Ein photodynamischer Ansatz zur Untersuchung der Funktion der intrazellulären Vesikelruptur
17. März 2023
Die AlPcS2a-vermittelte Chromophor-assistierte Laserinaktivierung (CALI) ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der raumzeitlichen Schädigung intrazellulärer Vesikel (IVs) in lebenden Zellen.
Die Endozytose von Vesikeln in Zytoplasie führt zur Bildung intrazellulärer Vesikel. Die Permeabilisierung der Vesikel aktiviert verschiedene Signalwege. Die chromophorgestützte Laserinaktivierung wird verwendet, um die Folgen einer intrazellulären Vesikelruptur zu untersuchen.
Eine räumliche und zeitliche Kontrolle der subzellulären Schädigung intrazellulärer Vesikel kann durch die Anpassung des Stehzustands und der Lichtbeleuchtung erreicht werden. Pflegen Sie zunächst die HeLa-Zellkultur in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS. Nachdem Sie die Zellen mit PBS gewaschen haben, trypsinisieren Sie die Zellen.
Anschließend resuspendieren Sie die Zellen in DMEM ergänzt mit 10%FBS. Verdünnen Sie 300 Nanogramm Gal3-GFP-Plasmid in 25 Mikrolitern reduziertem Serummedium. Fügen Sie dann 0,6 Mikroliter P3000-Reagenz hinzu.
Und vorsichtig mischen, gefolgt von Vortexing der Lösung. 0,45 Mikroliter Lipofectamine 3000 Reagenz in 25 Mikrolitern reduziertem Serummedium verdünnen und vorsichtig mischen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Dann verdünnte DNA und verdünntes Lipofectamin 3000 mischen und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nach dem Mischen des DNA-Lipofectamin-Gemischs werden die Zellen mit 300.000 suspendierten HeLa-Zellen und 200 Mikrolitern DMEM mit 10 % FBS auf dem zentralen Glasbereich einer 35-Millimeter-Glasknopfschale ausgesät. Um die Zellanheftung zu ermöglichen, inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im mit 5 % Kohlendioxid versorgten Inkubator für mindestens vier Stunden.
Verdünnen Sie AlPcS2a in DMEM, ergänzt mit 10 % FBS, um eine einmikromolare AlPcS2a-Lösung herzustellen. Das AlPcS2a-haltige Medium in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad vorwärmen und das Nährmedium durch das AlPcS2a-haltige Medium ersetzen. Inkubieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius im Inkubator, der über Nacht mit 5 % Kohlendioxid versorgt wird.
Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag zweimal mit PBS, um extrazelluläres AlPcS2a zu entfernen, nachdem Sie das Medium durch frisches Medium ersetzt haben. Vier Stunden lang bei 37 Grad Celsius inkubieren, damit sich Farbstoffreste entlang des endozytären Weges in den Lysosomen ansammeln können. Um einzelne Zellen durch Schädigung der Lysosomen zu manipulieren, stellen Sie die Kulturschale auf den Tisch eines konfokalen Mikroskops.
Verwenden Sie die 488-Nanometer- und 561-Nanometer-Laser für die Anregung von GFP bzw. AlPcS2a. Kreisen Sie eine fünf mal fünf Mikrometer große quadratische Region von Interesse auf den AlPcS2a-markierten Vesikeln ein, die zur Schädigung ausgewählt werden. Beleuchten Sie dann den interessierenden Bereich mit einem 633-Nanometer-Laser von 0,21 Milliwatt oder 70 Wiederholungen.
Beobachtung der Bildung von Gal3 puncta als Indikator für die Permeabilisierung der lysosomalen Membran. Die lysosomale Färbung mit AlPcS2a in HeLa-Zellen wurde mit kommerziell erhältlichen Markern durchgeführt und mit grünem Fluoreszenzfarbstoff positiv gefärbt. Lysosomen in TagRFP-Galectin3-exprimierten HeLa-Zellen wurden mit AlPcS2a gefärbt.
Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die AlPcS2a-basierte chromophorgestützte Laserinaktivierung in der Lage war, die lokale lysosomale Ruptur innerhalb der interessierenden Region zu kontrollieren, während der Rest der Lysosomen intakt blieb. Dieser Schritt ist wichtig, da die Inkubationszeit stehende Endosomen oder Lysosomen bestimmt. Zum Beispiel kann man die Größe von durch die Freisetzung von membranundurchlässigem Farbstoff bestimmen.
Es können auch pH-empfindliche Farbstoffe wie FITC-Dextran verwendet werden, um Endosomen und Lysosomen zu unterscheiden. Diese Technik ist nützlich, um die nachgelagerten Auswirkungen der intrazellulären Bläschenmembranruptur zu beginnen. Und es gibt nachgelagerte Effekte in verschiedenen Situationen.
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Übersicht
Die AlPcS 2a-vermittelte chromophorassistierte Laserinaktivierung (CALI) wird verwendet, um die räumlich-zeitliche Schädigung intrazellulärer Vesikel in lebenden Zellen zu untersuchen. Diese Technik ermöglicht eine präzise Kontrolle über subzelluläre Schäden und liefert Erkenntnisse über die Folgen des Vesikelbruchs.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Live-Cell-Bildgebung
Hintergrund
- Die Endozytose führt zur Bildung intrazellulärer Vesikel.
- Die Permeabilisierung der Vesikel aktiviert verschiedene Signalwege.
- CALI ist eine Methode, um die Auswirkungen des Vesikelbruchs zu untersuchen.
- Räumliche und zeitliche Kontrolle wird durch Lichtbeleuchtung erreicht.
Zweck der Studie
- Untersuchung der Dynamik der Schädigung intrazellulärer Vesikel.
- Verständnis der durch Vesikelruptur aktivierten Signalwege.
- Verbesserung von Techniken zur Untersuchung von Wechselwirkungen in lebenden Zellen.
Verwendete Methoden
- Kultivierung von HeLa-Zellen in DMEM mit 10 % FBS.
- Waschen der Zellen mit PBS vor der Experimentierung.
- Trypsinisierung der Zellen zur Analyse.
- Anwendung von CALI zur Induktion lokalisierten Schadens.
Hauptergebnisse
- Nachweis einer effektiven Kontrolle über Vesikelschäden.
- Identifizierung zentraler Signalwege, die nach dem Bruch aktiviert werden.
- Bestätigung der Anwendung von CALI in lebenden Zellstudien.
- Gewinnung von Erkenntnissen über die Mechanismen der Vesikelfunktion.
Schlussfolgerungen
- CALI ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung intrazellulärer Dynamiken.
- Die Ergebnisse vertiefen das Verständnis von vesikelbezogenen Signalwegen.
- Zukünftige Studien können auf diesen Methoden aufbauen, um tiefere Einblicke zu gewinnen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Mithilfe der chromophorassistierten Laserinaktivierung (CALI) lässt sich die Ruptur intrazellulärer Vesikel räumlich und zeitlich präzise induzieren und bietet somit ein kontrolliertes System zur Untersuchung von Membranpermeabilisierungsereignissen. Dieser Ansatz unterstützt die mechanistische Risikominderung und Zielstrukturenvalidierung, indem er eine gezielte Manipulation und Überwachung der Integrität von Endosomen und Lysosomen in lebenden Zellen ermöglicht. Die Methode erhöht die Vorhersagesicherheit in der frühen Entdeckungsphase, indem sie die Vesikelruptur mit nachgeschalteten Signalwegen und molekularen Rekrutierungen verknüpft.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die direkte Untersuchung der Integrität der Vesikelmembran und ihrer Rolle in Signalwegen.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung der Rekrutierung glykanbindender Proteine, wie Galectin-3, nach Vesikelruptur.
- Erleichtert die mechanistische Risikominderung, indem die Effekte einer gezielten Permeabilisierung von Organellen isoliert werden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet eine Plattform zur Entwicklung quantitativer, bildbasiierter Assays zur Überwachung der Vesikelruptur und des molekularen Recruitments.
- Unterstützt die Assay-Standardisierung durch kontrollierte, lokal begrenzte Induktion der Membranpermeabilisierung.
- Ermöglicht die reproduzierbare Bewertung der Wirkung von Substanzen auf die Stabilität von Endosomen und Lysosomen.
Translationale und präklinische Forschung
- Erfüllt die Anforderungen krankheitsrelevanter Modelle, bei denen die Vesikelintegrität zelluläre Signalgebung und Pathologie beeinflusst.
- Unterstützt die kontinuierliche Übertragung von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem downstream gerichtete Effektstudien von Vesikelrupturen ermöglicht werden.
- Erleichtert risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung, indem mechanistische Einblicke in zelluläre Reaktionen bereitgestellt werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieser photodynamische Ansatz integriert sich in die Entdeckungs- bis präklinische Kontinuum, indem er die hypothesengetriebene Manipulation und Erfassung von Vesikelrupturereignissen ermöglicht.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung zur Rolle der Vesikelpermeabilisierung bei Signalgebung und Proteindrekrutierung.
- Screening: Liefert quantitative, reproduzierbare bildgebende Ergebnisse für die Assay-Entwicklung und die Evaluierung von Substanzen.
- Analytik: Bietet messbare Endpunkte wie die Bildung von Galectin-3-Punkten und die Freisetzung von Farbstoffen für den vergleichenden Analysenansatz.
- Translationale Forschung: Verbindet mechanistische Erkenntnisse mit krankheitsrelevanten zellulären Modellen, bei denen ein Vesikelbruch eine Rolle spielt.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine wiederverwendbare, modulare Plattform zur Untersuchung von Membrandyamik in verschiedenen Zelltypen und unter unterschiedlichen Bedingungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen bei Studien zur Vesikel-vermittelten Signalübertragung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Induktion und Messung des Vesikelbruchs, um reproduzierbare Ergebnisse zu erzielen.
- Strategischer Wert: Unterstützt Go/No-Go-Entscheidungen, indem die funktionellen Folgen der Membranpermeabilisierung geklärt werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Zielstrukturen und Signalwegen, die von der Vesikelintegrität beeinflusst werden.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Live-Cell-Bildgebung und photodynamischen Manipulation.
- Benötigt Zugang zu konfokaler Mikroskopie und Laserbeleuchtungsinfrastruktur.
- Setzt eine standardisierte Vorgehensweise bei Bildgebung und Analyseprotokollen über Teamgrenzen hinweg voraus.
- Anpassbar an verschiedene Zelllinien und Organellenmarker mit geeigneten Kontrollen.
- Abhängig von der genauen Kalibrierung der Laserparameter und Farbstoffkonzentrationen zur Reproduzierbarkeit.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:44
Transfection and AlPcS2a Staining
3:00
Sample Imaging and Light Illumination
3:47
Results: AlPcS2a-Mediated Chromophore‐Assisted Laser Inactivation for Studying patiotemporal Damage of Intracellular Vesicles in Live Cells
4:25
Conclusion
