Name: Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Erfahren Sie die spontane Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden mit MAP65 und PEG. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur Mikrotubuli-Organisation und biologischen Systemen wie mitotischen Spindeln.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten allen Mitgliedern des Ross Lab im Sommer 2021, insbesondere K. Alice Lindsay, für ihre Hilfe danken. Diese Arbeit wurde durch einen Zuschuss von NSF BIO-2134215 unterstützt, der S. Sahu, N. Goodbee, HB Lee und J.L. Ross unterstützte. Ein Zuschuss der KECK Foundation (Rae Anderson, USD, Lead PI) unterstützte teilweise R. Branch und P. Chauhan

<ol><li>Bodakuntla, S., Jijumon, A. S., Villablanca, C., Gonzalez-Billault, C., Janke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+proteins%3A+structuring+the+cytoskeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated proteins: structuring the cytoskeleton.</a> Trends in Cell Biology. 29 (10), 804-819 (2019).</li>
<li>Severson, A. F., von Dassow, G., Bowerman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte+meiotic+spindle+assembly+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte meiotic spindle assembly and function.</a> Current Topics in Developmental Biology. 116, 65-98 (2016).</li>
<li>Brugués, J., Needleman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Physical+basis+of+spindle+self-organization%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Physical basis of spindle self-organization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (52), 18496-18500 (2014).</li>
<li>Brugués, J., Nuzzo, V., Mazur, E., Needleman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleation+and+transport+organize+microtubules+in+metaphase+spindles%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Nucleation and transport organize microtubules in metaphase spindles.</a> Cell. 149 (3), 554-564 (2012).</li>
<li>Gatlin, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+fusion+requires+dynein-mediated+sliding+of+oppositely+oriented+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Spindle fusion requires dynein-mediated sliding of oppositely oriented microtubules.</a> Current Biology. 19 (4), 287-296 (2009).</li>
<li>Goshima, G., Mayer, M., Zhang, N., Stuurman, N., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Augmin%3A+A+protein+complex+required+for+centrosome-independent+microtubule+generation+within+the+spindle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Augmin: A protein complex required for centrosome-independent microtubule generation within the spindle.</a> Journal of Cell Biology. 181 (3), 421-429 (2008).</li>
<li>Inoue, S., Sato, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+motility+by+labile+association+of+the+nature+of+mitotic+spindle+fibers+and+their+role+in+chromosome+movement+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+General+Physiology%22%5BJournal%5D)">Cell motility by labile association of the nature of mitotic spindle fibers and their role in chromosome movement molecules.</a> Journal of General Physiology. 50 (6), 259-292 (1967).</li>
<li>Allenspach, A. L., Roth, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variations+during+mitosis+in+the+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variations during mitosis in the chick embryo.</a> Journal of Cell Biology. 33 (1), 179-196 (1967).</li>
<li>Theg, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoplasmic+microtubules+in+different+animal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cytoplasmic microtubules in different animal cells.</a> Journal of Cell Biology. 23 (2), 265-275 (1964).</li>
<li>Mcdonald, K., Pickett-Heaps, J. D., Mcintosh, J. R., Tippit, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+mechanism+of+anaphase+spindle+elongation+in+Diatoma+vulgare%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">On the mechanism of anaphase spindle elongation in Diatoma vulgare.</a> Journal of Cell Biology. 9, 377-388 (1977).</li>
<li>Chaikin, P. M., Lubensky, T. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChaikin%2C+PM+%22Principles+of+Condensed+Matter+Physics%22">Principles of Condensed Matter Physics</a>. , Cambridge University Press. (1995).</li>
<li>Hamon, L., Savarin, P., Curmi, P. A., Pastré, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+and+collective+behavior+of+microtubule+bundles+in+the+presence+of+polyamines%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly and collective behavior of microtubule bundles in the presence of polyamines.</a> Biophysical Journal. 101 (1), 205(2011).</li>
<li>Needleman, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+assembly+of+microtubules+by+counterions%3A+From+hexagonal+bundles+to+living+necklaces%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Higher-order assembly of microtubules by counterions: From hexagonal bundles to living necklaces.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 101 (46), 16099-16103 (2004).</li>
<li>Ross, J. L., Fygenson, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mobility+of+taxol+in+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Mobility of taxol in microtubule bundles.</a> Biophysical Journal. 84, 3959-3967 (2003).</li>
<li>Sanchez, T., Welch, D., Nicastro, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cilia-like+beating+of+active+microtubule+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Cilia-like beating of active microtubule bundles.</a> Science. 333 (6041), 456-459 (2011).</li>
<li>Brandt, R., Lee, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+organization+of+microtubule-associated+protein+tau.+Identification+of+regions+which+affect+microtubule+growth%2C+nucleation%2C+and+bundle+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Functional organization of microtubule-associated protein tau. Identification of regions which affect microtubule growth, nucleation, and bundle formation in vitro.</a> Journal of Biological Chemistry. 268 (5), 3414-3419 (1993).</li>
<li>Hirokawa, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+and+dynamics+dependent+on+microtubule-associated+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization and dynamics dependent on microtubule-associated proteins.</a> Current Opinion in Cell Biology. 6 (1), 74-81 (1994).</li>
<li>Kanai, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+multiple+tau+isoforms+and+microtubule+bundle+formation+in+fibroblasts+transfected+with+a+single+tau+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Expression of multiple tau isoforms and microtubule bundle formation in fibroblasts transfected with a single tau cDNA.</a> The Journal of Cell Biology. 109 (3), 1173(1989).</li>
<li>MacRae, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+organization+by+cross-linking+and+bundling+proteins.+Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Structure+and+Molecular+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Microtubule organization by cross-linking and bundling proteins. Biochimica et Biophysica Acta (BBA).</a> Protein Structure and Molecular Enzymology. 1160 (2), 145-155 (1992).</li>
<li>She, Z. Y., Wei, Y. L., Lin, Y., Li, Y. L., Lu, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+the+Ase1%2FPRC1%2FMAP65+family+in+central+spindle+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of the Ase1/PRC1/MAP65 family in central spindle assembly.</a> Biological Reviews. 94 (6), 2033-2048 (2019).</li>
<li>Walczak, C. E., Shaw, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+MAP+for+Bundling+Microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A MAP for Bundling Microtubules.</a> Cell. 142 (3), 364-367 (2010).</li>
<li>Edozie, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+spindle-like+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Self-organization of spindle-like microtubule structures.</a> Soft Matter. 15 (24), 4797-4807 (2019).</li>
<li>Tulin, A., McClerklin, S., Huang, Y., Dixit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+the+microtubule+cross-linking+protein+MAP65-1+reveals+a+molecular+mechanism+for+contact-angle-dependent+microtubule+bundling%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of the microtubule cross-linking protein MAP65-1 reveals a molecular mechanism for contact-angle-dependent microtubule bundling.</a> Biophysical Journal. 102 (4), 802-809 (2012).</li>
<li>Chan, J., Jensen, C. G., Jensen, L. C. W., Bush, M., Lloyd, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+65-kDa+carrot+microtubule-associated+protein+forms+regularly+arranged+filamentous+cross-bridges+between+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The 65-kDa carrot microtubule-associated protein forms regularly arranged filamentous cross-bridges between microtubules.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (26), 14931-14936 (1999).</li>
<li>Scheff, D. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tuning+shape+and+internal+structure+of+protein+droplets+via+biopolymer+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Tuning shape and internal structure of protein droplets via biopolymer filaments.</a> Soft Matter. 16 (24), 5659-5668 (2020).</li>
<li>Weirich, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liquid+behavior+of+cross-linked+actin+bundles%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Liquid behavior of cross-linked actin bundles.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (9), 2131-2136 (2017).</li>
<li>Weirich, K. L., Dasbiswas, K., Witten, T. A., Vaikuntanathan, S., Gardel, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 166 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Sahu, S., Herbst, L., Quinn, R., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crowder+and+surface+effects+on+self-organization+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Crowder and surface effects on self-organization of microtubules.</a> Physical Review E. 103 (6), 062408(2021).</li>
<li>Stanhope, K. T., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubules%2C+MAPs%2C+and+motor+patterns%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Microtubules, MAPs, and motor patterns.</a> Methods in Cell Biology. 128, 23-38 (2015).</li>
<li>Early Middle Ages drop single.jpg. Wikimedia Commons. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg">https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Early_middle_ages_drop_spingle.jpg</a> (2022).</li>
<li>Lantzsch, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+reorganization+during+female+meiosis+in+c.+Elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microtubule reorganization during female meiosis in c. Elegans.</a> eLife. 10, 58903(2021).</li>
<li>Advani, S., Maresca, T. J., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+and+testing+of+a+new%2C+local+microtubule-disruption+tool+based+on+the+microtubule-severing+enzyme%2C+katanin+p60%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">Creation and testing of a new, local microtubule-disruption tool based on the microtubule-severing enzyme, katanin p60.</a> Cytoskeleton. 75 (12), 531-544 (2018).</li>
<li>Pecqueur, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designed+ankyrin+repeat+protein+selected+to+bind+to+tubulin+caps+the+microtubule+plus+end%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A designed ankyrin repeat protein selected to bind to tubulin caps the microtubule plus end.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (30), 12011-12016 (2012).</li>
<li>Valentine, M. T., Fordyce, P. M., Krzysiak, T. C., Gilbert, S. P., Block, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Individual+dimers+of+the+mitotic+kinesin+motor+Eg5+step+processively+and+support+substantial+loads+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Individual dimers of the mitotic kinesin motor Eg5 step processively and support substantial loads in vitro.</a> Nature Cell Biology. 8 (5), 470-476 (2006).</li>
<li>Wagenbach, M., Domnitz, S., Wordeman, L., Cooper, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+kinesin-13+mutant+catalytically+depolymerizes+microtubules+in+ADP%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A kinesin-13 mutant catalytically depolymerizes microtubules in ADP.</a> Journal of Cell Biology. 183 (4), 617-623 (2008).</li>
<li>McNally, F. J., Vale, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+katanin%2C+an+ATPase+that+severs+and+disassembles+stable+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of katanin, an ATPase that severs and disassembles stable microtubules.</a> Cell. 75 (3), 419-429 (1993).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Die hier beschriebenen Methoden wurden in mehreren Arbeiten zur Erzeugung von Mikrotubuli-Tactoiden verwendet (Abbildung 2)22,28. Diese Experimente sind biologisch relevant, um die Organisationsprinzipien aufzudecken, die die Form und Stabilität der mitotischen oder meiotischen Spindel in den meisten Zelltypen kontrollieren. Darüber hinaus sind Mikrotubuli Modell-Flüssigkristallmesogene, die helfen können, mehr darüber zu erfahren, wie Flüssigkristalle keimen und nematische Phasen aus isotropen Phasen wachsen lassen.
Das hier beschriebene Verfahren hat mehrere Vorteile für die Erforschung der Mikrotubuli-Selbstorganisation. Erstens ist es sehr reproduzierbar, da es im Labor von vielen Studenten, einschließlich Gymnasiasten, mit wenig Vorwissen oder Training durchgeführt wurde, bevor es im Labor begann. Die Taktoide sind doppelbrechend22, so dass sie zusätzlich zur Fluoreszenzmikroskopie im Durchlichtlicht betrachtet werden können, wodurch diese Methode vielen Labors zugänglich ist und dieses experimentelle Verfahren neben der High-End-Forschung auch für Bildungszwecke angepasst werden kann. Schließlich eröffnet dieser Prozess Wege, um biologische Systeme in einem reduzierten, reduktionistischen Ansatz weiter zu verstehen und zu untersuchen, so dass man verstehen kann, wie jede zusätzliche Bedingung, jedes Protein oder jeder Zusatzstoff die Selbstorganisation von Tactoiden und vielleicht letztendlich die Spindel verändern kann. Ziele für eine bessere Biomimikry sind Aktivität, Fließfähigkeit und Filamentpolaritätssortierung.
Es kann mehrere Faktoren geben, die das Experiment beeinflussen und unerwartete Ergebnisse liefern. Wenn sich beispielsweise die Tactoide nicht bilden (Abbildung 2), aber fächerartige Muster beobachtet werden, ist der MAP65 wahrscheinlich nicht vorhanden oder bindet nicht an die Mikrotubuli22,28. Dies sollte auch im MAP65-Fluoreszenzkanal offensichtlich sein, da der GFP-MAP65 nicht an die Mikrotubuli gebunden ist.
Wenn sich die Tactoide nicht bilden und der Hintergrund als Flecken auf dem Glas erscheint, könnte dies an der Oberflächenbeschichtung liegen. Einmal durchgeführt, dauert die Silanisierung nur 1 Monat auf Deckgläsern. Wenn es nachlässt, kann sich das Tubulin unspezifisch an die exponierte Oberfläche binden. Diese Bindung erfolgt in ungeraden Mustern.
Wenn sich die Tactoide nicht bilden und das Tubulin in Aggregaten verschiedener Formen und Größen beobachtet wird, könnte dies auf Tubulin von schlechter Qualität zurückzuführen sein. Tubulin kann zentrifugiert werden, um anfängliche Aggregate zu entfernen, die diese Off-Pathway-Aggregation anstelle der Mikrotubuli-Polymerisation antreiben können. Wenn die Oberfläche an das Tubulin bindet, kann sie auch das Tubulin in der Lösung abbauen. Niedrige Konzentrationen von Tubulin, unterhalb der kritischen Konzentration für die Polymerisation von Mikrotubuli, können zu Aggregaten führen.
Wenn der MAP65-Kanal in FRAP-Experimenten keine Erholung zeigt (Abbildung 5), ist es möglich, dass die Photobleiche die Mikrotubuli photoschädlich gemacht hat. Lichtschäden verursachen die lokalisierte Zerstörung der Filamente. Dies kann durch Untersuchung im Sendekanal überprüft werden. Mikrotubuli-Tactoide sind im übertragenen Kanal durch einen hohen Index der Brechungsfehlanpassung mit dem umgebenden Wasser sichtbar. Lichtinduzierte Lichtschäden treten als Brandmarke oder Kontrastverlust in der Durchlichtbildgebung am Ort des ROI auf, der einer Photobleiche unterzogen wird. Tritt dies ein, muss die Laser- oder Lichtleistung reduziert werden, um die Lichtschädigung der Proteine zu hemmen.
Bei diesem Verfahren und Ansatz gab es mehrere Herausforderungen. Ein Problem ist, dass die Längenmessungen derzeit von Hand durch Klicken auf das Bild durchgeführt werden. Diese Methode ist zwar unkompliziert, kann aber zu einer hohen Unsicherheit führen. Die Breitenmessung, die den Querschnitt und die Anpassung an einen Gaußschen Wert verwendet, ist eine bessere Methode zur Quantifizierung der Größe. Eine ähnliche Methode könnte für die Länge verwendet werden. Ein zweites Problem ist, dass sich die Tactoide, weil sie so lang und dünn sind, manchmal biegen können. Dies erschwert die Quantifizierung der Länge. Die Konturlänge kann mit einer segmentierten Linie quantifiziert werden, aber jedes Mal, wenn ein Segment hinzugefügt wird, kommt es zu einer zusätzlichen Unsicherheit.
Aus wissenschaftlicher Sicht hat dieser Ansatz einige andere Herausforderungen für seine Verwendung als Modell für Flüssigkristalle oder Spindeln. Die erste Herausforderung war die lange, dünne Form der Tactoide, die Mikrotubuli erzeugen (Abbildung 3 und Abbildung 4). Wie in früheren Veröffentlichungen22 erwähnt, sind Mikrotubuli-Tactoide homogene Tactoide, keine bipolaren. Dies bedeutet, dass die Mikrotubuli, aus denen die Form besteht, nicht neu ausgerichtet werden, um auf die Spitzen der Struktur zu zeigen. Stattdessen befinden sich alle Mikrotubuli parallel zur Längsachse und die "Pole" befinden sich im Unendlichen. Dies unterscheidet sich stark von den Tactoiden, die für molekulare Flüssigkristalle oder sogar für Aktin oder DNA beobachtet wurden, die auch als Flüssigkristallmesogene wirken können. In diesen anderen Systemen sind die Tactoiden bipolar und zeigen, wenn sie in gekreuzten Polarisatoren betrachtet werden, die verräterischen Anzeichen einer Neuorientierung der Stäbe.
Eine zweite große Herausforderung in diesem System besteht darin, dass die Mikrotubuli im Inneren des Tactoiden unbeweglich sind. Dies geht aus FRAP-Experimenten und -Analysen hervor, da die Rückgewinnung der Mikrotubuli sehr gering ist. Ihre feststoffartige Natur macht Mikrotubuli-Tactoide weniger wertvoll als großflächige Flüssigkristallanaloga. Die nematische Phase eines Flüssigkristalls sollte sowohl flüssige (flüssige) als auch kristalline (organisierte) Eigenschaften haben. Obwohl die Form für die Spindel richtig erscheint, macht die Unbeweglichkeit das System weniger aufregend als eine mitotische Modellspindel. Auf der anderen Seite bietet dieses Problem Möglichkeiten zu untersuchen, wie man die Experimente modifizieren kann, um mehr Flüssigkeit im System zu schaffen.
Diese wissenschaftlichen Herausforderungen bieten spannende Möglichkeiten, die neue Erkenntnisse über das System ermöglichen. Um die Mikrotubuli-Tactoide bipolarer zu machen, könnte man kürzere Mikrotubuli verwenden. Es gibt jedoch eine zusätzliche Herausforderung, da Mikrotubuli nicht viele gut charakterisierte Capping-Proteine haben, um die Länge wie Aktin zu kontrollieren. Die Verwendung von Keimbildung und Wachstum erfordert die Verwendung sehr hoher Konzentrationen von Tubulin und GMPCPP, um kurze Mikrotubuli herzustellen. Die hohe Tubulinkonzentration führt zu einer größeren Anzahl von Filamenten im System, was es schwieriger macht, Tactoide voneinander zu trennen. Das Hinzufügen neuer Mikrotubuli-Verschließer, wie DARPin33, kann in dieser Situation helfen. Das zweite Problem, dass die Mikrotubuli unbeweglich sind, könnte durch die Zugabe von Motorproteinen wie Kinesin-534, die Tetramere von Motoren sind, die in der Mitose verwendet werden, gemildert werden. Alternativ könnten künstliche Dimere von dimerem Kinesin-115 verwendet werden.
Eine andere Möglichkeit, mehr Flüssigkeit hinzuzufügen, wäre, den Mikrotubuli zu erlauben, ihre dynamische Instabilität, das Wachstum und Schrumpfen von Mikrotubuli, durchzuführen. Derzeit sind Mikrotubuli, die mit stabilen GMPCPP-Filamenten ausgesät werden und dann eine dynamische Instabilität erfahren, viel länger als gewünscht, um eine Spindel oder einen Tactoid zu bilden, was zu sehr langen Organisationen wie Fans oder Bündeln führen würde. Das Hinzufügen von dynamischer Instabilität des Mikrotubuli müsste also sorgfältig durchgeführt werden, um die taktoide Form zu erhalten. Die Zugabe von assoziierten Proteinen und Enzymen, die die Länge kontrollieren können, kann dieses Problem mildern. Zum Beispiel wäre wahrscheinlich eine Depolymerisation von Kinesinen wie Kinesin-1335 oder die Trennung von Enzymen wie Katanin36 erforderlich. Diese Experimente sind komplex und schwierig, obwohl sie sehr aufschlussreich wären, egal was die Ergebnisse zeigen. Unabhängig davon, in welche Richtung zukünftige Experimente gehen, kann die hier entwickelte Plattform zur Herstellung von Mikrotubuli-Tactoiden neue Informationen über die physikalische Grundlage der Mikrotubuli-Organisation freilegen.

Die Zellteilung durch Mitose ist einer der wichtigsten biologischen Prozesse, um das Leben zu erhalten. Die Mikrotubuli-Filamente, die aus Tubulin-Dimeren bestehen, sind wesentliche Strukturelemente dieses Prozesses. Die transiente Maschinerie, die in der Metaphase entsteht, wenn sich die Chromosomen im Zellzentrum ausrichten, wird aufgrund ihrer Form, die wie eine Spindel eines mit Fäden bedeckten Webstuhls ist, als mitotische Spindel bezeichnet (Abbildung 1A). Es ist in vielen Organismen gut etabliert, dass Mikrotubuli in der Metaphase verwendet werden, um kondensierte Chromosomen in die Mitte der Zelle zu schieben und zu ziehen, sie auszurichten und an Mikrotubuli anzuschließen, die sie in Anaphase auseinanderziehen (Abbildung 1B, C). Die Spindel bildet sich sowohl in der Meiose (Abbildung 1B) als auch in der Mitose (Abbildung 1C) und entsteht aus vielen überlappenden Mikrotubuli, die nicht wie ein Gewinde um die zentrale Achse gewickelt sind, sondern parallel zur Grenzfläche verlaufen. Die Schaffung dieser mikrotubulibasierten Strukturen erfordert assoziierte Proteine, die vernetzen, und assoziierte Enzyme, die als Motoren fungieren können, um die Chromosomen zu drücken und zu ziehen1.
Studien an meiotischen Spindeln haben gezeigt, dass die Mikrotubuli in vernetzten Arrays 2,3,4,5,6 kurz, dynamisch und überlappend sind (Abbildung 1Di). Aufgrund der physikalischen Organisation dieser kurzen Mikrotubuli ähnelt die meiotische Spindel einem Flüssigkristall-Tactoid (Abbildung 1E). Tatsächlich wurde gezeigt, dass Spindeln verschmelzen und verschmelzen, wie man es von Flüssigkristall-Tactoidenerwarten würde 5.
Viele Studien aus den 1960er Jahren haben Fixierung, serielle Schnitte und Elektronenmikroskopie verwendet, um festzustellen, dass es zwei Arten von Mikrotubuli in der mitotischen Spindel 7,8,9,10 gibt. Der erste Typ wird als Kinetochor-Mikrotubuli bezeichnet, die den Spindelpol mit dem Kinetochor verbinden. Der zweite Typ wird als interpolare oder polare Mikrotubuli bezeichnet, die über die Chromosomen hinauswachsen und sich in der Mitte überlappen (Abbildung 1Dii) 8,9,10. Ein dritter Typ werden als astrale Mikrotubuli bezeichnet, die sich außerhalb der Spindel befinden und die Pole mit dem Zellrand verbinden; Diese Mikrotubuli-Organisationen liegen außerhalb des Rahmens der aktuellen Diskussion. Es gibt neuere Studien über die Wechselwirkung zwischen Augmin6 und Gamma-Tubulin-Ringkomplex, der Keimbildungszentren für Mikrotubuli beeinflusst, was zu einer mitotischen Spindel mit kürzeren Mikrotubuli wie in Abbildung 1D führt.
Da Mikrotubuli länger als breit sind, mit einem hohen Aspektverhältnis und einer hohen Steifigkeit, sind sie wie vergrößerte Versionen von Flüssigkristallmolekülen. In der Physik der weichen Materie wurden Atome und Moleküle unter Verwendung minimaler Wechselwirkungen angenähert, um die physikalischen Mechanismen von Phasenübergängen, einschließlich Keimbildung und Schmelzen von Kristallen11, abzuleiten. In ähnlicher Weise sind Mikrotubuli mesoskalige Objekte, die vergrößerte Versionen von Flüssigkristallmolekülen sind und Einblicke in die Physik der Flüssigkristalldynamik geben, einschließlich der Keimbildung und des Wachstums der nematischen Phasen aus isotropen. Darüber hinaus weist die meiotische Spindel, wie oben diskutiert, Eigenschaften wie die eines Flüssigkristall-Tactoids auf, eines nematischen Zustands, der aus dem isotropen Zustand von Flüssigkristallmolekülen 3,4,5 keimt und wächst. Für Tactoide sind Keimbildung und Wachstum wie bei anderen Kristallen (d.h. sie erfordern eine relativ hohe Konzentration an Mesogenen [den Molekülen, die Flüssigkristalle bilden]). Die einzigartige "Spindelform" des Tactoiden ergibt sich aus der lokalen Ausrichtung der Flüssigkristallmesogene, die sich in der nematischen Phase ausrichten (Abbildung 1E). Sie können keinen abgerundeten Kristall bilden, da die Moleküle stark asymmetrisch sind. Angesichts der Beschaffenheit der Mikrotubuli ist es vielleicht nicht verwunderlich, dass die mitotische Spindelmaschinerie, die aus einer hohen lokalen Konzentration von Mikrotubuli besteht, auch die gleiche Form hat, unabhängig davon, ob sie als Tactoid oder Spindel bezeichnet wird. Taktoide können bipolar sein, mit Polen an den sich verjüngenden Enden (Abbildung 1Ei), oder homogen, mit Polen effektiv im Unendlichen (Abbildung 1Eii).
Angesichts der Bedeutung der Spindelbildung wurden Bemühungen um eine selbstorganisierte Spindelbildung in vitro unternommen, indem die Kondensation von Mikrotubuli in Bündel über ionische Spezies 12,13, Crowding-Agenten, die Depletionsinteraktionen erzeugen 14,15, und spezifische Mikrotubuli-Vernetzungsproteine13,16,17,18,19 nachgewiesen wurde. 21. Obwohl diese Mittel alle daran arbeiten, die lokale Konzentration von Mikrotubuli zu erhöhen, führen sie überraschenderweise oft zu langen Mikrotubulibündeln, aber nicht zu Tactoiden. Ein Grund, warum diese Bündel lang sind, könnte sein, dass die Mikrotubuli, aus denen sie bestehen, auch lang sind. Jüngste Arbeiten mit kürzeren Mikrotubuli berichteten auch von längeren Bündeln, die sich am Ende15 nicht verjüngen; In diesem Fall werden die Bündel mit Motorproteinen zusammengehalten, die eine Verlängerung der Bündel bewirken und sie dadurch länger machen. Für konische, spindelartige Baugruppen, wie hier beschrieben, werden kurze Mikrotubuli mit nicht-extensilen Vernetzern benötigt.
Vor kurzem haben wir eine Technik entwickelt, die die Erzeugung von Mikrotubuli-Tactoiden mit dem antiparallelen Vernetzer MAP65 in Gegenwart von nukleierenden stabilen Mikrotubuliermöglicht 22. Die Mikrotubuli mussten kurz sein, aber nur wenige bekannte Regulatoren der Mikrotubuli-Länge können Mikrotubuli gegen dynamische Instabilität oder End-to-End-Glühen kappen. Stattdessen wurde GMPCPP verwendet, um die Filamente nach dem Wachstum zu keimen und zu stabilisieren. Dies ermöglichte es, eine hohe Dichte an kurzen Mikrotubuli zu erzeugen, die sich selbst in Tactoiden organisieren konnten. Diese Tactoiden waren homogen, wenn sie unter Doppelbrechung betrachtet wurden. Zusätzlich zu kurzen Mikrotubuli wurde ein spezifischer antiparalleler Vernetzer, MAP65, verwendet, um die Tactoide zu bilden (Abbildung 2). MAP65 ist ein pflanzliches Mikrotubuli-assoziiertes Protein in der PRC1/Ase1-Familie der mitotischen Vernetzer23. MAP65 existiert als Dimer, mit einer starken Affinität zur Bindung an sich selbst sowie an die Mikrotubuli24. Im Gegensatz zu den meiotischen Spindeln und Tactoiden, die mit Aktinfilamenten 25,26,27 beobachtet wurden, die bipolar sind und die flüssigkeitsähnlichen Eigenschaften von Flüssigkristallen aufweisen, wurde beobachtet, dass Mikrotubuli-Tactoide fest wie 22,28 sind.
Hier werden Protokolle zur Herstellung der Mikrotubuli-Tactoide und zur Charakterisierung der Form der Baugruppen und der Mobilität der Bestandteile mit fluoreszenzbasierten Techniken vorgestellt.

<table><tbody><tr><td>2% Dichlordimethylsilan</td><td>GE Healthcare</td><td>118945</td><td>Eine hydrophobe Silan-Oberflächenbehandlung. Dieser kann bis zu drei Mal wiederverwendet und ein Jahr lang bei Raumtemperatur aufbewahrt werden.</td></tr><tr><td>5-Minuten-Epoxidharz</td><td>Bob Smith Industries</td><td></td><td>Zum Versiegeln von Versuchskammern</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Fisher</td><td>32900HPLC</td><td>100%</td></tr><tr><td>BL21-Zellen</td><td>Bio Labs</td><td>C2527I</td><td>Kompetente Bakterienzellen, die zur Expression von MAP65-Katalase</td></tr><tr><td></td><td>verwendet werden Sigma</td><td>C30-500MG</td><td>Teil des Sauerstoff-Fängersystems. Ein 300 mg/ml Bestand wird in ddH2O hergestellt und in 10 μ; l Aliquoten in -20°; C für bis zu einem Jahr.</td></tr><tr><td>Deckgläser (22 mm x 22 mm oder 22 mm x 30 mm)</td><td>Fisher</td><td>12544-AP</td><td>Für Versuchskammern</td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma</td><td>43815-5G</td><td>Ein kleines Molekül, das zum Aufbrechen von Disulfidbindungen und zum Auffangen von Sauerstoff verwendet wird. Ein 1 M Rohling wird aus Pulver (Sigma) in ddH2O hergestellt. Die Lösung wird aliquotiert und bis zu einem Jahr bei -20 °C gelagert. Die Aliquoten werden 7-8 Mal verwendet und dann verworfen.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-10G</td><td>Tubulinpuffer Basisbestandteil</td></tr><tr><td>Eppendorf 0,5 ml Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>05 402 18</td><td>Zum Halten von experimentellen Lösungen</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher</td><td>111000200</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Filterpapier</td><td>Whatman</td><td>1004-110</td><td>Zum Reinigen und zum Ziehen von Lösungen durch experimentelle Kammern</td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop mit hohem NA Objektive</td><td>Nikon</td><td>Ti-E, W2 Konfokal</td><td>Für bildgebende</td></tr><tr><td>Experimente Gefrierschrank -20&Grad; C</td><td>Fisherbrand</td><td>13986148</td><td>Zur Lagerung von Reagenzien</td></tr><tr><td>Gefrierschrank -80°; C</td><td>Thermo scientific</td><td>328223H01-C</td><td>Zur Speicherung von Proteinen.</td></tr><tr><td>Glasbehälter für die Silanisierung</td><td>Michaels</td><td></td><td>Zur Vorbereitung von Versuchskammern - Behandlung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher</td><td>12544-4</td><td>Für Versuchskammern</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528-250G</td><td>Teil des Sauerstofffängersystems. Ein 300 mg/ml Bestand wird in ddH2O hergestellt und in 10 μ; l Aliquoten in -20°C.</td></tr><tr><td>Glukoseoxidase</td><td>Sigma</td><td>G2133-250KU</td><td>Teil des Sauerstofffängersystems. Diese wird bei 4° gelagert; C für bis zu einem Jahr.</td></tr><tr><td>GMPCPP</td><td>Jenna Bioscience</td><td>NU-4055</td><td>Langsam hydrolysierbares Analogon von GTP, das zur Polymerisation und Stabilisierung der Mikrotubuli verwendet wird, indem es die dynamische Instabilität und die spontane kritische Konzentration für die Keimbildung von Mikrotubuli reduziert, um eine konsistente Länge zu erhalten. Wir kaufen einen 10 mM Bestand von Jena Biosciences und lagern ihn bei -20°; C für bis zu einem Jahr.</td></tr><tr><td>Heizelement für Mikroskop</td><td>Okolab Tisch-Top-Inkubator</td><td></td><td>Für bildgebende Experimente</td></tr><tr><td>Imidizol</td><td>Sigma</td><td>I2399</td><td>Wird verwendet, um MAP65-Protein aus Nickelkügelchen zu eluieren, um MAP65</td></tr><tr><td>zu reinigen Kimwipes</td><td>Fisher</td><td>34155</td><td>Zum Reinigen und zum Ziehen von Lösungen durch Versuchskammern.</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Sigma</td><td>P250-500</td><td>1 M in ddH2O, frisch hergestellt, um eine Übersäuerung im Laufe der Zeit zu verhindern.</td></tr><tr><td>Flüssiger Stickstoff</td><td>Airgas</td><td>NI 230LT22</td><td>Zum Abtropfen von Gefrieraliquoten. Dies kann auch zur Lagerung verwendet werden (nicht empfohlen)</td></tr><tr><td>MAP65-Protein</td><td>Ram Dixit</td><td></td><td>Ein Mikrotubuli-assoziiertes Protein (MAP) mit einem Molekulargewicht von 65 kD, das ein antiparalleler Mikrotubuli-Vernetzer ist. Wir haben eine unmarkierte und GFP-markierte Version von MAP65-1 aus Arabidopsis thaliana gereinigt. Wir mischen das GFP-MAP65 mit dem unmarkierten MAP65, so dass 10% des Proteins markiert sind. Der Arbeitsstock beträgt 10,8 &mu; M-Lösung. Diese Arbeitslösung wird bei 4° gelagert; C und jede Woche frisch zubereitet. Das Protokoll zur Reinigung von MAP65 und GFP-MAP65 ist in unserem vorherigen Methodenkapitel (26) enthalten.</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma</td><td>MKCJ940</td><td>Tubulin-Puffer Inhaltsstoff</td></tr><tr><td>NTA-Nickel-Kügelchen</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td>Kügelchen für die Aufreinigung von 6xHis-markierten MAP65-Proteinen erforderlich</td></tr><tr><td>Optomicroscan</td><td>Nikon</td><td></td><td>405 nm Lasersystem, das den Laser in jede gewünschte Form des interessierenden Bereichs fokussieren</td></tr><tr><td>kann PEM80</td><td></td><td></td><td>Neutraler Tubulinpolymerisationsbasenpuffer für Lösungen aus 80 mM K-Rohren, pH 6,8, 1 mM MgSO4, 1 mM EGTA, gelagert bei 4°; C für bis zu einem Jahr.</td></tr><tr><td>Permanentes doppelseitiges Klebeband</td><td>3M - Scotch</td><td>34-8724-5691-7</td><td>Für Versuchskammern</td></tr><tr><td>Petrischale</td><td>Fisher</td><td>FB0875713</td><td>Für Feuchtkammer</td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P7643-100G</td><td>Tubulinpuffer Basisbestandteil</td></tr><tr><td>Pluronic-F127</td><td>Sigma</td><td>P2443-250G</td><td>Ein Block-Copolymer mit zwei hydrophilen Polyethylenoxid (PEO)-Blöcken an den Enden und einem hydrophoben Mittelblock aus hydrophober Oberflächenbeschichtung aus Polyphenylenoxid (PPO), die wir verwenden, um die Bindung von Proteinen an die Oberfläche zu verhindern. Pluronic-F127 wird als Pulver (Sigma) gekauft und über Nacht in ddH2O zu einer 5%igen (w/v) Lösung gelöst. Nach dem Auflösen kann die Lösung bis zu einem Jahr bei Raumtemperatur gelagert werden.</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol</td><td>Affymetrix Inc</td><td>19966 500 GM</td><td>Ein Crowding-Mittel, das verwendet wird, um Erschöpfungskräfte zu erzeugen, um Taktoide an die Oberfläche zu bringen und Mikrotubuli zu organisieren. Wir stellen eine 5%ige (w/v) Lösung von 100 kDa PEG in PEM80 her. Die Lösung wird in 4°; C bis zu einem Jahr lang und vor Gebrauch auf die Wippe legen. Es ist viskos, daher empfehlen wir, eine Verdrängerpipette zu verwenden, um damit zu arbeiten.</td></tr><tr><td>Verdrängerpipette</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>Zum Pipettieren von viskosen</td></tr><tr><td>Flüssigkeiten Gestelle für Deckgläser</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaften</td><td>72240</td><td>Zur Vorbereitung von Versuchskammern - Behandlung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Kühlschrank 4&deg; C</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td>Für die Lagerung von Reagenzien</td></tr><tr><td>Tubulin-markiertes</td><td>Zytoskelett</td><td>TL590M</td> wird <td>lyophilisiertes Rhodamin-markiertes Tubulin aus dem Schweinegehirn gekauft (Zytoskelett) und in -80° gelagert; C, bis es in PEM80 hydratisiert und bis zu einem Jahr lang verwendet wird.</td></tr><tr><td>Tubulin-Protein</td><td>Zytoskelett</td><td>T240</td><td>lyophilisiertes Tubulin 99% rein, unmarkiert aus Schweinegehirn, wird gekauft (Zytoskelett) und in -80° gelagert; C, bis es in PEM80 hydratisiert und bis zu einem Jahr lang verwendet wird.</td></tr><tr><td>UV-Ozon</td><td>Jelight</td><td>Modell 342</td><td>Zur Vorbereitung von Versuchskammern - Behandlung von Deckgläsern</td></tr><tr><td>Stackreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/</td> <td>Plugin zur Registrierung von Zeitreihendaten zur Entfernung von Drift</td></tr><tr><td>Turboreg</td><td>Biomedical Imaging Group</td><td>http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/</td> <td>Plugin zur Registrierung von Zeitreihendaten zur Entfernung von Drift</td></tr></tbody></table>

selbstorganisation von mikrotubuli-taktoiden

Self-Assembly of Microtubule Tactoids

Das Zytoskelett ist für die wichtige interne Organisation und Reorganisation innerhalb der Zelle verantwortlich, alles ohne einen Manager, der die Veränderungen leitet. Dies ist insbesondere bei der Mitose oder Meiose der Fall, bei der die Mikrotubuli während der Zellteilung die Spindel bilden. Die Spindel ist die Maschinerie, die verwendet wird, um genetisches Material während der Zellteilung zu trennen. Um selbstorganisierte Spindeln in vitro zu erzeugen, haben wir kürzlich eine Technik entwickelt, um Mikrotubuli in spindelartige Anordnungen mit einem minimalen Satz von Mikrotubuli-assoziierten Proteinen und Crowding-Agenten zu rekonstituieren. Insbesondere wurde MAP65 verwendet, ein antiparalleler Mikrotubuli-Vernetzer aus Pflanzen, ein Homolog von Ase1 aus Hefe und PRC1 aus Säugetierorganismen. Dieser Vernetzer organisiert Mikrotubuli selbstorganisierend zu langen, dünnen, spindelartigen Mikrotubuli-selbstorganisierten Baugruppen. Diese Baugruppen ähneln auch Flüssigkristall-Tactoiden, und Mikrotubuli könnten als mesoskalige Mesogene verwendet werden. Hier werden Protokolle zur Herstellung dieser Mikrotubuli-Tactoide sowie zur Charakterisierung der Form der Baugruppen mittels Fluoreszenzmikroskopie und der Beweglichkeit der Bestandteile mittels Fluoreszenzrückgewinnung nach dem Photobleichen vorgestellt.

Mit nur einer kleinen Anzahl von Komponenten, Tubulindimeren und Mikrotubuli-Vernetzern können sich Mikrotubuli-Tactoide bilden (Abbildung 2A). Obwohl dieses Protokoll die Inkubation beschreibt, um Mikrotubuli in einem Inkubator zu keimen und zu züchten, können die Keimbildung und das Wachstum direkt unter dem Mikroskop beobachtet werden (die innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen sind) (Abbildung 2B). Die Tubulinkonzentration wird konstant bei 13,6 μm und MAP65-MT-Bindung bei 10% gehalten.
Abbildung 4 stellt erfolgreiche Daten dar. Die Tactoide sollten sowohl mit einem 561-nm-Laser im Tubulinkanal als auch mit 488 nm im MAP65-Kanal sichtbar sein, die sich perfekt überlappen (Abbildung 4A). Ein Rätsel des Systems war, dass die Breite der Tactoide unter einer Vielzahl von experimentellen Veränderungen nicht zu variieren scheint, einschließlich der Änderung der Mikrotubuli-Längen, der MAP65-Konzentration und der Crowding-Agenten (Abbildung 4B) 22,28. Die Länge ist viel variabler und hängt sowohl von den Mikrotubuli-Längen als auch von der MAP65-Konzentration ab (Abbildung 4B)22,28.
Bei der Durchführung von FRAP wurde beobachtet, dass sich das MAP65-Signal erholt, das Mikrotubuli-Signal jedoch nicht (Abbildung 5). Die Erholung in FRAP ist auf die Mobilität und Bewegung der markierten und photogebleichten Objekte zurückzuführen. Im Falle des MAP65 dissoziieren die abgedunkelten Moleküle und bewegen sich vom Mikrotubuli weg und neue bewegen sich in die Region (Abbildung 5). Die MAP65-Bindung befindet sich im Gleichgewicht, so dass die Bindungs- und Unbindungsrate gleich ist (gemessen in Molekülen pro Sekunde). Für die Mikrotubuli wurde keine Erholung beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Mikrotubuli nicht in der Lage sind, den Taktus zu verlassen (Abbildung 5A, Bi, C). Darüber hinaus wurde keine Ausbreitung der abgedunkelten Region beobachtet, was darauf hindeutet, dass die Mikrotubuli lokal unbeweglich sind und keine Flüssigkeit innerhalb der Taktoidform.
<img alt="Metaphase-Chromosomenausrichtung; Spindelstruktur und Mikrotubuli-Organisation; Mikroskopie-Diagramm." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Abbildung 1: Verschiedene Modelle der Spindelbildung. Eine mitotische Spindel ist eine Maschine aus Mikrotubuli und den damit verbundenen Proteinen und Enzymen, die die Chromosomen während der Zellteilung zu den beiden neuen Tochterzellen ausrichtet und trennt. (A) Bild einer frühmittelalterlichen Fallspindelreplik mit feinem Garn aus den Niederlanden. Diese Figur wurde von einem Wikimedia-Bild von Peter van derSluijs 30 modifiziert. (B) Dreidimensionale Rekonstruktion von Mikrotubuli in verschiedenen Stadien der Wildtyp-Meiose II. Mikrotubuli sind grün und Chromosomen grau dargestellt. Maßstabsleiste = 1 μm. Diese Figur wurde von Lantzsch et al.31 modifiziert. (C) Mikroskopische Aufnahme der Mikrotubuli in einer mitotischen Spindel einer sich teilenden Sf9-Zelle. Die Spindelpole und die Mikrotubuli der Spindel sind mit einem grün fluoreszierenden Protein markiert. Maßstabsleiste = 5 μm. Diese Figur wurde von Advani et al.32 modifiziert. (D) Verschiedene Modelle, wie mitotische und meiotische Spindelmikrotubuli organisiert sind. (i) Zuvor wurde für meiotische Spindeln, die aus Xenopus-Ei-Extrakten hergestellt wurden, beobachtet, dass die Mikrotubuli (grün) in der gesamten Spindel kurz und dynamisch sind. Dies ist vergleichbar mit einer bipolaren taktoiden Organisation in einem Flüssigkristall. (ii) Das kanonische Modell für die Mikrotubuli-Organisation innerhalb einer mitotischen Spindel hat zwei Arten von Mikrotubuli: interpolare oder polare Mikrotubuli (dunkelgrün), die sich in der Mitte um die Chromosomen vernetzen, und Kinetochor-Mikrotubuli (hellgrün), die vom Pol zum Kinetochor gebündelt und gestreckt werden, um die Chromosomen zu drücken und zu ziehen. In allen Bildern sind die Chromosomen in transparentem Blau und die Spindelpole dunkelgrün dargestellt. (E) Schematische Darstellung von Mesogenen (grüne Linien) in einem Flüssigkristall-Tactoid für (i) bipolare und (ii) homogene Taktoide. Bipolare Tactoide haben zwei Pole am Ende des Tactoids, und die Mesogene orientieren sich neu, um auf diese Pole zu zeigen. Homogene Tactoide haben Pole im Unendlichen, und die Mesogene ändern nicht die Ausrichtung entlang der Länge des Tactoids. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Taktoide Entstehungsmethode, schematische Darstellung und Zeitreihen; Mikrotubuli, MAP65-Vernetzung, Mikroskopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Abbildung 2: Kondensation von Mikrotubuli. (A) Mikrotubuli können durch eine Vielzahl von Methoden gebündelt und vernetzt werden, einschließlich ionischer Spezies, Erschöpfungskräfte, die durch Crowding-Agenten verursacht werden, und spezifischer Mikrotubuli-Vernetzer wie MAP65. (i) Tubulin-Dimere und MAP65-Proteine werden gemischt, um Mikrotubuli zu keimen und zu züchten. (ii) Mikrotubuli keimen und wachsen aus dem Tubulin, und MAP65 bindet sofort an Mikrotubuli, ein anderes MAP65-Monomer oder beides und verursacht eine Bündelung. (iii) Mikrotubuli in den vernetzten Bündeln keimen und wachsen. (iv) Die endgültige Konfiguration ist ein Mikrotubuli-Tactoid ähnlich einer Spindel. (B) Zeitreihe von Mikrotubuli-Tactoiden, die über 105 min keimen und wachsen. Maßstabsleiste = 5 μm. Abbildung nach Edozie et al.22. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Flusskammerdiagramm mit silanisiertem Deckglas für die Analyse der Probenflussrichtung in der Mikroskopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Abbildung 3: Baugruppe der Durchflusskammer Die Durchflusskammer besteht aus einem Glasobjektträger, silanisiertem Deckglas und permanentem doppelseitigem Klebeband. Der gelb hervorgehobene Bereich ist der Fließweg, auf dem die Probe fließt und beobachtet wird. Das Volumen der Durchflusskammer beträgt ~20 μL. Epoxidharz wurde verwendet, um die Enden der Kammer zu versiegeln, um zu verhindern, dass die Probe während der Langzeitbildgebung über mehrere Stunden verdampft. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Taktoidanalyse: Mikrotubuli- und MAP65-Kanäle, zusammengeführte Bilder, Längen-Breiten-Quantifizierung, Grafik." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig4.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Abbildung 4: Taktische Bilder und Längen- und Breitenanalyse. (A) Beispieldaten von Tactoiden, die wie beschrieben gebildet und mit konfokaler Spinnscheibe abgebildet wurden, zeigen (i) Mikrotubulikanal-Bildgebung von Rhodamin-markiertem Tubulin mit einem 561-nm-Laser, (ii) GFP-MAP65-Kanalabbildung des GFP mit einem 488-nm-Laser und (iii) zusammengeführtes Overlay-Bild aus dem Mikrotubuli-Kanal (Magenta) und GFP-MAP65-Kanal (Cyan). Überlappungsbereiche werden weiß dargestellt und zeigen, dass die Mikrotubuli und MAP65 exakt kolokalisieren. Maßstabsleiste = 10 μm für alle Bilder in (A). (B) Quantifizierung der Tactoidlänge und -breite. (i) Bild eines zu analysierenden Tactoiden ohne Markierungen. Maßstabsleiste = 5 μm. (ii) Gleiches Bild wie in (i), wo die Längenmessungen (durchgezogene Linie mit Zeilenkappen) und Breite (gestrichelte Linie) angegeben sind. Skalenbalken = 5 μm. (iii) Die Breite wurde gemessen, indem das Intensitätsprofil über den Taktoid am senkrechten Bisektor (gestrichelte Linie) gemessen wurde, der in (ii) bezeichnet wird. Das Intensitätsprofil wurde an eine Gaußsche Funktion angepasst, um die Amplitude und Breite des Tactoiden aufzudecken. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="FRAP-Analyse: Mikrotubuli, MAP65-Zeitreihen, Intensitätsdiagramme. Dynamik der Fluoreszenzwiederherstellung." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63952/63952fig05.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 5"> Abbildung 5: Repräsentative FRAP-Daten und -Analysen. (A) Mikroskopie-Zeitreihendaten von (i) Mikrotubuli-Tactoid und (ii) GFP-MAP65 und (iii) Overlay-Bild beider Kanäle mit Mikrotubuli in Magenta und GFP-MAP65 in Cyan, die zum Zeitpunkt von 63 s photogebleicht und für weitere 5 min beobachtet wurden. (B) Quantifizierte Intensität der (i ) Mikrotubuli-Kanal im gebleichten Bereich (Magenta-Kreise) und im Hintergrund (dunkelgraue Kreise) und (ii) GFP-MAP65-Kanal im gebleichten Bereich (cyanfarbene Quadrate) und im Hintergrund (dunkelgraue Quadrate). (C) Die Daten wurden um das Hintergrundrauschen korrigiert und für den Mikrotubuli-Kanal (Magenta-Kreise) und den GFP-MAP65-Kanal (Cyan-Quadrate) neu skaliert. Die Mikrotubuli erholen sich nicht, aber der GFP-MAP65 tut es und kann (dunkelgraue Linie) an einen steigenden exponentiellen Zerfall angepasst werden, um die Amplitude und die Zeitskala der Erholung zu finden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63952/63952fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die Bildung von Mikrotubuli-Baugruppen in Form von Tactoiden unter Verwendung von MAP65, einem pflanzlichen Mikrotubuli-Vernetzer, und PEG als Crowding-Agent vor.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

The cytoskeleton is responsible for major internal organization and re-organization within the cell, all without a manager to direct the changes. This is ...

Dieses Protokoll ermöglicht die spontane Selbstorganisation von Mikrotubuli-Tactoiden mit einem antiparallelen Vernetzer, MAP65. Dieses System kann uns helfen, die Organisation von Mikrotubuli und biologische Systeme wie mitotische Spindeln zu verstehen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um ein minimalistisches System handelt, das spindelartige Formen für Mikrotubuli nachbilden kann, die hochgradig reproduzierbar und für viele Labore zugänglich sind.Diese Methode ist nicht nur auf zelluläre Systeme anwendbar, sondern kann auch als Modell für Flüssigkristallstudien im mesoskaligen Maßstab dienen. Um Tubulin herzustellen, nehmen Sie zuerst ein Aliquot unmarkiertes Tubulin mit einem Milligramm lyophilisiertem Tubulin aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und halten Sie es auf Eis. Dann fügen Sie 200 Mikroliter kaltes PEM-80 hinzu.Um das gesamte Lyophilat aufzulösen, halten Sie die Tube 10 Minuten auf Eis. Als nächstes nehmen Sie eine Tube mit rhodaminmarkiertem Tubulin mit 20 Mikrogramm lyophilisiertem Tubulinpulver aus dem minus 80 Grad Celsius Gefrierschrank und bewahren Sie es auf Eis auf. Dann fügen Sie vier Mikroliter kaltes PEM-80 hinzu und halten Sie die Tube für 10 Minuten auf Eis, um das gesamte Lyophilat aufzulösen.Sobald sich die lyophilisierten Tubuline aufgelöst haben, fügen Sie 100 Mikroliter der resuspendierten, unmarkierten Tubulinlösung zu der vier Mikroliter rhodaminmarkierten Tubulinlösung hinzu. Mischen Sie dann die Lösungen, indem Sie sechs- bis siebenmal sehr langsam verrohren. Um die restlichen 100 Mikroliter unmarkierter Tubulinlösung zu lagern, führen Sie zuerst das Röhrchen in flüssigen Stickstoff ein, um die Lösung einzufrieren, und halten Sie das Röhrchen dann für die zukünftige Verwendung bei minus 80 Grad Celsius.Als nächstes verteilen Sie die Tubulinmischung in sieben neue Röhrchen, indem Sie jeweils 15 Mikroliter hinzufügen. Frieren Sie die Röhrchen wie zuvor demonstriert in flüssigem Stickstoff ein und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für die zukünftige Verwendung. Um Durchflusskammern für die Durchführung von Experimenten zusammenzubauen, reinigen Sie zunächst einen Glasobjektträger mit doppelt destilliertem Wasser und trocknen Sie ihn mit einem fusselfreien Labortuch.Als nächstes reinigen Sie den Objektträger zuerst mit Ethanol, gefolgt von doppelt destilliertem Wasser. Um einen Fließweg zu erstellen, schneiden Sie ein 40 bis 50 Millimeter langes Stück doppelseitiges Klebeband ab. Teilen Sie es dann dazwischen, um zwei dünnere Bandstreifen zu erstellen, und legen Sie die beiden Streifen im Abstand von fünf bis acht Millimetern auf die Folie.Als nächstes legen Sie silanisierte Deckscheine auf den Fließweg. Dann versiegeln Sie den Schlitten und die Abdeckung rutschte die doppelseitigen Bandstreifen durch, indem Sie vorsichtig mit der Rückseite eines Stiftes auf den Bandbereich drückten. Wenn die Dichtung gut gemacht ist, sollte sich das Band von durchscheinend zu klar drehen.Um das zusätzliche Klebeband an den Rändern zu entfernen, schneiden Sie das Band mit einer Rasierklinge ab, so dass nur ein Millimeter vom Eingang der Durchflusskammer entfernt bleibt. Beschriften Sie dann die Kammer mit geeigneten experimentellen Parametern Um die taktischen Experimente durchzuführen, tauen Sie zunächst alle notwendigen Reagenzien auf Eis auf und lagern Sie sie während der Arbeit auf dem Eis. Als nächstes beschichten Sie die Durchflusskammer mit 20 Mikrolitern 5% nichtionischem Blockcopolymer-Tensid, das in PEM-80 gelöst ist, mit kleinen Tropfen an beiden Enden der Kammer, um die Bildung von Luftblasen im Inneren zu verhindern.Bewahren Sie dann die Durchflusskammer in einer feuchten Kammer aus Petrischale mit einem nassen, fusselfreien Labortuch für mindestens fünf bis sieben Minuten auf. Als nächstes mischen Sie PEM-80, GMPPCPP, Pluronic F-127, Dithiothreitol, Glukose, Polyethylenglykol, die zuvor hergestellte Tubulinmischung und MAP65 mit GFP MAP65 zur Visualisierung in einem sterilen Röhrchen durch fünf- bis sechsmaliges Pipettieren, wobei das Rohr auf Eis gehalten wird. Dann fügen Sie einen Mikroliter einer vorgemischten Lösung von Glukoseoxidase hinzu und katalasieren Sie in das Röhrchen der Tubulin-MAP-Mischung und mischen Sie erneut, indem Sie sieben bis acht Mal paspeln.Teilen Sie das Gesamtvolumen der Lösung in zwei Teile, die in separaten Kammern verwendet werden. In der Zwischenzeit muss die Flüssigkeit, die zuvor in die Durchflusskammer gegeben wurde, durch Kapillarwirkung entfernt werden, indem ein fusselfreies Labortuch am anderen Ende der Kammer verwendet wird, zusammen mit der Zugabe des Tubulin-MAP-Gemisches zur Durchflusskammer. Sobald sich die Probe vollständig in der Kammer befindet, versiegeln Sie die beiden Enden der Kammer mit fünfminütigem Epoxidharz und halten Sie sie etwa 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Mikrotubuli-Tactoide zu keimen und zu züchten.Für die Abbildung der Tactoide mittels Fluoreszenzmikroskopie verwenden Sie Objektive mit einer numerischen Apertur von 1,2 oder mehr in 60-facher oder höherer Vergrößerung, um genügend Licht in Fluoreszenz zu sammeln. Nehmen Sie die Bilder mit einem kostenlosen Metalloxid-Halbleiter oder einer ladungsgekoppelten Gerätekamera auf. Um die Probe zu erhalten, bewahren Sie sie in einer auf 37 Grad Celsius eingestellten Umweltkammer auf.Alternativ können hierfür auch andere Bühnenheizungen, einschließlich Heißluft-Bühnenheizungen und objektiv temperierte Halsbänder mit zirkulierendem Warmwasser, eingesetzt werden. Da geeignete Anregungsquellen für die korrekte Fluoreszenz von Rhodamintubuli unerlässlich sind, verwenden Sie einen 561-Nanometer-Laser mit mindestens einem Milliwatt Leistung an der Probe für qualitativ hochwertige Bilder. Ändern Sie jedoch für GFP MAP65 die Anregungsquelle in einen 488-Nanometer-Laser.Wenn Sie eine Weitfeld-Epifluoreszenzmikroskopie verwenden, verwenden Sie einen Rhodaminfilterwürfel mit einer Anregung von 540 12,5 Nanometern, einem dichroitischen Cutoff von 545 Nanometern 12,5 Nanometern und einer Emission von 575 Nanometern Long-Pass. Verwenden Sie für GFP MAP einen GFP-Filterwürfel mit einer Anregung von 480 15 Nanometern, einer dichroitischen Abschaltung von 505 Nanometern 15 Nanometern und einer Emission von 515 Nanometern Longpass. Nachdem Sie sichergestellt haben, dass die Beleuchtungsleistung und die Belichtungszeiten so sind, dass die Intensitätsskala für die Kamera nicht gesättigt ist, nehmen Sie mindestens 10 Bilder aus verschiedenen Bereichen auf, um über 100 Tactoide sowohl im roten als auch im grünen Kanal abzubilden, und speichern Sie sie als 16-Bit-TIFF-Bilder zur Analyse.Mit diesem Protokoll können Mikrotubuli-Tactoide, deren Bildung innerhalb von 30 Minuten abgeschlossen ist, direkt unter dem Mikroskop sichtbar gemacht werden. Die Tactoide sind sowohl mit einem 561-Nanometer-Laser im Tubulinkanal als auch mit einem 488-Nanometer-Laser im MAP65-Kanal sichtbar. Die Bilder überlappen sich auch perfekt miteinander.Bei dieser Methode konnte auch die Länge und Breite der Tactoide gemessen werden. Es wurde festgestellt, dass das Intensitätsprofil eines Tactoiden mit seiner Breite variiert. Darüber hinaus wurde die unbewegliche Natur der Mikrotubuli-Tactoide durch die Fluoreszenzrückgewinnung nach Photobleichen oder FRAP-Experimenten nachgewiesen, die nach dem Photobleichen keine Erholung der Fluoreszenz zeigten.Auf der anderen Seite zeigten FRAP-Experimente eine mobile Natur von MAP65, für die eine allmähliche Erholung und Fluoreszenz nach dem Photobleichen beobachtet werden konnte. Diese Fluoreszenzrückgewinnung durch MAP65 kann an einen steigenden exponentiellen Zerfall angepasst werden, um die Amplitude und die Zeitskala der Erholung zu finden. Der taktische Experimentteil sollte innerhalb von 10 bis 12 Minuten abgeschlossen sein, da das Tubulin auf Eis schnell schlecht werden kann, was sich nachteilig auf die Keimbildung von Tactoiden auswirken kann.Zukünftige Arbeiten mit verschiedenen Mikrotubuli-Vernetzungsproteinen und Vernetzungsmotorproteinen, Enzymen, die Mikrotubuli bewegen können, werden weiterhin neue Informationen über die Selbstorganisation der mitotischen Spindel liefern.

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt TIRF, eine auf Totalreflexionsmikroskopie basierende Technik zur Visualisierung der Polymerisationsdynamik von Aktin und Mikrotubuli. Die Methode ermöglicht die hochauflösende Abbildung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in Echtzeit, was für das Verständnis zellulärer Wechselwirkungen unerlässlich ist.

TIRF-Mikroskopie zur Visualisierung der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli

Mikrotubuli sind Polymere von Natur aus instabil, und deren Umschaltung zwischen Wachstum und Verkürzung stochastisch und schwierig zu steuern. Hier beschreiben wir Protokolle mit segmentierten Mikrotubuli mit photoablatable stabilisierende Kappen. Depolymerisation von Mikrotubuli segmentiert mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung ausgelöst werden, wodurch die Unterstützung Analyse der Bewegungen mit den Mikrotubuli-Enden der Demontage.

Vorbereitung der segmentierte Mikrotubuli auf Anträge von der Demontage Microtubule Ends Driven Studieren

Hier wird ein TIRF-Mikroskopie-basierter  In-vitro-Rekonstitutionsassay vorgestellt, um gleichzeitig die Dynamik zweier Mikrotubulipopulationen zu quantifizieren und zu vergleichen. Es wird ein Verfahren beschrieben, um gleichzeitig die kollektive Aktivität mehrerer Mikrotubuli-assoziierter Proteine auf vernetzten Mikrotubulibündeln und einzelnen Mikrotubuli zu betrachten.

Simultane Visualisierung der Dynamik von vernetzten und einzelnen Mikrotubuli in vitro mittels TIRF-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Rekonstitution von Mikrotubulibündeln in vitro und zur direkten Quantifizierung der in ihnen ausgeübten Kräfte durch simultanes optisches Einfangen und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Dieser Assay ermöglicht die Messung der Kräfte und Verschiebungen, die von Proteinensembles in aktiven Mikrotubuli-Netzwerken erzeugt werden, auf Nanoskala-Ebene.

Direkte Messung von Kräften innerhalb rekonstituierter aktiver Mikrotubulibündel

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Hier werden Verfahren zur Herstellung aktiver Nematika aus Mikrotubuli und Kinesinmotoren vorgestellt, einschließlich Proteinpräparation und -aufbau sowie der Verwendung von Vertiefungen für den aktiven nematischen Einschluss.

Formen, Einschließen und Beobachten von Mikrotubuli-basierten aktiven Nematiken

Dieses Manuskript beschreibt Standardprotokolle zur Messung der Hyperphosphorylierung Tau, Tau Bindung an Mikrotubuli und Lokalisierung von intrazellulären Tau nach medikamentösen Behandlungen zu messen. Diese Protokolle können wiederholt verwendet werden, für das screening von Drogen oder andere Substanzen, die auf Tau Hyperphosphorylierung oder Mikrotubuli binden.

Test zur Phosphorylierung und Mikrotubuli binden zusammen mit Lokalisierung des Tau-Proteins in Colorectal Krebszellen

In diesem Papier wird eine Methode zur Messung von Sauerstoff-Verbrauch mit hochauflösender respirometrie in permeabilized Thoraxes von Drosophila beschrieben. Diese Technik erfordert eine minimale Menge an Gewebe im Vergleich zur klassischen mitochondriale Isolierung-Technik und die erzielten Ergebnisse mehr physiologisch relevant sind.

Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch in Permeabilized Fasern von Drosophila mit minimalen Mengen von Gewebe

Hier präsentieren wir ein Protokoll für die Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine mit Biotin murinen in Vivo . Dieses Protokoll enthält Informationen zur Maus Nieren durchspülen, Glomeruli zu isolieren und endogenen Immunopräzipitation des Proteins des Interesses durchführen.

Isolierung der Glomeruli und In Vivo Kennzeichnung der glomerulären Zelle Oberflächenproteine

Wir beschreiben Protokolle zur Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO durch Röntgenkristallographie. Die Methoden umfassen Proteinexpression, Reinigung und Charakterisierung sowie Strategien zur erfolgreichen Kristalloptimierung und Strukturbestimmung des Proteins in seiner ungebundenen Form.

Produktion, Kristallisation und Strukturbestimmung der IKK-bindungsdomäne von NEMO

Erfahren Sie die spontane Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden mit MAP65 und PEG. Diese Methode ermöglicht reproduzierbare Studien zur Mikrotubuli-Organisation und biologischen Systemen wie mitotischen Spindeln.

Selbstorganisation von Mikrotubuli-Taktoiden

Weitere Videos entdecken