken sind, bevor das Schneiden beginnt.</li>
	<li>Passen Sie die Temperatur der Kryostatkammer und des Probenkopfes entsprechend der Art des Gewebes an (z. B. −14 °C für Leber, −20 °C für Muskeln und −25 °C für Haut10; −18 °C für Fliegenköpfe in diesem Protokoll).</li>
	<li>Befestigen Sie das Gewebe mit OCT auf dem Probenhalter. Achten Sie darauf, genügend OCT zu verwenden, um die Basis des OCT-Blocks abzudecken, und montieren Sie den Block so flach wie möglich.</li>
	<li>Legen Sie eine saubere Klinge in die Bühne und verriegeln Sie sie. Positionieren Sie den Kopf der Probe nach Bedarf auf dem Tisch, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen.<ol><li>Platzieren Sie den Probenblock in einer Ausrichtung, in der alle Genotypen/Behandlungsgruppen senkrecht zur Klinge positioniert sind. HINWEIS: Dies gewährleistet eine gleichmäßige Schnittebene und vermeidet Kreuzkontaminationen durch verschiedene Gruppen. Wenn Sie einen anderen Gewebeblock schneiden, wechseln Sie zwischen den Proben zu einer neuen Klinge, um eine Kreuzkontamination zu vermeiden.</li>
	</ol></li>
	<li>Beginnen Sie mit dem Schneiden in dicken Abschnitten (50-100 μm), bis der interessierende Bereich (z. B. die gewünschte Region des Gehirns) gefunden ist.<ol><li>Bürsten Sie ständig zusätzliche Stücke mit einem vorgekühlten Künstlerpinsel ab, um die Bühne sauber zu halten.</li>
	</ol></li>
	<li>Ändern Sie die Dicke der Abschnitte auf 10-12 μm, sobald der gewünschte Bereich erreicht ist.<ol><li>Stellen Sie die Kammertemperatur nach Bedarf leicht ein. Stellen Sie beispielsweise eine höhere Temperatur ein, wenn der Abschnitt dazu neigt, leicht abzublättern oder auseinanderzufallen. HINWEIS: Die empfohlene Temperatur für OCT-Blöcke beträgt −18 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>Sammeln Sie den gewünschten Abschnitt sorgfältig und kleben Sie ihn auf die ITO-Folie. Führen Sie diesen Vorgang in der Kryostatkammer durch.<ol><li>Nehmen Sie einen ITO-Objektträger bei Raumtemperatur und positionieren Sie ihn über dem Abschnitt, nähern Sie sich dem Abschnitt sanft und schnell, damit der Abschnitt am Schlitten haftet, ohne Spuren auf der Kryostatstufe zu hinterlassen. HINWEIS: Das OCT schmilzt und haftet an der Folie.</li>
	</ol></li>
	<li>Legen Sie den Objektträger in ein Gestell oder ein Labortuch außerhalb des Kryostaten zwischen den Sammlungen mehrerer Abschnitte.</li>
	<li>Wenn ein Vergleich zwischen verschiedenen Proben derselben Kohorte gewünscht wird, platzieren Sie die Schnitte aus mehreren Proben auf einem einzigen Objektträger, um eine gleichzeitige Analyse und minimale Variation zu ermöglichen. Bei Bedarf trennen Sie zwei Objektträger, da der MALDI-Zielhalter zwei Dias in einem Durchgang aufnehmen kann.</li>
	<li>Transportieren Sie die Objektträger in einer Vakuumbox zu einem Exsikkator mit Trockenmittel als unterster Schicht. Trocknen Sie die Objektträger unter Vakuum für 30-60 min. HINWEIS: Alternativ, wenn das Labor nicht mit einem Vakuum-Exsikkator ausgestattet ist, sollten die Objektträger während des gesamten Prozesses bei −20 °C aufbewahrt werden, bis sie innerhalb von 24 Stunden bei -80 °C gelagert oder auf Trockeneis transportiert werden, um die Verschlechterung von Lipiden oder Metaboliten zu vermeiden.</li>
	<li>Fahren Sie mit der Matrixabscheidung fort. Verwenden Sie 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB) in Methanol/Wasser (70/30, v/v) als Matrix.</li>
	<li>Wenn Objektträger nicht sofort ausgeführt werden, lagern Sie die Objektträger entweder bei −80 °C (bis zu 1 Monat für Fliegenhirnschnitte und 6 Monate für Nagetierhirnabschnitte) oder senden Sie die Probe sofort mit ausreichendem Trockeneis an MALDI-Kernanlagen. Für eine optimale Lagerung und den Versand legen Sie die Dias in einen Objektträgertransporter und verschließen die Öffnung sicher mit Wachsfolie. Verschließen Sie mit einem Reißverschlussbeutel, legen Sie ihn in einen anderen Reißverschlussbeutel mit Trockenmittel und beschriften Sie die Außenseite. HINWEIS: Die folgenden Schritte des Dia-Scannings, der Matrixabscheidung und der MALDI-Bildgebungsverfahren11 finden Sie in früheren Arbeiten.</li>
	<li>Führen Sie die Matrixabscheidung mit dem automatischen HTX M5-Matrixsprühgerät und einer 40 mg / ml-Lösung von DHB in Methanol / Wasser (70/30, v / v) durch. Sprühen Sie die Matrix mit einer kundenspezifischen Durchflussrate von 0,12 ml/min und einer Düsentemperatur von 85 °C für 10 Durchgänge. Verwenden Sie einenN2-Gasdruck von 10 psi. HINWEIS: Wenn der N2-Gasdruck im Sprühgerät unter 5 psi gesenkt wird, schaltet ein Sicherheitsmechanismus im Sprühgerät die Heizung sofort ab, um Schäden am Sprühgerät mit einer Sprühgeschwindigkeit von 1.300 mm/min, einem Spurabstand von 2 mm, einer Durchflussrate von 3 l/min und einer Düsenhöhe von 40 mm zu vermeiden.</li>
	<li>Verwenden Sie ein MALDI Time of Flight (TOF) MS-Instrument (siehe Materialtabelle) im positiven Ionenmodus, um ein Massenspektrum innerhalb der Massenbereiche von m/z 50-1.000 zu erfassen.<ol><li>Um das Gerät zu kalibrieren, erkennen Sie 0,5 μL rote Phosphoremulsion in Acetonitril auf die ITO-Objektträger und verwenden Sie seine Spektren, um das Gerät im Massenbereich von 50-1.000 m / z zu kalibrieren, indem Sie eine quadratische Kalibrierkurve2 anwenden.</li>
		<li>Stellen Sie die Laserspotdurchmesser auf Mittel ein, da dies das modulierte Strahlprofil für eine Rasterbreite von 40 μm ist, und sammeln Sie Bilddaten, indem Sie 500 Aufnahmen mit einer Laserwiederholrate von 1.000 Hz pro Array-Position summieren.</li>
		<li>Verwenden Sie Software (siehe Materialtabelle), um die Spektraldaten aufzuzeichnen und zu verarbeiten. Führen Sie eine Bilddatenanalyse unter Verwendung der RMS-Normalisierung (Root Mean Square) durch, um Ionenbilder mit einer Bin-Breite von ±0,10 Da zu erzeugen. Richten Sie die Spektren sowohl des OCT als auch des Hirngewebes aus demselben Experiment mit der Software aus, um die überlappenden Peaks und die Ionenunterdrückungsinterferenz des OCT zu bewerten (ergänzende Abbildung S1). Nach dem Experiment verarbeiten Sie die MALDI-Objektträger, die die Gewebeproben enthalten, durch Hämatoxylin- und Eosinfärbung (H & E), wie zuvor beschrieben11.</li>
	</ol></li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Wie in der Studie über die Variationen der Lipidzusammensetzung in mutierten und Wildtyp-Drosophila-Gehirnen gezeigt wurde, kann MALDI MSI eine wertvolle markierungsfreie Bildgebungstechnik für die In-situ-Analyse molekularer Verteilungsmuster in Organen kleiner Insekten sein. Da Lipide sowohl im Hirngewebe als auch im Fettkörper von Drosophila-Köpfen verteilt sind, können herkömmliche Lipidomik-Ansätze, die auf Flüssigchromatographie und Massenspektrometrie (LC-MS) basieren, nur kombinierte Si...

Lipide sind an einer Vielzahl biologischer Prozesse beteiligt und können aufgrund ihrer strukturellen Vielfalt grob in fünf Kategorien eingeteilt werden: Fettsäuren, Triacylglycerole (TAGs), Phospholipide, Sterollipide und Sphingolipide1. Die grundlegenden Funktionen von Lipiden bestehen darin, Energiequellen für biologische Prozesse (dh TAGs) bereitzustellen und Zellmembranen zu bilden (dh Phospholipide und Cholesterin). Es wurden jedoch zusätzliche Rollen von Lipiden bei der Entwicklung und bei Krankheiten festgestellt und im biomedizinischen Bereich umfassend untersucht. Zum Beispiel haben Berichte gezeigt, dass Fettsäuren unterschiedlicher Länge einzigartige therapeutische Rollen haben können. Kurze Fettsäureketten können an Abwehrmechanismen gegen Autoimmunerkrankungen beteiligt sein, mittellange Fettsäureketten produzieren Metaboliten, die Anfälle mildern können, und lange Fettsäureketten erzeugen Metaboliten, die zur Behandlung von Stoffwechselstörungen eingesetzt werden können2. Im Nervensystem haben sich glia-abgeleitetes Cholesterin und Phospholipide als wichtig für die Synaptogenese erwiesen 3,4. Andere Arten von Lipiden haben sich in medizinischen Anwendungen als vielversprechend erwiesen, einschließlich Sphingolipide, die in Arzneimittelabgabesystemen verwendet werden, und Saccharolipide, die zur Unterstützung des Immunsystems verwendet werden 5,6. Die zahlreichen Rollen und potenziellen therapeutischen Anwendungen von Lipiden im biomedizinischen Bereich haben die Lipidomik - die Untersuchung der Wege und Wechselwirkungen zellulärer Lipide - zu einem kritischen und zunehmend wichtigen Bereich gemacht.
Die Lipidomik nutzt die analytische Chemie, um das Lipidom in großem Maßstab zu untersuchen. Die wichtigsten experimentellen Methoden, die in der Lipidomik verwendet werden, basieren auf Massenspektrometrie (MS) in Verbindung mit verschiedenen Chromatographie- und Ionenmobilitätstechniken 7,8. Die Verwendung von MS in diesem Bereich ist vorteilhaft aufgrund seiner hohen Spezifität und Sensitivität, Geschwindigkeit der Erfassung und einzigartigen Fähigkeiten, (1) Lipide und Lipidmetaboliten nachzuweisen, die auch bei niedrigen und vorübergehenden Konzentrationen auftreten, (2) Hunderte von verschiedenen Lipidverbindungen in einem einzigen Experiment nachzuweisen, (3) bisher unbekannte Lipide zu identifizieren und (4) zwischen Lipidisomeren zu unterscheiden. Unter den Entwicklungen in der MS, einschließlich Desorptionselektrospray-Ionisation (DESI), MALDI und Sekundärionen-Massenspektrometrie (SIMS), hat sich MALDI MSI als eine leistungsstarke Bildgebungstechnik herausgestellt, die herkömmliche MS-basierte Ansätze ergänzt, indem sie einzigartige Informationen über die räumliche Verteilung von Lipiden innerhalb der Gewebekompartimente 9,10 liefert.
Der typische Arbeitsablauf der Lipidomik besteht aus Probenvorbereitung, Datenerfassung mittels Massenspektrometrie-Technologie und Datenanalyse11. Die Untersuchung von Lipiden und Metaboliten in Proben hat zur Entstehung von Techniken geführt, um die physiologischen und pathologischen Bedingungen von Stoffwechselprozessen in Organismen zu verstehen. Während das Verständnis biologischer Wechselwirkungen wichtig ist, macht es die Empfindlichkeit von Lipiden und Metaboliten schwierig, sie ohne Farbstoffe oder andere Modifikationen abzubilden und zu identifizieren. Veränderungen der Metabolitenspiegel oder -verteilung können zu phänotypischen Veränderungen führen. Ein Werkzeug für das metabolomische Profiling ist MALDI MSI, ein markierungsfreies In-situ-Bildgebungsverfahren , das Hunderte von Molekülen gleichzeitig nachweisen kann. Die MALDI-Bildgebung ermöglicht die Visualisierung von Metaboliten und Lipiden in Proben unter Beibehaltung ihrer Integrität und räumlichen Verteilung. Frühere Technologien für die Lipidprofilierung beinhalteten die Verwendung radioaktiver Chemikalien, um Lipide individuell abzubilden, während die MALDI-Bildgebung darauf verzichtet und die gleichzeitige Detektion einer Reihe von Lipiden ermöglicht.
Fettstoffwechsel und Homöostase spielen wichtige Funktionen in der Zellphysiologie, wie die Erhaltung und Entwicklung des Nervensystems. Ein wesentlicher Aspekt des Lipidstoffwechsels des Nervensystems ist der Lipidtransfer zwischen Neuronen und Gliazellen, der durch molekulare Trägerlipoproteine vermittelt wird, einschließlich Very-Low-Density-Lipoprotein (VLDL), Low-Density-Lipoproteine (LDL) und High-Density-Lipoproteine (HDL)12. Lipoproteine enthalten Apolipoproteine (Apo) wie ApoB und ApoD, die als Strukturblöcke der Lipidfracht und als Liganden für Lipoproteinrezeptoren fungieren. Das Neuron-Glia-Crosstalk von Lipiden umfasst mehrere Akteure wie glia-abgeleitete ApoD, ApoE und ApoJ und ihre neuronalen LDL-Rezeptoren (LDLRs)13,14. Bei Drosophila ist Apolipophorin, ein Mitglied der ApoB-Familie, ein wichtiger Hämolymphlipidträger15. Apolipophorin hat zwei eng verwandte Lipophorinrezeptoren (LpR), LpR1 und LpR2, die Homologe von LDLR15,16 von Säugetieren sind. In früheren Studien wurde entdeckt, dass das Astrozyten-sezernierte Lipocalin Glial Lazarillo (GLaz), ein Drosophila-Homolog des menschlichen ApoD, und sein neuronaler Rezeptor LpR1 kooperativ das Neuron-Glia-Lipid-Shuttle vermitteln und so die Dendritenmorphogenese regulieren17. Daher wurde spekuliert, dass der Verlust von LpR1 zu einer Abnahme des Gesamtlipidgehalts im Drosophila-Gehirn führen würde. MALDI MSI wäre ein geeignetes Werkzeug, um den Lipidgehalt in kleinen Geweben von LpR1−/−-mutierten und Wildtyp-Drosophila-Gehirnen zu profilieren, wie in dieser Studie gezeigt.
Trotz der wachsenden Beliebtheit von MALDI MSI behindern die hohen Kosten und die experimentelle Komplexität des Instruments oft den Einsatz in einzelnen Laboratorien. Daher werden die meisten MALDI MSI-Studien mit gemeinsamen Core Facilities durchgeführt. Wie bei anderen Anwendungen von MALDI MSI ist ein sorgfältiger Probenvorbereitungsprozess für die Lipidomik entscheidend, um zuverlässige Ergebnisse zu erzielen. Da die Probenobjektträgervorbereitung jedoch in der Regel in einzelnen Forschungslabors durchgeführt wird, besteht die Möglichkeit von Abweichungen bei der Erfassung von MALDI MSI. Um dies zu bekämpfen, zielt dieses Papier darauf ab, ein detailliertes Protokoll für die Probenvorbereitung kleiner biologischer Proben vor der MALDI-MSI-Messung unter Verwendung der Lipidanalyse einer großen Gruppe erwachsener Drosophila-Gehirne im positiven Ionenmodus als Beispielbereitzustellen 11,17. Einige Phospholipidklassen und die Mehrheit der kleinen Metaboliten werden jedoch durch MALDI-Bildgebung im negativen Ionenmodus, der zuvor beschrieben wurde11, günstig nachgewiesen. Daher hoffen wir, mit diesen beiden Beispielstudien detaillierte Probenvorbereitungsprotokolle verschiedener Kombinationen bereitzustellen: freistehendes großes Gewebe versus eingebettetes kleines Gewebe, Taumontage versus Warmobjektträgermontage und positiver Ionenmodus versus negativer Ionenmodus.

<table><tbody><tr><td>2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB)</td><td>Millipore Sigma Aldrich</td><td>85707-1G-F</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; CRYOMOLD 15X15X5</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9464347</td><td></td></tr><tr><td>Andwin Scientific&nbsp; Tissue-Tek CRYO-OCT Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-373-65</td><td></td></tr><tr><td>Künstlerpinsel MSC #5 1/8 X 9/16 TRIM RED SABLE</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-2302</td><td></td></tr><tr><td>autoflex speed MALDI-TOF MS System</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>MALDI-TOF MS Instrument</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Spritze mit Luer-Lok Spitzen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-823-16E</td><td></td></tr><tr><td>BD&nbsp; Vacutainer Spritzennadeln für den allgemeinen Gebrauch</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-021-020</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Daltonics&nbsp; GLAS DIAS MALDI IMAGNG</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0380464</td><td></td></tr><tr><td>Drierit, mit Indikator, 8 mesh, ACROS Organics</td><td></td><td>AC219095000</td><td></td></tr><tr><td>Epson Perfection V600 Photo Scanner</td><td>Amazon</td><td>Perfection V600</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; 5-fach Slide Mailer</td><td>Fisher Scientific</td><td>HS15986</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Digitales Multimeter mit automatischer Reichweite</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-241-1</td><td></td></tr><tr><td>FlexImaging v3.0</td><td>Bruker Daltonics Inc</td><td></td><td>Bruker MS bildgebende Analysesoftware</td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>MMX04751</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Qualität Wasser Fisher</td><td>Scientific</td><td>W5-1</td><td></td></tr><tr><td>HTX M5 Sprühgerät</td><td>HTX Technologies, LLC</td><td></td><td>Automatische beheizte Matrix Feldspritze</td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&nbsp; Kimtech Science Kimwipes Empfindliche Arbeitswischer</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666A</td><td></td></tr><tr><td>MSC&nbsp; Gefrierbeutel mit Reißverschluss</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-111-3769</td><td></td></tr><tr><td>SCiLS Lab (2015b)</td><td>SCiLS Lab</td><td></td><td>Advanced MALDI MSI Datenanalysesoftware</td></tr><tr><td>Thermo Scientific CryoStar NX50 Kryostat</td><td>Fisher Thermo Scientific</td><td>95-713-0</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Transparentes Polycarbonat Klassisches Design Exsikkator</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-642-7</td><td></td></tr></tbody></table>

probenvorbereitung für die schnelle lipidanalyse im drosophila-gehirn mittels matrixgestützter laserdesorption/ionisations-massenspektrometrie-bildgebung

Sample Preparation for Rapid Lipid Analysis in Drosophila Brain Using Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging

Lipid-Profiling oder Lipidomik ist eine etablierte Technik, die verwendet wird, um den gesamten Lipidgehalt einer Zelle oder eines Gewebes zu untersuchen. Informationen, die aus der Lipidomik gewonnen werden, sind wertvoll für die Untersuchung der Signalwege, die an Entwicklung, Krankheit und Zellstoffwechsel beteiligt sind. Viele Werkzeuge und Instrumente haben Lipidomik-Projekte unterstützt, vor allem verschiedene Kombinationen von Massenspektrometrie und Flüssigkeitschromatographie-Techniken. Die matrixgestützte Laserdesorptions-/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (MALDI MSI) hat sich in jüngster Zeit als leistungsfähige Bildgebungstechnik herkömmlicher Ansätze herausgestellt. Diese neuartige Technik liefert einzigartige Informationen über die räumliche Verteilung von Lipiden innerhalb von Gewebekompartimenten, die bisher ohne übermäßige Modifikationen nicht erreichbar waren. Die Probenvorbereitung des MALDI-MSI-Ansatzes ist von entscheidender Bedeutung und steht daher im Mittelpunkt dieses Papiers. Dieser Artikel präsentiert eine schnelle Lipidanalyse einer großen Anzahl von Drosophila-Gehirnen , die in eine optimale Schnitttemperaturverbindung (OCT) eingebettet sind, um ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung kleiner Gewebe für die Lipidanalyse oder die Metaboliten- und niedermolekulare Analyse durch MALDI MSI bereitzustellen.

Es wurde angenommen, dass der Verlust des neuronalen Rezeptors LpR1 des astrozyten-sezernierten Lipocalins Glial Lazarillo (GLaz), einem Drosophila-Homolog der menschlichen ApoD, eine Abnahme des Gesamtlipidgehalts im Drosophila-Gehirn verursachen kann. Um dies zu testen, wurde MALDI MSI verwendet, um die Lipide in LpR1−/− mutierten und Wildtyp-Drosophila-Gehirnen zu profilieren, was im Folgenden näher ausgeführt wird.
Das Experiment wurde gemäß d...

Ziel dieses Protokolls ist es, detaillierte Anleitungen zur richtigen Probenvorbereitung für die Lipid- und Metabolitenanalyse in kleinen Geweben wie dem Drosophila-Gehirn unter Verwendung der matrixgestützten Laserdesorption / Ionisation (MALDI) Massenspektrometrie bereitzustellen.

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

Lipid profiling, or lipidomics, is a well-established technique used to study the entire lipid content of a cell or tissue. Information acquired ...

Die Maldi MS-Spektrometrie ist ein etabliertes und nützliches Werkzeug, um die Lipidhäufigkeit und -verteilung ohne übermäßige Probenmodifikation zu identifizieren und zu visualisieren. Der Hauptvorteil der Maldi-Bildgebung ist ihre Fähigkeit, die Lipide in situ ohne Markierung zu detektieren und eine große Anzahl von Proben gleichzeitig zu analysieren. Übung macht den Meister.Stellen Sie sicher, dass Sie gut üben, bevor Sie die echten experimentellen Proben verarbeiten. Minimieren Sie die Probenvorbereitungszeit und vermeiden Sie Kontaminationen während des gesamten Verfahrens. Fügen Sie zunächst die optimale Schnitttemperatur oder OCT in ein Kunststoffkryo-Kryogerät bis zur Hälfte der Tiefe der Kryoform hinzu und vermeiden Sie dabei die Bildung von Blasen.Lassen Sie die Form einige Minuten auf einer ebenen Oberfläche stehen und übertragen Sie sie dann auf Trockeneis. Halten Sie den Kryomold flach auf dem Trockeneis und lassen Sie das OCT eine ebene und ebene Oberfläche bilden. Warten Sie, bis das OCT vollständig in der Form verfestigt ist.Verwenden Sie die gefrorenen OCT-Stufen sofort oder lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius. Nach der Betäubung der erwachsenen Fliegen Bereiten Sie mit Kohlendioxid eine Petrischale vor, die ein Stück Labortuch enthält. Verwenden Sie Wasser, um einen Teil des Tuchs zu befeuchten, um die statische Elektrizität zu reduzieren.Halten Sie das Tuch halb nass und halb trocken. Nachdem Sie den Fliegenkopf unter einem Sezierfernrohr eins geschnitten haben, sammeln Sie vier bis fünf Köpfe und legen Sie sie auf den trockenen Bereich des Labortuchs. Nehmen Sie den OCT-Tisch vom Trockeneis zum zweiten Mikroskop.Bringen Sie die Köpfe sofort in den OCT-Tisch und ordnen Sie sie schnell an, was etwa 30 bis 60 Sekunden dauert, um ein OCT-Schmelzen zu vermeiden. Lassen Sie etwa einen Millimeter leeren Raum um jedes Fliegenhirn, um eine ausreichende Unterstützung durch das OCT zu gewährleisten, und vier bis fünf Millimeter Leerraum vom Rand des Blocks, um ausreichend Platz für die Handhabung des Abschnitts zu schaffen. Stellen Sie die OCT-Stufe wieder auf das Trockeneis und lassen Sie sie etwa drei Minuten einwirken, um sicherzustellen, dass die OCT-Stufe gefroren und fest bleibt.Nachdem alle Fliegenköpfe ausgerichtet sind, lassen Sie die OCT-Stufe weitere fünf bis 10 Minuten auf Trockeneis sitzen. Übertragen Sie die OCT-Stufe vom Trockeneis auf eine ebene Oberfläche und fügen Sie dann schnell eine große Menge OCT-Verbindung hinzu, um alle Proben abzudecken und die gesamte Kryoform zu füllen, was etwa drei Sekunden dauert. Übertragen Sie das Kryomold sofort zurück auf Trockeneis und frieren Sie den gesamten OCT-Block mit den eingebetteten Geweben ein.Lassen Sie die OCT-Bühne weitere fünf bis 10 Minuten auf dem Trockeneis sitzen. Beschriften Sie die Proben am Rand des Kryomls und lagern Sie die gefrorenen Proben bei minus 80 Grad Celsius, bis sie zum Schneiden bereit sind. Bestätigen Sie die ITO-codierte Seite, indem Sie die Leitfähigkeit der ITO-Objektträger mit einem auf Widerstand eingestellten Voltmeter testen.Markieren Sie die Seite mit einer Widerstandsmessung als die Seite, an der das Gewebe haften soll. Beschriften Sie es und legen Sie immer ein Labortuch auf den Boden des Objektträgers, um eine Kontamination des Objektträgers zu vermeiden. Lassen Sie dann das Gewebe 30 bis 45 Minuten in der Kryostatkammer ausgleichen.Reinigen Sie den Kryostaten, vorzugsweise mit 70% Ethanol. Wischen Sie die Rollplatte in der Stufe ab und entfernen Sie die verwendeten Klingen. Verwenden Sie zusätzliche saubere Tücher, um sicherzustellen, dass das Ethanol verdampft ist und dass alle Oberflächen trocken sind, bevor das Schneiden beginnt.Als nächstes passen Sie die Temperatur des Kryostatkammer-Sandprobenkopfes an die Art des Gewebes an. Montieren Sie das Gewebe mit OCT auf dem Probenhalter. Achten Sie darauf, genügend OCT zu verwenden, um die Basis des OCT-Blocks abzudecken, und montieren Sie den Block so flach wie möglich.Legen Sie eine saubere Klinge auf die Bühne und verriegeln Sie sie. Positionieren Sie den Kopf der Probe nach Bedarf auf dem Tisch, um den gewünschten Schnittwinkel zu erreichen. Beginnen Sie dann mit dem Schneiden in dicken Abschnitten, bis der interessierende Bereich gefunden ist.Bürsten Sie die zusätzlichen Teile ständig mit einem vorgekühlten Künstlerpinsel ab, um die Bühne sauber zu halten. Stellen Sie die Kammertemperatur nach Bedarf leicht ein und ändern Sie die Dicke der Abschnitte auf 10 bis 12 Mikrometer, sobald der gewünschte Bereich erreicht ist. Sammeln Sie sorgfältig den gewünschten Abschnitt.Nehmen Sie einen ITO-Schieber bei Raumtemperatur und positionieren Sie ihn über dem Abschnitt. Nähern Sie sich dem Abschnitt vorsichtig und kleben Sie ihn auf den Objektträger, ohne Spuren auf der Kryostatstufe zu hinterlassen. Legen Sie den Objektträger in ein Gestell oder wischen Sie im Labor außerhalb des Kryostaten zwischen den Sammlungen mehrerer Abschnitte.Wenn ein Vergleich zwischen verschiedenen Proben derselben Kohorte gewünscht wird, platzieren Sie die Abschnitte aus mehreren Proben auf einem einzigen Objektträger, damit sie gleichzeitig analysiert werden können, um die Streuung zu minimieren. Bei Bedarf auf zwei Dias trennen, da der Maldi-Zielhalter zwei Dias in einem Durchlauf aufnehmen kann. Transportieren Sie die Objektträger in einer Vakuumbox zu einer Austrocknung mit Austrocknung als unterster Schicht.Fahren Sie die Objektträger 30 bis 60 Minuten lang unter Vakuum und fahren Sie dann mit der Matrixabscheidung fort. Verwenden Sie zwei Fünf-Dihydroxybenzoesäure oder DHB in Methanolwasser als Matrix. Legen Sie die Dias in einen Objektträgertransporter und verschließen Sie die Öffnung sicher mit der Wachsfolie.Mit dem Reißverschlussbeutel verschließen. Legen Sie es in einen anderen Reißverschlussbeutel mit Trockenmittel. Beschriften Sie die Außenseite und senden Sie die Probe mit ausreichend trockenen Augen an die Maldi-Kernanlagen.Verwenden Sie für die Matrixabscheidung 40 Milligramm pro Milliliter DHB und Methanolwasser als Matrix und sprühen Sie es mit einem automatischen HTX M5 Matrixsprühgerät. Verwenden Sie Stickstoffgasdruck von 10 PSI. Verwenden Sie eine Maldi-Flugzeit, ein MS-Instrument und einen positiven Ionenmodus, um ein Massenspektrum zu erfassen.Kalibrieren Sie das Gerät, indem Sie 0,5 Mikroliter rote Phosphoremulsion in Aceto Nitro auf die ITO-Objektträger aufdecken. Verwenden Sie seine Spektren, um das Gerät im Massenbereich von 100 bis 1000 MZ zu kalibrieren, indem Sie eine quadratische Kalibrierkurve anwenden. Stellen Sie die Laserspotdurchmesser auf mittel ein, da es sich um das modulierte Strahlprofil für eine Rasterbreite von 40 Mikrometern handelt, und sammeln Sie Bilddaten, indem Sie 500 Aufnahmen mit einer Laserwiederholrate von 1000 Hertz pro Array-Position summieren.Dann zeichnen Sie die Spektraldaten auf. Führen Sie die Bilddatenanalyse unter Verwendung der quadratischen Normalisierung durch, um Ionenbilder mit einer Bandbreite von plus minus 0,10 Dalton zu erzeugen. Richten Sie die Spektren des OCT und des Hirngewebes aus demselben Experiment mit der Software aus, um die überlappenden Peaks in der Ionenunterdrückungsinterferenz des OCT zu bewerten.Schließlich verarbeiten Sie die MALDI-Objektträger mit den Gewebeproben durch Hämatoxylin und Eosin oder H- und E-Färbung. Bilder aus der Maldi-MS-Analyse zeigten eine allgemeine Abnahme des Lipidgehalts im LPR1-Knockout-mutierten Gehirn. Die repräsentativen H- und E-gefärbten adulten Fliegenhirnschnitte sind hier dargestellt.Die Lipidspezies, ihre jeweiligen MZ-Werte und die Maßstäbe der Heatmap sind ebenfalls in diesem Bild dargestellt. Die durchschnittliche Falte der Reduktion der LPR1-Knockout-Mutante im Vergleich zu den Kontrollen von mindestens vier biologischen Replikaten wird als Zahlen neben den Pfeilen angezeigt. Das Massenspektrum der ausgewählten leeren OCT-Region in der Hirngeweberegion sowohl von der Kontroll- als auch von der mutierten Fliege wird im Bereich von MZ1 bis 1000 und MZ520 bis 900 gezeigt.Die Interferenz der OCT ist sowohl mit Ionenunterdrückungsphänomenen als auch mit überlappenden Signalproblemen verbunden. Um die Genauigkeit der Lipidomik-Daten zu erhalten, sind eine geeignete Probenvorbereitung, Dissektion und Kryosektion von entscheidender Bedeutung. Nach Durchführung des Maldi-Experiments können die Identitäten der Lipide durch LCMS, auch bekannt als Flüssigkeitschromatographie, Massenspektrometrie-basierte Lipodomics, überprüft werden.Diese Technik gewinnt molekulare Einblicke in die Homöostase von Gehirnlipiden, indem sie das leistungsstarke bis weiche Modellsystem verwendet, das den Weg zum Verständnis menschlicher krankheitsbedingter metabolischer Veränderungen im Gehirn ebnet.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

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Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung (Video) | JoVE Journal

Probenvorbereitung für die schnelle Lipidanalyse im Drosophila-Gehirn mittels matrixgestützter Laserdesorption/Ionisations-Massenspektrometrie-Bildgebung

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