Name: Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 59 s
Description: Erfahren Sie die Präparation präzisionsgeschnittener Lungenscheiben aus Mäusen zur Untersuchung der glatten Muskulaturkontraktion. Diese ex vivo Methode bewahrt das in vivo Phänotyp für pulmonale Forschung.

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Diese Arbeit wird durch NIH-Zuschüsse, K08135443 (Y.B), 1R01HL132991 (X.A) unterstützt.

Die gesamte Tierpflege erfolgte in Übereinstimmung mit den Richtlinien des Institutional Animal Care and Use Committee des Massachusetts General Hospital. Wildtyp C57/B6 männliche Mäuse, 8 Wochen alt, wurden für die vorliegende Studie verwendet.
1. Versuchsvorbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die funktionierende Lösung vor.<ol>
<li>Bereiten Sie 1x Hank's Balanced Salt Solution (HBSS, mit Ca 2+ und Mg 2+ und pH ausgewogen mit20 mM HEPES, siehe Materialtabelle) vor. Verwenden Sie die HBSS-Lösung, um das PCLS vorzubereiten und zu verarbeiten. Halten Sie die HBSS-Lösung bei der Herstellung von PCLS kalt auf Eis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bereiten Sie das Kulturmedium von PCLS vor, indem Sie Dulbeccos modifiziertes Adlermedium und F-12 (DMEM-F12) mit einem antibiotisch-antimykotischen Mittel (Volumenverhältnis 1:100, siehe Materialtabelle) ergänzen.</li>
	<li>Bereiten Sie 1,5% Agarose und 6% ige Gelatinelösung vor.<ol>
<li>Agarose oder Gelatinepulver mit niedrigem Schmelzpunkt (LMP) (siehe Materialtabelle) mit HBSS-Lösung separat in 15 ml sterilen Zentrifugenröhrchen (oder 50 ml Röhrchen bei Lösungsvolumen >10 ml) zu Endkonzentrationen mischen. HINWEIS: Gesamtvolumen der Agaroselösung = 5 ml/Maus x Anzahl der Mäuse; Gelatinelösung = 2 ml/Maus x Anzahl der Mäuse.</li>
		<li>Erhitzen Sie die Lösungsrohre in kochendem Wasser, bis sich das Pulver vollständig auflöst. Bewahren Sie sowohl Agarose- als auch Gelatinelösungen in einem 42 °C warmen Wasserbad auf. HINWEIS: Eine Heizlampe am Seziertisch kann nützlich sein, um die Betriebsumgebung warm zu halten und zu verhindern, dass sich Agaroselösung verfestigt, bevor sie in die Mauslunge injiziert wird.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tauchen Sie alle Sezierwerkzeuge, einschließlich einer Sezierschere, zwei Paare gekrümmter Mikrosezierungszange und eines Paares hämostatischer Pinzetten für mindestens 20 Minuten zur Sterilisation in 70% ige Ethanollösung.</li>
	<li>Halten Sie ein Vibratom bereit (siehe Materialtabelle), um das Lungengewebe in dünne Scheiben zu schneiden.</li>
	<li>Bewahren Sie ein invertiertes Phasenkontrastmikroskop mit einer CCD-Kamera auf, um die Atemwegs- oder Gefäßkontraktionsreaktionen zu bewerten, und ein speziell angefertigtes konfokales Laserscanning-Mikroskop (siehe Materialtabelle), um die Ca2 + -Signalgebung in pulmonalen SMCs18 zu beurteilen.</li>
</ol>2. Aufblasen von Mauslungen mit Agarose und Gelatinelösung
<ol><li>Euthanasieren Sie die Maus.<ol>
<li>Legen Sie die Maus in eine Kunststoffkammer (ca. 750 cm3) mit 5% Isofluran. Halten Sie die Maus in der Kammer, bis sie mindestens 1 min aufhört zu atmen. HINWEIS: Andere primäre Euthanasiemethoden, wie die intraperitoneale Injektion von Ketamin (240 mg/Kg) und Xylazin (32 mg/Kg)19 oder Pentobarbital (0,3 ml)20, können als Alternativen zu inhalativem Isofluran angewendet werden.</li>
		<li>Legen Sie den Mauskörper auf ein Sezierbrett in Rückenlage. Fixieren Sie den Körper in Position, indem Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25 G Spritzennadeln festnageln und den Körper mit 70% Ethanolspray desinfizieren.</li>
		<li>Schneiden Sie den Bauch der Maus mit einer chirurgischen Schere auf (Schnitt, ~2 cm lang x 2 cm breit). Schneiden Sie dann die Bauchaorta ab, um das Blutvolumen zu erschöpfen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Blasen Sie die Lungenlappen mit den folgenden Schritten auf.<ol>
<li>Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell und beobachten Sie, wie die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet.</li>
		<li>Entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen. Vermeiden Sie Lungenschäden, indem Sie die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe wegrichten.</li>
		<li>Verwenden Sie eine Pinzette, um den Thymus und das Weichgewebe im Maushals zu trennen, um die Luftröhre freizulegen.</li>
		<li>Schneiden Sie ein kleines Loch (1,2 mm Durchmesser) in das obere Ende der Luftröhre, das den Durchgang der Spitze eines 20 G Y-förmigen IV-Katheters ermöglicht (siehe Materialtabelle).</li>
		<li>Verbinden Sie einen Adapteranschluss des Y-förmigen Katheters mit einer 3-ml-Spritze, die mit 0,5 ml Luft vorgefüllt ist, und den anderen Anschluss mit einer 3-ml-Spritze, die mit 2 ml warmer 1,5%iger Agaroselösung (42 °C) vorgefüllt ist.</li>
		<li>Injizieren Sie Agaroselösung, um den Katheter zu füllen, und drücken Sie dann den Katheter durch die vorgeschnittene Öffnung in die Luftröhre für 5-8 mm Länge.</li>
		<li>Injizieren Sie die Agaroselösung langsam bei etwa 1 ml/5 s. Die Lunge dehnt sich entlang der proximalen zu distalen Achse aus. Stoppen Sie die Injektion, wenn der Rand jedes Lungenlappens aufgeblasen ist. HINWEIS: Überpumpen Sie die Lunge nicht, da dies zu einem Bruch führen könnte. Das Volumen der Agaroselösung, um die gesamte Lunge einer jungen erwachsenen Maus aufzublasen, beträgt etwa 1,3 ± 0,1 ml.</li>
		<li>Injizieren Sie 0,2-0,3 ml Luft aus der anderen Spritze, um die Restagarose im Katheter und in den leitenden Atemwegen in den distalen Alveolenraum zu drücken.</li>
		<li>Schließen Sie die Luftröhre mit einer gekrümmten hämostatischen Pinzette (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Füllen Sie das Lungengefäßsystem aus.<ol>
<li>Füllen Sie eine 1 ml Spritze mit warmer 6% Gelatine. Schließen Sie sich an einen Nadel-Kopfhautvenenkatheter an, füllen Sie den Katheter mit Gelatinelösung und punktieren Sie dann den rechten Ventrikel in der Nähe der unteren Wand mit der Nadel.</li>
		<li>Drücken Sie die Nadel für 2-3 mm Länge in den rechten Ventrikel und richten Sie die Nadelspitze auf die Hauptlungenarterie.</li>
		<li>Injizieren Sie 0,2 ml Gelatinelösung langsam in den rechten Ventrikel und die pulmonalen arteriellen Gefäße. HINWEIS: Die Lungenlappen erscheinen bei entsprechender Gelatineinflation etwas blasser.</li>
		<li>Halten Sie die Nadel nach der Injektion 5 Minuten an Ort und Stelle, kühlen Sie die Lungenlappen, indem Sie eiskalte HBSS-Lösung auf Herz und Lunge gießen, und legen Sie dann den Körper mit dem Sezierbrett für insgesamt 10 Minuten in einen 4 ° C-Kühlschrank oder auf Eis.</li>
		<li>Entfernen Sie die Mauslunge und das Herz mit einer Schere aus dem umgebenden Bindegewebe. Trennen Sie dann jeden Lungenlappen und bewahren Sie ihn in HBSS-Lösung auf Eis auf.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Schneiden von Lungenlappen in dünne Scheiben
<ol><li>Schneiden und befestigen Sie den Lungenlappen an der Oberseite der Probensäule mit Sekundenkleber und richten Sie den Lappen aus (Abbildung 1A, B), damit die Schnittrichtung senkrecht zu den meisten Atemwegen von der Hila bis zur Lungenoberfläche steht.</li>
	<li>Verwenden Sie ein Vibratom mit einer frischen, dünnen Rasierklinge, um den Lungenlappen in 150 μm-Scheiben zu schneiden. Sammeln Sie die Scheiben in 100 mm sterilen Petrischalen vorgefüllt mit kalter HBSS-Lösung. HINWEIS: Stellen Sie die entsprechende Blattbewegungsgeschwindigkeit und Schwingungsfrequenz ein, bevor Sie mit dem Schneiden beginnen. Eine typische Einstellung für einen Compresstom ist Speed Level 4 und Oscillation Level 4.</li>
	<li>Die mit DMEM/F-12-Kulturmedium gefüllten Petrischalen (20 Scheiben/15 ml Medium/Schale) in Petrischalen überführen und vor den Experimenten über Nacht in einem 37 °C Inkubator aufbewahren. HINWEIS: Maus-PCLS können etwa 7 Tage lang in Kultur gehalten werden, ohne die kontraktilen Reaktionen der Atemwege zu verlieren17. Die Langlebigkeit der Lungenarterien wurde nicht gründlich untersucht. Nach unserer Beobachtung behalten sie ihre intakte Struktur und Vasoreaktion für mindestens 3 Tage in DMEM/F12-Medium. Zur Langzeitlagerung können Maus-PCLS in Kryoviale gegeben werden, die mit DMEM/F12-Medium gefüllt sind, das 10% DMSO enthält (5 Scheiben in 1 ml Medium pro Durchstechflasche), in einem mit Isopropylalkohol gefüllten Behälter bei -80 °C über Nacht eingefroren und in flüssigem Stickstoff für Wochen bis Monate21 kryokonserviert werden.</li>
</ol>4. Analyse kontraktiler Reaktionen von intrapulmonalen Atemwegen und Arterien
<ol><li>Legen Sie PCLS in eine HBSS-gefüllte 24-Well-Kulturplatte, eine in jedem Well. Suchen Sie das PCLS in der Mitte des Bohrlochs und entfernen Sie dann die HBSS-Lösung mit einer Pipette.</li>
	<li>Suchen Sie die Zielatemwege und das Gefäß in der Scheibe unter dem Mikroskop und bedecken Sie die Scheibe dann mit einem Nylonnetz mit einem vorgeschnittenen zentralen Loch (2-3 mm Durchmesser), um den Zielbereich freizulegen.</li>
	<li>Legen Sie eine hohle Metallscheibe auf das Netz, um die Scheiben an Ort und Stelle zu halten (Abbildung 2A).</li>
	<li>Fügen Sie 600 μL HBSS-Lösung hinzu, um das PCLS zu untertauchen. Ruhen Sie den Schnitt für 10 Minuten aus und zeichnen Sie dann die Basisbilder von Atemwegen oder Schiffen auf.</li>
	<li>Induzieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßkontraktion, indem Sie die leere HBSS-Lösung vorsichtig mit einer Pipette absaugen und 600 μL HBSS mit einem Agonisten hinzufügen, wie z. B. 1 μM Methacholin (MCh) oder 10 nM Endothelin (siehe Materialtabelle). HINWEIS: Eine KCl-Stimulation als Werkzeugstandard ist vor der Methacholin- oder Endothelin-Exposition nicht erforderlich. 100 mM KCl-Stimulation in den Atemwegen der Maus induzieren nur eine kleine und unregelmäßige Atemwegskontraktion (10%-15%)20. Ebenso ist eine Priming-Methacholin-Stimulation nicht erforderlich, da wir bestätigt haben, dass derselbe Agonist, zum Beispiel Methacholin oder Serotonin, bei der ersten und wiederholten Exposition eine ähnliche Atemwegskontraktion auslöst20,22.</li>
	<li>Beobachten Sie die Reaktion unter dem Mikroskop, bis die Luminalbereichsänderung einen Gleichgewichtsstatus erreicht, und zeichnen Sie dann die Atemwegs- oder Gefäßbilder zur Analyse auf.</li>
	<li>Entfernen Sie MCh- oder Endothelinlösung mit einer Pipette und fügen Sie eine neue 600-μL-HBSS-Lösung mit der gleichen Agonistenkonzentration und einem Relaxans hinzu; Beobachten und erfassen Sie die Atemwegs- oder Gefäßentspannung.</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Atemwegs- oder Gefäßreaktion mit den folgenden Schritten.<ol>
<li>Laden Sie die Bilder in die von NIH gesponserte kostenlose Software FIJI.</li>
		<li>Wählen Sie in der Symbolleiste die Polygonauswahl aus, um die Atemwege oder das Gefäßlumen auf jedem Rahmen zu umreißen.</li>
		<li>Wählen Sie Analysieren > Messen > Bereich festlegen.</li>
		<li>Wählen Sie Analyze > Measure aus, um den Interessenbereich zu quantifizieren. Die Ergebnisse werden in einem separaten Fenster zur statistischen Analyse angezeigt.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. Analyse der Ca2+ Signalgebung von Atemwegs- oder Gefäß-SMCs
<ol><li>Bereiten Sie den Farbstoffladepuffer Ca2+ vor.<ol>
<li>Lösen Sie Ca2+ Farbstoff, Oregon Green 488 BAPTA-1-AM (siehe Materialtabelle), 50 μg (eine Durchstechflasche) mit 10 μL DMSO auf.</li>
		<li>0,2 g Pluronic F-12-Pulver (siehe Materialtabelle) in 1 ml DMSO auflösen, um eine 20%ige Plunonic-Lösung zu erzeugen.</li>
		<li>Mischen Sie 10 μL 20%ige Plunonic-Lösung mit 10 μL Ca2+ Farbstoff-DMSO-Lösung.</li>
		<li>Machen Sie Ca 2+ Farbstoffbelastungspuffer, indem Sie 20 μL der Mischung zu 2 ml HBSS-Lösung mit200 μM Sulfobromphthalein hinzufügen (siehe Materialtabelle).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie 15 Maus-PCLS in 2 ml Ca2+ Ladepuffer und inkubieren Sie bei 30 °C für 1 h. Dann bewegen Sie die Scheiben auf 2 ml HBSS-Lösung mit 100 μM Sulfobromphthalein für weitere 30 min für die Entesterung von Fluoreszenzfarbstoffen bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Erkennen Sie Ca2+ Signalisierung von SMCs.<ol>
<li>Legen Sie Ca2+ farbstoffbeladene Scheiben auf ein großes Deckglas.</li>
		<li>Füllen Sie eine 3-ml-Spritze mit Hochvakuum-Silikonfett. Drücken Sie das Fett durch eine abgestumpfte Nadel mit 18 G, um zwei parallele Linien über das Deckglas über und unter der Scheibe zu ziehen.</li>
		<li>Decken Sie die Scheibe mit einem Nylonnetz zwischen zwei Fettlinien ab. Legen Sie das zweite Deckglas auf das Netz, um eine an den Seiten fettversiegelte Kammer zu erzeugen (Abbildung 3A). HINWEIS: Das Nylonnetz ist wichtig, um die Scheibe am unteren Deckglas befestigt zu halten und somit innerhalb des Arbeitsabstands eines invertierten Objektivs hoher Größe, wie z. B. 40-faches Öl, zu bleiben.</li>
		<li>Fügen Sie HBSS- oder Agonistenlösung von einem Ende in die Kammer hinzu, indem Sie manuell oder über ein Perfusionssystem pipettieren. Entfernen Sie die Flüssigkeit aus der Kammer, indem Sie vom anderen Ende mit Seidenpapier oder Vakuum im Falle einer kontinuierlichen Flüssigkeitsperfusion absaugen.</li>
		<li>Stellen Sie die PCLS-Kammer auf den Mikroskoptisch. Detektieren Sie die Ca 2+ Signalisierung von SMC23 mit einem speziell entwickelten resonanten scannenden konfokalen Mikroskop mit einer Laserabtastrate von 15 oder 30 Bildern/s. HINWEIS: Alternativ kann ein kommerzielles Hochgeschwindigkeits-Laserscanning-Konfokalmikroskop, das derzeit weit verbreitet ist, im Ca2+ Signalisierungsassay von pulmonalen SMCs in PCLS angewendet werden.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Quantifizieren Sie die Ca2+ Fluoreszenz in SMCs.<ol>
<li>Laden Sie die aufgezeichnete Bildsequenz auf FIJI und wählen Sie das Bild > Typ > 8-Bit-Graustufen.</li>
		<li>Wählen Sie in der Symbolleiste die Rechteckauswahl aus und definieren Sie einen 5 Pixel x 5 Pixel großen Bereich von Interesse (ROI) in einer glatten Muskelzelle.</li>
		<li>Wählen Sie Analysieren > Messungen einstellen > Mittleren Grauwert , der die Fluoreszenzintensität von Ca2+ darstellt.</li>
		<li>Wenn sich die Position eines ROI mit der SMC-Kontraktion ändert, wählen Sie Analysieren > Messen Sie die Ca2+ Fluoreszenzintensität Bild für Bild.</li>
		<li>Wenn der ROI von SMC in einem Stapel von Bildern in einer ähnlichen Position bleibt, wählen Sie Bild > Stapel > Messen Sie den Stapel der Fluoreszenzintensität von Ca2+ . HINWEIS: Ein benutzerdefiniertes Makro kann angeschlossen werden, um den ROI innerhalb des SMC zu verfolgen, wenn es sich mit Kontraktion in einem Bildstapel bewegt und automatisch die Ca2+ Intensität (Grauwert) des ROI Bild für Bild misst.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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<li>Sanderson, M. J., Bai, Y., Perez-Zoghbi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ca%282%2B%29+oscillations+regulate+contraction+of+intrapulmonary+smooth+muscle+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Ca(2+) oscillations regulate contraction of intrapulmonary smooth muscle cells.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 661, 77-96 (2010).</li>
<li>Perez-Zoghbi, J. F., Bai, Y., Sanderson, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+induces+airway+smooth+muscle+cell+relaxation+by+decreasing+the+frequency+of+agonist-induced+Ca2%2B+oscillations%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide induces airway smooth muscle cell relaxation by decreasing the frequency of agonist-induced Ca2+ oscillations.</a> The Journal of General Physiology. 135 (3), 247-259 (2010).</li>
<li>Lam, M., Lamanna, E., Bourke, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+airway+smooth+muscle+contraction+in+health+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Advances+in+Experimental+Medicine+and+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of airway smooth muscle contraction in health and disease.</a> Advances in Experimental Medicine and Biology. 1124, 381-422 (2019).</li>
<li>Patel, K. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+acetylcholine+receptor+M3+prevents+the+progression+of+airway+hyperreactivity+in+a+mouse+model+of+childhood+asthma%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Targeting acetylcholine receptor M3 prevents the progression of airway hyperreactivity in a mouse model of childhood asthma.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 31 (10), 4335-4346 (2017).</li>
<li>Aven, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NT4%2FTrkB-dependent+increase+in+innervation+links+early-life+allergen+exposure+to+persistent+airway+hyperreactivity%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+Journal%3A+Official+Publication+of+the+Federation+of+American+Societies+for+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">An NT4/TrkB-dependent increase in innervation links early-life allergen exposure to persistent airway hyperreactivity.</a> FASEB Journal: Official Publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 28 (2), 897-907 (2014).</li>
<li>Liu, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+precision+cut+lung+slices+as+a+translational+model+for+the+study+of+lung+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Respiratory+Research%22%5BJournal%5D)">Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology.</a> Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).</li>
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<li>Khan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+multiomic+and+quantitative+label-free+microscopy-based+approach+to+study+pro-fibrotic+signalling+in+ex+vivo+human+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+European+Respiratory+Journal%22%5BJournal%5D)">An integrated multiomic and quantitative label-free microscopy-based approach to study pro-fibrotic signalling in ex vivo human precision-cut lung slices.</a> The European Respiratory Journal. 58 (1), (2021).</li>
<li>Kennedy, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+rhinovirus+39+infection+on+airway+hyperresponsiveness+to+carbachol+in+human+airways+precision+cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Effects of rhinovirus 39 infection on airway hyperresponsiveness to carbachol in human airways precision cut lung slices.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 141 (5), 1887-1890 (2018).</li>
<li>Bai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryopreserved+Human+precision-cut+lung+slices+as+a+bioassay+for+live+tissue+banking.+a+viability+study+of+bronchodilation+with+bitter-taste+receptor+agonists%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cryopreserved Human precision-cut lung slices as a bioassay for live tissue banking. a viability study of bronchodilation with bitter-taste receptor agonists.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (5), 656-663 (2016).</li>
<li>Mondoñedo, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+system+for+cyclic+stretching+of+precision-cut+lung+slices+during+acute+cigarette+smoke+extract+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Physiology%22%5BJournal%5D)">A high-throughput system for cyclic stretching of precision-cut lung slices during acute cigarette smoke extract exposure.</a> Frontiers in Physiology. 11, 566(2020).</li>
<li>Davidovich, N., Huang, J., Margulies, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reproducible+uniform+equibiaxial+stretch+of+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Reproducible uniform equibiaxial stretch of precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 304 (4), 210-220 (2013).</li>
<li>Ram-Mohan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+traction+microscopy+to+quantify+muscle+contraction+within+precision-cut+lung+slices%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Lung+Cellular+and+Molecular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Tissue traction microscopy to quantify muscle contraction within precision-cut lung slices.</a> American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology. 318 (2), 323-330 (2020).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Die Vorbereitung von PCLS umfasst mehrere kritische Schritte. Erstens ist es wichtig, den Lungenlappen homogen aufzublasen, um die Variation der Gewebesteifigkeit durch ungleichmäßige Agaroseverteilung zu vermeiden. Da die flüssige Agarose bei einer Temperatur unter 37 °C schnell in dünnen Kathetern oder Atemwegen geliert, könnte der daraus resultierende Fülldefekt im distalen Lungenfeld die Disparität der Lungengewebesteifigkeit erhöhen und Geweberisse während des Vibratomabschnitts verursachen. Daher kann geübt werden,...

Die glatte Muskelzelle (SMC) ist ein wichtiger struktureller Zelltyp in der Lunge, der sich hauptsächlich in der Medienwand der Atemwege und Lungengefäße befindet. SMCs ziehen sich zusammen, um das luminale Kaliber zu verändern und so den Luft- und Blutfluss zu regulieren 1,2. Daher ist die kontraktile Regulierung von SMCs unerlässlich, um die Homöostase der Luftbelüftung und der Lungenzirkulation aufrechtzuerhalten. Im Gegensatz dazu provoziert die aberrante SMC-Kontraktilität obstruktive Atemwegs- oder pulmonale Gefäßerkrankungen wie Asthma und pulmonale arterielle Hypertonie. Die funktionelle Beurteilung von Lungen-SMCs wurde jedoch durch den begrenzten Zugang zum Lungengewebe in Frage gestellt, insbesondere zu den kleinen Atemwegen und Mikrogefäßen im distalen Teil der Lunge 2,3. Aktuelle Lösungen greifen auf indirekte Assays zurück, wie z.B. die Messung des Luftstromwiderstands durch Flexivent, um die Verengung der Atemwege zu reflektieren, und die Überprüfung des pulmonalen arteriellen Blutdrucks durch Rechtsherzkatheterisierung zur Beurteilung der pulmonalen Vasokontraktion 4,5. Diese indirekten Assays haben jedoch mehrere Nachteile, wie z.B. strukturelle Faktoren zu verwirren, die räumliche Vielfalt der Atemwegs- oder Gefäßreaktionen in der gesamten Lungenskala nicht zu erfassen 6,7 und sind für die mechanistische Untersuchung der kontraktilen Regulation auf zellulärer Ebene ungeeignet. Daher wurden alternative Ansätze mit isolierten Primärzellen, Luftröhren-/Bronchi-Muskelstreifen 8,9 oder großen Gefäßsegmenten10 für die SMC-Studie in vitro angewendet. Dennoch haben diese Methoden auch Grenzen. Zum Beispiel macht es eine schnelle phänotypische Anpassung primärer SMCs im Kulturzustand11,12 problematisch, Befunde aus der Zellkultur auf In-vivo-Einstellungen zu extrapolieren. Darüber hinaus kann der kontraktile Phänotyp von SMCs in den isolierten proximalen Atemwegs- oder Gefäßsegmenten nicht die SMCs in der distalen Lungedarstellen 6,7. Darüber hinaus bleibt die Muskelkraftmessung auf Gewebeebene von molekularen und zellulären Ereignissen getrennt, die für den mechanistischen Einblick in die kontraktile Regulation unerlässlich sind.
Precision-cut lung slice (PCLS), ein lebender Lungengewebeabschnitt, bietet ein ideales Ex-vivo-Werkzeug zur Charakterisierung pulmonaler SMCs in einer nahezu in vivo Mikroumgebung (d. h. erhaltene multizelluläre Architektur und Interaktion)13. Seit Dr. Placke und Dr. Fisher in den 1980er Jahren erstmals die Herstellung von Lungenscheiben aus mit Agarose aufgeblasenen Ratten- und Hamsterlungen eingeführt haben14,15, wurde diese Technik kontinuierlich weiterentwickelt, um PCLS eine höhere Qualität und größere Vielseitigkeit für die biomedizinische Forschung zu bieten. Eine signifikante Verbesserung ist die Verbesserung der pulmonalen arteriellen Erhaltung durch Gelatineinfusion zusätzlich zur Lungeninflation mit Agarose über die Luftröhre. Infolgedessen werden sowohl die Atemwege als auch die Lungenarterien im PCLS für die Ex-vivo-Beurteilung intakt gehalten 16. Darüber hinaus ist das PCLS für eine längere Zeit in der Kultur lebensfähig. Zum Beispiel hatten Maus-PCLS für mindestens 12 Tage in Kultur keine signifikante Veränderung der Zelllebensfähigkeit und des Metabolismus, und sie behielten die Kontraktilität der Atemwege für bis zu 7 Tagebei 17. Darüber hinaus hält PCLS unterschiedlich große Atemwege oder Gefäße für Kontraktions- und Entspannungsassays. Darüber hinaus kann die intrazelluläre Ca 2 + -Signalgebung von SMCs, dem Determinantenfaktor der Zellkontraktilität, mit Ca 2+ -Reporterfarbstoffen untersucht werden, die von einem konfokalen oder 2-Photonen-Mikroskop13 aufgenommen wurden.
Unter Berücksichtigung der umfangreichen Anwendung des Mausmodells in der Lungenforschung wird hier ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung von Maus-PCLS mit intakten Atemwegen und intrapulmonalen Arterien für die Ex-vivo-Lungenforschung beschrieben. Anhand der präparierten PCLS demonstrierten wir anschließend, wie die Reaktionen der Atemwege und der Lungenarterien auf konstriktive oder relaxante Reize bewertet werden können. Darüber hinaus wird auch das Verfahren beschrieben, das PCLS mit Ca 2 + -Reporterfarbstoff zu beladen und dann die Ca2 + -Signalgebung von SMCs in Verbindung mit kontraktilen oder relaxanten Reaktionen abzubilden.

<table><tbody><tr><td>1 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>15 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Celltreat</td><td>229411</td><td></td></tr><tr><td>3 mL Spritze</td><td>BD</td><td>309585</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile Zentrifugenröhrchen</td><td>Celltreat</td><td>229422</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl-beta-Methacholin</td><td>Millipore Sigma</td><td>62-51-1</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotisch-anitmykotisch</td><td>Thermo Fisher</td><td>15240-062</td><td></td></tr><tr><td>CCD-Kamera</td><td>Nikon</td><td>Nikon Ds-Ri2 Kamera</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-5CP; 12-548-5PP</td><td></td></tr><tr><td>Kryofläschchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td></td><td></td> nach Maß Details <td>in Referenz 18</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-10-092-CM</td><td></td></tr><tr><td>Endothelin 1</td><td>Millipore Sigma</td><td>E7764</td><td></td></tr><tr><td>Feine Präparierschere</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9702861</td><td></td></tr><tr><td>Gefrierbehälter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1562</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine aus Schweinehaut</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9000-70-8</td><td></td></tr><tr><td>Magerstrang-Salzlösung (HBSS)</td><td>Thermo Fisher</td><td></td><td></td>14025092</tr><tr><td>hämostatische Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-117</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Thermo Fisher</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>Silikonfett mit hohem Vakuumgehalt</td><td>Fisher Scientific</td><td>146355d</td><td></td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W292907-1KG-K</td><td></td></tr><tr><td>Metallscheiben</td><td>Home Depot Product Authority</td><td>800442</td><td>Everbilt Unterlegscheiben #10</td></tr><tr><td>Mikro-Präparierzange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4142</td><td></td></tr><tr><td>Nadel-Kopfhautvenen-Set (25 G)</td><td>EXELINT</td><td>26708</td><td></td></tr><tr><td>NOC-5</td><td>Cayman Chemical</td><td>16534</td><td></td></tr><tr><td>Nylon-Netz</td><td>Komponentenversorgung</td><td>U-CMN-300</td><td></td></tr><tr><td>Oregongrün 488 BAPTA-1 AM</td><td>Life Technologies</td><td>o-6807</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrast Mikroskop</td><td>Nikon</td><td>Nikon Eclipse TS 100</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Thermo Fisher</td><td>P-6867</td><td></td></tr><tr><td>Rasierklingen</td><td>Personna</td><td></td><td>Personna Double Edge Rasierklingen in Weiß Wrapper 100 Stück</td></tr><tr><td>Sulfobromophthalein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S0252</td><td></td></tr><tr><td>Sekundenkleber</td><td>Krazy Glue</td><td></td><td>Krazy Glue, Allzweck</td></tr><tr><td>Ultrapure niedrig Schmelzpunkt Agarose</td><td>Thermo Fisher 16520050</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Precisionary</td><td>VF 310-0Z</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Kühlblock</td><td>Precisionary</td><td>SKU-VM-CB12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome Probenröhrchen</td><td>Precisionary</td><td>SKU VF-SPS-VM-12.5-NC</td><td></td></tr><tr><td>Y-förmiger IV-Katheter</td><td>BD</td><td>383336</td><td>BD Saf-T-Intima geschlossener IV-Katheter</td></tr></tbody></table>

verwendung der präzisionsgeschnittenen lungenscheibe zur untersuchung der kontraktilen regulation der atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten muskulatur

Utilizing the Precision-Cut Lung Slice to Study the Contractile Regulation of Airway and Intrapulmonary Arterial Smooth Muscle

Glatte Muskelzellen (SMC) vermitteln die Kontraktion der Atemwege und der intrapulmonalen Arterie, um den Luftströmungswiderstand bzw. die Lungenzirkulation zu modifizieren, und spielen somit eine entscheidende Rolle in der Homöostase des Lungensystems. Die Deregulation der SMC-Kontraktilität trägt zu mehreren Lungenerkrankungen bei, einschließlich Asthma und pulmonaler Hypertonie. Aufgrund des begrenzten Gewebezugangs und des Mangels an Kultursystemen zur Aufrechterhaltung von In-vivo-SMC-Phänotypen bleiben molekulare Mechanismen, die der deregulierten SMC-Kontraktilität bei diesen Krankheiten zugrunde liegen, jedoch vollständig identifiziert. Die präzisionsgeschnittene Lungenscheibe (PCLS) bietet ein Ex-vivo-Modell , das diese technischen Schwierigkeiten umgeht. Als lebender, dünner Lungengewebeschnitt behält das PCLS SMC in natürlicher Umgebung und ermöglicht die In-situ-Verfolgung der SMC-Kontraktion und der intrazellulären Ca 2 + -Signalgebung, die dieSMC-Kontraktilität reguliert. Hier wird ein detailliertes PCLS-Vorbereitungsprotokoll für die Maus bereitgestellt, das intakte Atemwege und intrapulmonale Arterien bewahrt. Dieses Protokoll umfasst zwei wesentliche Schritte, bevor der Lungenlappen dem Schneiden unterzogen wird: Aufblasen der Atemwege mit Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt durch die Luftröhre und Auffüllen der Lungengefäße mit Gelatine durch den rechten Ventrikel. Das mit diesem Protokoll hergestellte PCLS kann für Bioassays verwendet werden, um die Ca2+-vermittelte kontraktile Regulation von SMC sowohl in den Atemwegen als auch in den intrapulmonalen arteriellen Kompartimenten zu bewerten. Bei der Anwendung auf Mausmodelle von Atemwegserkrankungen ermöglicht dieses Protokoll die funktionelle Untersuchung von SMC und gibt so Einblick in den zugrunde liegenden Mechanismus der SMC-Kontraktilitätsderegulierung bei Krankheiten.

Maus-PCLS-Präparat zur Erhaltung intakter intrapulmonaler Atemwege und Arterien Ein 150 μm dickes PCLS wurde unter dem invertierten Phasenkontrastmikroskop beobachtet. In der Mauslunge werden leitfähige Atemwege von intrapulmonalen Arterien begleitet, die vom Hilus bis zur peripheren Lunge verlaufen. Ein repräsentatives Lungen-Atemwegs-Arterie-Bündel in einem Maus-PCLS ist in Abbildung 2B dargestellt. Die Atemwege können leicht durch quaderförmige Epithelzellen identifizi...

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Vorbereitung und Verwendung von präzise geschnittenen Lungenschnitten der Maus zur Beurteilung der Kontraktilität der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur in einem nahezu in vivo Milieu.

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

Smooth muscle cells (SMC) mediate the contraction of the airway and the intrapulmonary artery to modify airflow resistance and pulmonary circulation, ...

Das PCLS unterstützt die Beurteilung der Aktivität der Atemwege und der glatten Gefäßmuskulatur in einer nahezu intakten Gewebeumgebung und liefert damit ein unschätzbares Ex-vivo-Modell für die Lungenforschung. In Bezug auf die glatte Muskelforschung erhalten die präzisionsgeschnittenen Lungenschnitte den In-vivo-Phänotyp der glatten Muskelzellen und ihre Interaktion mit umgebenden Strukturen und ermöglichen gleichzeitig den Zugang zu glatten Muskelzellen, was für eine mechanistische Untersuchung auf zellulärer Ebene wichtig ist. Platzieren Sie zunächst den Mauskörper auf einem Sezierbrett in Rückenlage.Stecken Sie den Schwanz, die Vorderpfoten und den Kopf mit 25G Spritzennadeln fest und desinfizieren Sie den Körper mit 70% Ethanol. Öffnen Sie die Brusthöhle vorsichtig entlang des Brustbeins und des bilateralen unteren Brustkorbs über dem Zwerchfell. Richten Sie dann die scharfe Scherenspitze vom Lungengewebe weg und entfernen Sie einen Teil der bilateralen ventralen Brustkäfige, um das Herz freizulegen.Beobachten Sie, dass die Lungenlappen kollabieren, wenn sich die Brusthöhle öffnet. Verwenden Sie eine Schere, um Weichgewebe im Maushals zu entfernen, um die Luftröhre freizulege

utilizing-precision-cut-lung-slice-to-study-contractile-regulation

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Hypoxische Lungenvasokonstriktion (HPV) ist ein wichtiges physiologisches Phänomen, durch das bei alveolarer Hypoxie-Lungenperfusion auf die Beatmung abgestimmt wird. Das wichtigste Gefäßsegment, das zu HPV beiträgt, ist die Intra-Acinar-Arterie. Hier beschreiben wir unser Protokoll zur Analyse von HPV von murinen Lungengefäßen mit Durchmessern von 20-100 m.

Videomorphometrische Analyse der hypoxischen Lungenvasokonstriktion der intrapulmonalen Arterien mit Murine Precision Cut Lung Slices

Wir beschreiben ein Verfahren zur Erzeugung von Precision-cut Lung Slices (PCLS) und immunostaining sie die Lokalisierung verschiedenen Immunzelltypen in der Lunge sichtbar zu machen. Unser Protokoll kann erweitert werden, um die Position und Funktion vieler verschiedenen Zelltypen unter einer Vielzahl von Bedingungen zu visualisieren.

Precision-cut Maus Lung Slices Live-Pulmonary Dendritische Zellen sichtbar zu machen

Hier wird ein Protokoll zur Erhaltung der vaskulären Kontraktilität von PCLS-murinem Lungengewebe vorgestellt, was zu einem anspruchsvollen dreidimensionalen Bild des Lungengefäßsystems und der Atemwege führt, das bis zu 10 Tage konserviert werden kann und für zahlreiche Verfahren anfällig ist.

Präzisionsschnitt-Lungenschnitte als effizientes Werkzeug für Ex-vivo-Studien zur Struktur und Kontraktilität von Lungengefäßen

Testen visuelle Empfindlichkeit in Echsen mit einem operante Konditionierung, die Video-Wiedergabe von random-dot kinematograms und computer-generierte Wirbellosen beschäftigt.

Testen visueller Sensibilität für die Geschwindigkeit und Richtung der Bewegung in Lizards

Computer-generierte Stimuli mit dem Jacky Drachen als Modell.

Computer-Generated-Tiermodell Stimuli

Focal Ca 2 + Transient-Erkennung in der glatten Muskulatur

Dieses Video zeigt und vergleicht zwei experimentellen Modellen zur Entwicklung von obliterative Atemwegserkrankung (OAD) bei Mäusen, die heterotopen und orthotopen Transplantation Tracheal-Modell zu studieren.

Heterotope und orthotopen Tracheal Transplantation in Mäuse als Modelle benutzt, um die Entwicklung von obliterans Airway Disease Study

Die Nabelschnur werden verwendet, um Zellen der glatten Muskulatur durch verschiedene Arten zu isolieren. In dieser Arbeit verwendet die enzymatische Behandlung zu isolierten glatten Muskelzellen.

Isolierung humaner Nabelschnur arteriellen glatten Muskelzellen (HUASMC)

Die Bemühungen um die katalytische Untereinheit der Telomerase zu isolieren, TERT, in ausreichenden Mengen für strukturelle Studien haben mit begrenztem Erfolg seit mehr als einem Jahrzehnt getroffen. Hier präsentieren wir Methoden zur Isolierung des rekombinanten Tribolium castaneum TERT...

In vitro Rekonstitution der Active T. castaneum Telomerase

Dieses Video zeigt die OP-Vorbereitung und Verfahren benötigt, um die kontraktilen Antworten der Ratte medialen Gastrocnemius Muskel-Präparat zu...

Verfahren für die Ratte<em&gt; In situ</em&gt; Skeletal Muscle kontraktilen Eigenschaften

Erfahren Sie die Präparation präzisionsgeschnittener Lungenscheiben aus Mäusen zur Untersuchung der glatten Muskulaturkontraktion. Diese ex vivo Methode bewahrt das in vivo Phänotyp für pulmonale Forschung.

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur (Video) | JoVE Journal

Verwendung der präzisionsgeschnittenen Lungenscheibe zur Untersuchung der kontraktilen Regulation der Atemwege und der intrapulmonalen arteriellen glatten Muskulatur

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