Name: Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: Erfahren Sie die lentivirale shRNA-Abgabe an hESCs und NPCs mit dem kostengünstigen kationischen Polymer Polyethylenimin. Diese Methode ermöglicht effiziente Gentransfer-Studien in der Stammzellforschung.

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Diese Arbeit wurde durch Forschungsstipendien der United Arab Emirates University (UAEU), Grant # 31R170 (Zayed Center for Health Sciences) und # 12R010 (UAEU-AUA Grant) unterstützt. Wir danken Prof. Randall Morse (Wadsworth Center, Albany, NY) für die Unterstützung bei der Bearbeitung des Manuskripts für Stil und Grammatik.
Alle Daten sind auf Anfrage erhältlich.

1. Transfektion von HEK293T-Zellen mit PEI- oder Lipofectamine 3000-Reagenz
<ol><li>Kultur HEK293T-Zellen in DMEM + 10% FBS + 1x Penicillin/Streptomycin bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21% O2, bis sie zu 90% konfluent sind, bevor sie zur Transfektion ausgesät werden. Verwenden Sie eine relativ niedrige Passageanzahl von Zellen für eine Virusproduktion mit hohem Titer (idealerweise weniger als P30).</li>
	<li>Samen Sie 4 x 106 Zellen in 10 ml vollständigem Wachstumsmedium in einer 100 mm Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem befeuchteten Gewebekulturinkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.
</li>
	<li>Verdünnen Sie für jede Transfektion die Plasmid-DNA (1 mg/ml Vorräte) in 1 ml serumfreiem DMEM-Medium in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen unter Verwendung des folgenden Verhältnisses von Eintritts- und Verpackungsplasmiden: Eintrittsvektor = 10 μg psPAX2,0 = 7,5 μg pMD2.G = 5 μg</li>
	<li>Wirbeln Sie für 10 s und drehen Sie das Rohr bei 10.000 x g für 30 s bei Raumtemperatur, um es zu sammeln.</li>
	<li>Geben Sie 70 μL (1 mg/ml Stammlösung) PEI in die Röhre und wirbeln und drehen Sie sie kurz wie oben beschrieben, um sie zu sammeln. Das verwendete PEI-Volumen basiert auf einem Verhältnis von 1:3 aus Gesamt-DNA (μg):P EI (μg).</li>
	<li>Für die Lipofectamin-basierte Transfektion verdünnen Sie die oben genannten Vektoren in 500 μL serumfreier DMEM-Medien, die 45 μL Reagenz P enthalten, das im Kit enthalten ist, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Verdünnen Sie 70 μL Reagenz L, das im Kit enthalten ist, mit 500 μL serumfreien DMEM-Medien und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 5 min.</li>
	<li>Kombinieren Sie den Inhalt beider Rohre und inkubieren Sie die Rohre bei Raumtemperatur für 20 Minuten, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen.</li>
	<li>Tropfenweise 1 ml DNA/PEI oder 1 ml DNA/Lipofectamin-Komplexe in die Platte gebende Zellen geben und 6 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO2 und 21%O2 inkubieren.
</li>
	<li>Nach 6 h auf frische, vollständige Wachstumsmedien (10 ml) umstellen und die Zellen mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O 2 in den befeuchteten Inkubator zurückbringen.
</li>
</ol>2. LVS-Sammlung und Ultrazentrifugation
<ol><li>Nach 2 Tagen Transfektion sammeln Sie die virushaltigen Medien und überlagern die Zellen erneut mit 10 ml frischen, vollständigen Wachstumsmedien.</li>
	<li>Sammeln Sie nach 3 Tagen Transfektion die virushaltigen Medien und kombinieren Sie sie mit den virushaltigen Medien, die zum Zeitpunkt von 2 Tagen gesammelt wurden.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie den viralen Überstand bei 2.000 x g für 10 min bei 4 °C, um Zelltrümmer zu pelletieren.</li>
	<li>Filtern Sie den Überstand mit einem 0,45 μm porengroßen Filter mit niedriger Proteinbindung (entweder PES oder SFCA) und lagern Sie ihn bei 4 °C, bis er für die Ultrazentrifugation bereit ist. Der filtrierte Überstand, der lentivirale Partikel enthält, kann 5 Tage lang bei 4 °C gelagert werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust an viralen Titern kommt.</li>
	<li>Sterilisieren Sie die Ultrazentrifugenröhrchen, die Becher halten, indem Sie sie 10 min lang mit 70% Ethanol waschen, an der Luft trocknen, schließen und bei 4 ° C aufbewahren.</li>
	<li>36 ml filtrierte Medien, die lentivirale Partikel enthalten, in ein steriles Ultrazentrifugenröhrchen geben.</li>
	<li>Füllen Sie 5 ml einer sterilen Stripette mit 4 ml steriler 20%iger Saccharoselösung (hergestellt in PBS) und dosieren Sie sie direkt auf den Boden des Ultrazentrifugenröhrchens (UC), das LVS enthält. Es ist wichtig, dass die Saccharoselösung nicht mit dem Medium vermischt wird und einen Gradienten am Boden des Röhrchens bildet.</li>
	<li>Balancieren Sie alle Ultrazentrifugenröhrchen mit serumfreien DMEM-Medien, legen Sie sie in die kalten Ultrazentrifugenröhrchen-Haltebecher und schließen Sie die Deckel.</li>
	<li>Drehen Sie die Röhrchen bei 125.000 x g für 2 h bei 4 °C.</li>
	<li>Nach dem Spin entsorgen Sie den Überstand vorsichtig, indem Sie den Inhalt des Röhrchens in einem Behälter mit Bleichmittel umkehren, ohne das Pellet zu stören. Markieren Sie das Pellet, falls sichtbar.</li>
	<li>Legen Sie das Ultrazentrifugenröhrchen in ein 50 ml steriles Röhrchen und fügen Sie 200 μL sterile DPBS genau an der Oberseite des Pellets hinzu. Über Nacht ungestört bei 4 °C aufbewahren.</li>
	<li>Am nächsten Tag vorsichtig mischen, indem Sie 40x auf und ab pipettieren.</li>
	<li>In einer Tischzentrifuge kurz mit 13.000 x g drehen, um Ablagerungen zu pelletieren.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand auf eine neue Röhre und aliquotieren Sie das Viruspräparat als 20 μL Aliquote. Bei −80 °C lagern.</li>
	<li>5 μL des Präparats für virale Titermessungen beiseite legen.</li>
</ol>3. LVS-Titermessung für pLKO.1-basierte Vektoren
<ol><li>Bestimmen Sie den Titer von lentiviralen Partikeln mittels einer qPCR gemäß den Empfehlungen des Herstellers.</li>
	<li>Für eine Standardkurve bereiten Sie fünf 10-fache serielle Verdünnungen von Standardkontroll-DNA (im Kit enthalten) vor, indem Sie in jedem Schritt 5 μL DNA in 45 μL nukleasefreiesH2Overdünnen. Verwenden Sie Verdünnungen von 1:100 bis 1:100.000, um eine Standardkurve zu erzeugen.</li>
	<li>Richten Sie Reaktionen auf Eis wie folgt in Duplikaten ein: 2x qPCR Master Mix 10 μL Primermischung 2 μL Probe oder Standard-DNA 2 μL NukleasefreiH2 O6 μL</li>
	<li>Führen Sie die qPCR unter Verwendung der im Handbuch des Kits genannten Zyklusbedingungen für insgesamt 35 Zyklen durch.</li>
	<li>Zeichnen Sie Zyklusschwellenwerte (Ct) auf der Y-Achse im Vergleich zum Virustiter auf der X-Achse auf.</li>
	<li>Generieren Sie eine logarithmische Regression unter Verwendung von vier Standard-Kontroll-DNA-Verdünnungen (1:100 bis 1:100.000), um den unbekannten Virusprobentiter mithilfe einer Trendliniengleichung zu bestimmen.</li>
</ol>4. LVS-Titermessung für pll3.7-basierte Vektoren
<ol><li>Samen Sie 1 x 105 HEK293T-Zellen in jeder Vertiefung einer P12-Well-Platte in 1 ml vollständiger Wachstumsmedien 24 h vor Infektionen.</li>
	<li>Ergänzen Sie das Medium mit 8 μg/ml Polybren und geben Sie 1 ml in jedes sterile 1,5 ml Röhrchen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die viralen Partikel mit 4 μL, 2 μL, 1 μL, 0,5 μL und 0,1 μL konzentrierten lentiviralen Partikeln in jedem der 1 ml polybrenenhaltigen Medien.</li>
	<li>Ersetzen Sie die Medien aus HEK293T-Zellen durch die Medien, die die angegebenen Mengen an lentiviralenPartikeln zusammen mit 8 μg/ml Polybren enthalten, und inkubieren Sie für 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21%O2.</li>
	<li>Am nächsten Tag wechseln Sie zu frischen Medien und setzen die Kultur für 72 h bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% CO 2 und 21% O2 fort.</li>
	<li>Nach 72 h die Zellen mit PBS waschen, bei 37 °C gemäß dem Protokoll des Herstellers trypsinisieren und in 1 ml PBS resuspendieren.</li>
	<li>Führen Sie die FACS-Zellsortierung mit einem Zellsortierer gemäß den Empfehlungen des Herstellers durch. Setzen Sie das Gate auf 0% GFP-positive Zellen mit nicht infizierten HEK293T-Zellen und zählen Sie 50.000 Ereignisse für jede Probe, um den Prozentsatz der positiven Zellen für jede virale Verdünnung zu bestimmen.</li>
	<li>Verwenden Sie nur die Volumina lentiviraler Partikel, die %GFP-positive Zellen im Bereich von 2% -20% ergeben, um den Titer der lentiviralen Partikel zu berechnen.</li>
</ol>5. Infektion von hES-Zellen und stabile Selektion
<ol><li>Waschen Sie die Zellen mit 2 ml PBS, die in jeder Vertiefung einer 6-Well-Zellkultur-Multiwell-Platte wachsen.</li>
	<li>Lösen Sie die Zellen von der Zellkulturplatte mit 1 ml 1x Zelldissoziationsreagenz durch Inkubation bei 37 °C für 5 min.</li>
	<li>Sammeln Sie die Zellen in DMEM/F12-Medien und zentrifugieren Sie bei 1.500 x g für 5 min bei Raumtemperatur, um das Zellpellet zu sammeln.</li>
	<li>Aspirieren, resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml und zählen Sie mit einem Hämozytometer.</li>
	<li>Machen Sie eine Zellsuspension mit 2 x 105 Zellen / ml vollständiger Wachstumsmedien, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI).</li>
	<li>Samen Sie 1 x 10 5 Zellen auf 50x verdünnten kompletten Basalmembran-matrixbeschichteten P24-Well-Platten in 500 μL kompletten Wachstumsmedien und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von5% CO 2 und 21%O2.
</li>
	<li>Am folgenden Tag hES-Zellen bei einer Multiplizität von Infektionen (MOI) von 10 mit 8 μg/ml Polybren infizieren und bei 37 °C für 8 h inkubieren.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische Wachstumsmedien (-RI) und setzen Sie die Kultur fort, bis die Zellen zu 90% konfluent sind.</li>
	<li>Beginnen Sie mit der Puromycin-Selektion (0,8 μg / ml), wenn die Zellen eine Konfluenz von 90% erreichen, was normalerweise 48-72 h nach der Infektion entspricht.</li>
	<li>Nachdem die Selektion abgeschlossen ist (normalerweise 4-6 Tage), teilen Sie die stabilen Zellen (1: 4) auf und erweitern Sie die Zellen für die Kryokonservierung und weitere Analyse.</li>
</ol>6. Transduktion von H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs)
HINWEIS: NPCs wurden von H9-Zellen unter Verwendung eines Dual-Smad-Hemmungsprotokolls abgeleitet, wie zuvorbeschrieben 19.
<ol><li>Kurz gesagt, behandeln Sie H9-Zellen mit Zelldissoziationsreagenz bei 37 ° C für 5 Minuten, um einzelne Zellen zu erzeugen und in vollständigen Wachstumsmedien zu resuspendieren, die mTeSR1 enthalten, ergänzt mit 10 ng / ml basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (bFGF), Penicillin / Streptomycin (P / S) und 10 μM ROCK-Inhibitor (RI). Samen auf 1:50 verdünnten Matrigel-beschichteten 6-Well-Zellkulturschalen bei einer Dichte von 60.000 Zellen/cm2 (Tag 0).</li>
	<li>Initiieren Sie die Differenzierung, wenn die Zellen eine Konfluenz von 95% -100% erreichen, indem Sie zu 100% KSR-Medien wechseln, die LDN193189 (200 nM) und SB431542 (10 μM) (Tag 1) enthalten.</li>
	<li>Wechseln Sie am Tag 2 erneut das Medium mit 100% KSR, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).</li>
	<li>Wechseln Sie am Tag 4 der Differenzierung zu einer Mischung aus KSR-Medium (75%) und N2-Medium (25%) mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM).</li>
	<li>Wechseln Sie von Tag 6 bis Tag 12 schrittweise auf 100% N2, ergänzt mit LDN193189 (200 nM), SB431542 (10 μM) und XAV939 (5 μM), indem Sie das N2-Medium täglich um 25% erhöhen und das Medium alle 2 Tage wechseln.</li>
	<li>Kulturtag 12 NPCs in N2:B27 Medien ergänzt um 20 ng/ml bFGF.</li>
	<li>Samen Sie 2 x 10 5 Zellen in jeder Vertiefung einer 1:50 verdünnten vollständigen Basalmembranmatrix-beschichteten P6-Platte in 2 ml NPCs-Kulturmedien und inkubieren Sie, damit sich die Zellenanheften können.</li>
	<li>Am nächsten Tag infizieren Sie die Zellen mit lentiviralen Partikeln bei einem MOI 6 in Gegenwart von 8 μg/ml Polybren.</li>
	<li>Ersetzen Sie nach 8 h die virushaltigen Medien durch frische NPC-Wachstumsmedien.</li>
	<li>Wiederholen Sie am nächsten Tag die Infektionen und wechseln Sie das Medium um 8 Uhr.</li>
	<li>Bewahren Sie die Zellen vor der Ernte zur weiteren Analyse 72 Stunden lang in Kultur auf.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt vorliegt.

Die Fähigkeit, Stammzellen für Studien- oder klinische Zwecke genetisch zu verändern, ist sowohl durch die Technologie als auch durch das grundlegende Verständnis der Biologie von hES-Zellen begrenzt. Techniken, die ein signifikantes Potenzial in Maus-ES-Zellen gezeigt haben, wie Liofektion und Elektroporation, sind für hES-Zellen nicht sehr effizient, die für die Genlieferung mit herkömmlichen Methoden notorisch schwierig sind20. Dieser Gedanke hat nicht nur zur Optimierung bestehender Techniken ...

Humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen), die aus der inneren Zellmasse der Blastozyste gewonnen werden, sind pluripotent und können unter In-vitro-Bedingungen in Abhängigkeit von äußeren Faktoren in verschiedene Zelltypen differenziert werden 1,2. Um das Potenzial von hES-Zellen voll auszuschöpfen, ist es unerlässlich, schnelle und zuverlässige Genabgabemethoden für diese Zellen zu haben. Herkömmlicherweise können die verwendeten Techniken grob in zwei Arten eingeteilt werden: nichtvirale und virale Gen-Delivery-Systeme 3,4. Die am häufigsten verwendeten nichtviralen Genabgabesysteme sind Lipofektion, Elektroporation und Nukleofektion. Nichtvirale Verabreichungssysteme sind vorteilhaft wegen weniger Insertionsmutationen und einer Gesamtabnahme der Immunogenität 5,6. Diese Methoden führen jedoch zu einer geringen Transfektionseffizienz und einer kurzen Dauer der transienten Genexpression, was eine große Einschränkung für Langzeitdifferenzierungsstudien darstellt7. Elektroporation führt zu besseren Transfektionseffizienzen im Vergleich zur Lipofektion; Es führt jedoch zu mehr als 50% Zelltod 8,9,10. Mit Hilfe der Nukleofektion können das Zellüberleben und die Transfektionseffizienz durch die Kombination von Lipofektion und Elektroporation verbessert werden, aber der Ansatz erfordert zellspezifische Puffer und spezielle Ausrüstung und wird daher für skalierte Anwendungen ziemlich kostspielig11,12.
Im Gegensatz dazu haben virale Vektoren verbesserte Transfektionseffizienzen sowie eine insgesamt geringe Zytotoxizität nach der Transduktion gezeigt. Darüber hinaus werden die gelieferten Gene stabil exprimiert und machen diese Methode daher ideal für Langzeitstudien13. Zu den am häufigsten verwendeten viralen Vektoren für die Genabgabe in hES-Zellen gehören lentivirale Vektoren (LVS), die eine Transduktionseffizienz von mehr als 80% unter Verwendung von Viruspartikeln mit hohem Titerergeben können 14,15. Lipofektion und CaPO4-Fällung gehören zu den am häufigsten verwendeten Methoden, um HEK293T-Zellen oder seine Derivate mit Gentransfervektoren zusammen mit Verpackungsplasmiden vorübergehend zu transfektieren, um lentivirale Partikelzu erhalten 16. Obwohl die Lipofektion zu einer guten Transfektionseffizienz und einer geringen Zytotoxizität führt, wird die Technik durch ihre Kosten behindert, und eine Skalierung auf lentivirale Partikel mit hohem Titer wäre sehr kostspielig. Die CaPO4-Fällung führt zu relativ ähnlichen Transfektionseffizienzen wie bei der Lipofektion. Obwohl kostengünstig, führt die CaPO 4-Fällung zu einem signifikanten Zelltod nach Transfektionen, was es schwierig macht, Batch-to-Batch-Variationen zu standardisieren undzu vermeiden 17. In diesem Szenario ist die Entwicklung einer Methode, die eine hohe Transfektionseffizienz, eine geringe Zytotoxizität und Kosteneffizienz bietet, entscheidend für die Herstellung von lentiviralen Partikeln mit hohem Titer, die in hES-Zellen verwendet werden sollen.
Polyethylenimin (PEI) ist ein kationisches Polymer, das HEK293T-Zellen mit hoher Effizienz ohne viel Zytotoxizität transfizieren kann und im Vergleich zu lipofektionsbasierten Methoden vernachlässigbare Kosten verursacht18. In dieser Situation kann PEI für skalierte Anwendungen der LVS-Produktion mit hohem Titer durch die Konzentration von lentiviralen Partikeln aus Kulturüberständen unter Verwendung verschiedener Techniken verwendet werden. Der vorgestellte Artikel beschreibt die Verwendung von PEI zur Transfizierung von HEK293T-Zellen und die lentivirale Vektorkonzentration mittels Ultrazentrifugation durch ein Saccharosekissen. Mit dieser Methode erhalten wir regelmäßig Titer weit über 5 x 107 IE / ml mit geringen Variationen. Die Methode ist einfach, unkompliziert und kostengünstig für skalierte Anwendungen zur Genabgabe an hES-Zellen und von hESCs abgeleitete Zellen.

<table><tbody><tr><td>2-Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen</td><td>31350010</td><td></td></tr><tr><td>38,5 ml, steril + zertifiziert frei offene dünnwandige ultraklare Röhrchen</td><td>Beckman Coulter</td><td>C14292</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>bFGF Rekombinantes</td><td>humanes Invitrogen</td><td>PHG0261</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin FRAC V</td><td>Invitrogen</td><td>15260037</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Basalmembranmatrix, LDEV-freies</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Cyclopamine</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>72074</td><td></td></tr><tr><td>DMEM-Medien</td><td>Invitrogen</td><td>11995073</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Nährstoffmischung F12&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DPBS w/o: Ca und Mg</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10270106</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH (14C10) Kaninchen mAb Antikörper</td><td>CST</td><td>2118S</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für sanfte Zelldissoziation</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>HyClone nicht essentielle Aminosäuren (NEAA) 100X Lösung</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30238,01</td><td></td></tr><tr><td>L Glutamin, 100X&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>2924190090</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH Polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>15707-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>L2HGDH shRNA</td><td>Macrogen</td><td></td><td>Seq: CGCATTCTTCATGTGAGAAAT</td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 kit</td><td>Thermo Fisher</td><td>L3000001</td><td></td></tr><tr><td>mTesR1 komplettes Medium</td><td>Stammzelltechnologien</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasales Medium 1X CTS</td><td>Invitrogen</td><td>A1371201</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 2 Supplement 100x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-11050</td><td></td></tr><tr><td>Neuropan 27 Supplement 50x</td><td>PAN Biotech</td><td>P07-07200</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin SOL</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>pLKO.1 TRC Vektor</td><td>Addgene</td><td>10878</td><td></td></tr><tr><td>pLL3.7 Vektor&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>11795</td><td></td></tr><tr><td>pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Reagenz für Polybrene-Infektionen</td><td>Sigma</td><td>TR1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin, verzweigt</td><td>Sigma</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>psPAX2.0</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>Purmorphamin</td><td>Tocris</td><td>4551/10</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>A1113802</tr><tr><td>ROCK-Inhibitor Y-27632 Dihydrochlorid&nbsp;</td><td>Tocris</td><td>1254</td><td></td></tr><tr><td>SB 431542</td><td>Tocris</td><td>1614/10</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,05% EDTA&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>25300062</td><td></td></tr><tr><td>XAV 939</td><td>Tocris</td><td>3748/10</td><td></td></tr></tbody></table>

lentiviral vermittelte abgabe von shrnas an hescs und npcs unter verwendung des kostengünstigen kationischen polymers polyethylenimin (pei)

Lentiviral Mediated Delivery of shRNAs to hESCs and NPCs Using Low-cost Cationic Polymer Polyethylenimine (PEI)

Das aktuelle Protokoll beschreibt die Verwendung von lentiviralen Partikeln für die Abgabe von Kurzhaarnadel-RNAs (shRNAs) sowohl an humane embryonale Stammzellen (hESCs) als auch an neurale Vorläuferzellen (NPCs), die von hESCs mit hoher Effizienz gewonnen werden. Lentivirale Partikel wurden durch Co-Transfizierung von HEK293T-Zellen unter Verwendung von Eintrittsvektoren (mit shRNAs) zusammen mit Verpackungsplasmiden (pAX und pMD2.G) unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) erzeugt. Viruspartikel wurden mittels Ultrazentrifugation konzentriert, was zu durchschnittlichen Titern über 5 x 107 führte. Sowohl hESCs als auch NPCs konnten mit diesen lentiviralen Partikeln mit hoher Effizienz infiziert werden, wie die Puromycin-Selektion und die stabile Expression in hES-Zellen sowie die vorübergehende GFP-Expression in NPCs zeigen. Darüber hinaus zeigte die Western-Blot-Analyse eine signifikante Verringerung der Expression von Genen, auf die shRNAs abzielen. Darüber hinaus behielten die Zellen ihre Pluripotenz sowie ihr Differenzierungspotenzial bei, was durch ihre anschließende Differenzierung in verschiedene ZNS-Linien belegt wird. Das aktuelle Protokoll befasst sich mit der Abgabe von shRNAs; Der gleiche Ansatz könnte jedoch für die ektopische Expression von cDNAs für Überexpressionsstudien verwendet werden.

Nach dem Gentransfer ist unweigerlich eine hohe Lebensfähigkeit von hES-Zellen erforderlich. Trotz der Bemühungen und der Optimierung von Protokollen zur Reduzierung des Zelltods nach der Elektroporation von hES-Zellen wird nach der Elektroporation dieser Zellen immer noch ein Zelltod von mehr als 50% beobachtet, zusammen mit einer niedrigen Transfektionseffizienz20. Der lentiviral vermittelte Gentransfer führt nicht nur zu einer hohen Effizienz des Gentransfers, sondern zeigt auch eine hohe Zelll...

Unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) produzierten wir lentivirale Partikel für die stabile Expression von shRNAs in H9-humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) und transienten H9-abgeleiteten neuralen Vorläuferzellen (NPCs) mit hoher Effizienz.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

The current protocol describes the use of lentiviral particles for the delivery of short hairpin RNAs (shRNAs) to both human embryonic stem cells (hESCs) ...

Die Transfektion von HEK293T-Zellen muss bei einer Konfluenz von 90% durchgeführt werden. Auch die Verwendung eines 0,45-Mikron-Low-Protein-Bindungsfilters für die lentivirale Vektorfiltration und die Verwendung eines Saccharosekissens für die Ultrazentrifugation sind unerlässlich. Beginnen Sie mit der Kultivierung von HEK293T-Zellen in DMEM-Medium mit 10% FBS und 1X Penicillin-Streptomycin bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff, bis die Zellen 90% Konfluenz erreichen, bevor sie zur Transfektion aussaatieren.Samen Sie viermal 10 auf die sechs Zellen in 10 Milliliter komplettem Wachstumsmedium in einer 100-Millimeter-Gewebekulturplatte und wachsen Sie über Nacht in einem befeuchteten Gewebekultur-Inkubator mit einer Atmosphäre von 5% Kohlendioxid und 21% Sauerstoff. Verdünnen Sie für jede Transfektion ein Milligramm pro Milliliter Plasmid-DNA-Bestände in einem Milliliter serumfreier DMEM-Medien in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, indem Sie das im Textmanuskript beschriebene Verhältnis von Eintritts- und Verpackungsplasmiden befolgen. Wirbeln Sie die Röhre für 10 Sekunden und drehen Sie sie bei Raumtemperatur

lentiviral-mediated-delivery-shrnas-to-hescs-npcs-using-low-cost

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Der Artikel beschreibt das Protokoll für ortsspezifische Transfektion von verscrambeltem Sequenz von siRNA in einer anhaftenden Säugerzellkultur mit Hilfe eines Mikroelektrodenfeldanordnung (MEA).

Hohe Effizienz, Site-spezifische Transfektion adhärenter Zellen mit siRNA mit Mikroelektroden-Arrays (MEA)

Quelle: Tagliafierro, L., et al. Lentivirale Vektorplattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-Editing-Werkzeugen in humane induzierte pluripotente Stammzell-abgeleitete Krankheitsmodelle. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video zeigt die lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen (NPCs) zur gezielten epigenetischen Modifikation von alpha-Synuclein, einem Schlüsselprotein bei der Parkinson-Krankheit. Das Protokoll ermöglicht eine Methyltransferase-vermittelte DNA-Methylierung,...

Lentivirale Transduktion von neuralen Vorläuferzellen zur epigenetischen Regulation der Alpha-Synuclein-Expression

In diesem Video demonstrieren wir eine Methode zur Transduktion von lentiviralen shRNA-Vektoren, um stabile Knockdown-Zelllinien in immortalisierten hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (iHSPCs) zu erhalten.

Short Hairpin RNA-vermittelter Gen-Knockdown in iHSPCs in vitro: Ein Lentivirus-basiertes shRNA-Expressionssystem zur Verabreichung in iHSPCs für den Knockdown der spezifischen Genexpression

Ein Protokoll für Nanopartikel Tracking-Analyse (NTA) und High-Throughput-Durchflusszytometrie, polymere Gentransfer Nanopartikel evaluieren beschrieben. NTA eingesetzt wird, um die Nanopartikel Teilchengrößenverteilung und das Plasmid pro Teilchenverteilung charakterisieren. High-throughput Durchflusszytometrie erlaubt die quantitative Transfektion Wirksamkeitsnachweis für eine Bibliothek der Gentransfer Biomaterialien.

Evaluation von polymeren Gene Delivery-Nanopartikeln durch Nanopartikel Tracking-Analyse und High-throughput Durchflusszytometrie

Lieferung bleibt die größte Herausforderung für die therapeutische Anwendung der small interfering RNA (siRNA). Dieses Protokoll schließt die Verwendung eines multifunktionellen und biokompatibel siRNA Abgabeplattform, bestehend aus Arginin und Polyethylenimin gepfropft porösen Siliciummikropartikel.

Poröses Silizium Mikropartikel für die Lieferung von siRNA-Therapeutika

Das Ziel dieses Protokolls ist es, kationische/anionische Liposomen mit einem Neuro-Targeting-Peptid als ZNS-Verabreichungssystem zu verwenden, damit siRNA die BHS passieren kann.  Die Optimierung eines Verabreichungssystems für Behandlungen wie siRNA würde mehr Behandlungsoptionen für Prionen und andere neurodegenerative Erkrankungen ermöglichen.

Abgabe von therapeutischen siRNA an das ZNS mit kationischen und anionische Liposome

Dieses Manuskript beschreibt die effiziente, nicht-virale Abgabe von miR-Zellen durch einen PEI / MNP-Vektor und ihre Magnetisierung an Endothelzellen. Somit kann zusätzlich zu genetischer Veränderung, ermöglicht dieser Ansatz für die magnetische Zellführung und MRI Nachweisbarkeit. Die Technik kann verwendet werden, um die Eigenschaften von therapeutischen Zellprodukten zu verbessern.

Vorbereitung und<em&gt; In Vitro</em&gt; Charakterisierung von Magnetized miR-modifizierten Endothelzellen

Hier beschreiben wir ein Protokoll für die Generation der kationischen Nanoliposomes, basiert auf der Methode der trocken-Film und eignet sich für die sichere und effiziente Bereitstellung von in-vitro- Boten-RNA transkribiert.

Generation von kationischen Nanoliposomes für die effiziente Bereitstellung von In-vitro- transkribiert Boten-RNA

Wir beschreiben eine Methode der Verwendung von Polyethyleneimine (PEI)-superparamagnetischen Eisenoxid-Nanopartikeln für transfecting Makrophagen mit SiRNA beschichtet. Diese Nanopartikel können effizient SiRNA zu Makrophagen in Vitro und in Vivo und Stille Ziel Genexpression liefern.

Polyethyleneimine beschichteten Eisenoxid-Nanopartikeln als Vehikel für die Lieferung von kleinen interferierende RNA an Makrophagen In Vitro und In Vivo

Gezielte DNA Epigenom Bearbeitung stellt eine leistungsstarke Therapieansatz. Dieses Protokoll beschreibt die Produktion, Reinigung und Konzentration der all-in-One Lentivirale Vektoren beherbergen das CRISPR-dCas9-DNMT3A Transgen für Epigenom-editing-Anwendungen in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen (HiPSC)-Neuronen abgeleitet.

Lentivirale Vektor-Plattform für die effiziente Bereitstellung von Epigenom-editing-Tools in menschlichen induzierten pluripotenten Stammzellen abgeleitet Krankheitsmodelle

Ein Protokoll zur Erstellung genmodifizierter menschlicher Pseudoislets aus dispergierten menschlichen Inselzellen, die durch Lentivirus mit kurzer Haarnadel-RNA (shRNA) transduziert werden, wird vorgestellt. Dieses Protokoll verwendet leicht verfügbare Enzym- und Kulturgefäße, kann leicht durchgeführt werden und produziert genetisch veränderte menschliche Pseudoislets, die für funktionelle und morphologische Studien geeignet sind.

Lentiviral vermittelte Gen-Silencing in humanem Pseudoislet in niedrigen Befestigungsplatten zubereitet

Erfahren Sie die lentivirale shRNA-Abgabe an hESCs und NPCs mit dem kostengünstigen kationischen Polymer Polyethylenimin. Diese Methode ermöglicht effiziente Gentransfer-Studien in der Stammzellforschung.

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI) (Video) | JoVE Journal

Lentiviral vermittelte Abgabe von shRNAs an hESCs und NPCs unter Verwendung des kostengünstigen kationischen Polymers Polyethylenimin (PEI)

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