Name: Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 55 s
Description: Erfahren Sie die Rekonstitution membrangebundener Aktomyosin-Netzwerke auf gestützten Lipiddoppelschichten für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die sequenzielle Proteinzugabe ohne Netzwerkstörung und liefert Einblicke in Zytoskelettdynamik.

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Diese Arbeit wurde vom AXA Forschungsfonds und dem Warwick-Wellcome Quantitative Biomedicine Programme (Wellcome ISSF, RMRCB0058) für DVK, NCBS-TIFR für AB und ST und dem Wellcome-DBT Margdarshi Fellowship (IA/M/15/1/502018) für SM unterstützt. DVK dankt auch der Biophysikalischen Gesellschaft für die Ermöglichung der virtuellen Netzwerkveranstaltung "Herausforderungen beim Verständnis von Mehrkomponenten-Zytoskelettnetzwerken von der molekularen bis zur mesoskala", was zur Erstellung dieser Protokollsammlung beigetragen hat.

<ol><li>Köster, D. V., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+actin+and+the+plasma+membrane%3A+Inextricably+intertwined%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cortical actin and the plasma membrane: Inextricably intertwined.</a> Current Opinion in Cell Biology. 38, 81-89 (2016).</li>
<li>Rao, M., Mayor, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+organization+of+membrane+constituents+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Active organization of membrane constituents in living cells.</a> Current Opinion in Cell Biology. 29, 126-132 (2014).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lipid+bound+actin+meshwork+organizes+liquid+phase+separation+in+model+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A lipid bound actin meshwork organizes liquid phase separation in model membranes.</a> eLife. 3, 01671(2014).</li>
<li>Das, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stratification+relieves+constraints+from+steric+hindrance+in+the+generation+of+compact+actomyosin+asters+at+the+membrane+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Stratification relieves constraints from steric hindrance in the generation of compact actomyosin asters at the membrane cortex.</a> Science Advances. 6 (11), (2020).</li>
<li>Köster, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Actomyosin+dynamics+drive+local+membrane+component+organization+in+an+in+vitro+active+composite+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Actomyosin dynamics drive local membrane component organization in an in vitro active composite layer.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 113 (12), 1645-1654 (2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Heinemann, F., Chwastek, G., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+design+of+MACs+%28minimal+actin+cortices%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cytoskeleton%22%5BJournal%5D)">The design of MACs (minimal actin cortices).</a> Cytoskeleton. 70 (11), 706-717 (2013).</li>
<li>Murrell, M., Thoresen, T., Gardel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+contractile+actomyosin+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of contractile actomyosin arrays.</a> Methods in Enzymology. 540, 265-282 (2014).</li>
<li>Mosby, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+II+filament+dynamics+in+actin+networks+revealed+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Myosin II filament dynamics in actin networks revealed with interferometric scattering microscopy.</a> Biophysical Journal. 118 (8), 1946-1957 (2020).</li>
<li>Seara, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Entropy+production+rate+is+maximized+in+non-contractile+actomyosin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Entropy production rate is maximized in non-contractile actomyosin.</a> Nature Communications. 9 (1), 4948(2018).</li>
<li>Linsmeier, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disordered+actomyosin+networks+are+sufficient+to+produce+cooperative+and+telescopic+contractility%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Disordered actomyosin networks are sufficient to produce cooperative and telescopic contractility.</a> Nature Communications. 7, 12615(2016).</li>
<li>Vogel, S. K., Petrasek, Z., Heinemann, F., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+motors+fragment+and+compact+membrane-bound+actin+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Myosin motors fragment and compact membrane-bound actin filaments.</a> eLife. 2, 00116(2013).</li>
<li>Ditlev, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+composition-dependent+molecular+clutch+between+T+cell+signaling+condensates+and+actin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A composition-dependent molecular clutch between T cell signaling condensates and actin.</a> eLife. 8, 42695(2019).</li>
<li>Banjade, S., Rosen, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+transitions+of+multivalent+proteins+can+promote+clustering+of+membrane+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Phase transitions of multivalent proteins can promote clustering of membrane receptors.</a> eLife. 3, 04123(2014).</li>
<li>Heinemann, F., Vogel, S. K., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lateral+membrane+diffusion+modulated+by+a+minimal+actin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Lateral membrane diffusion modulated by a minimal actin cortex.</a> Biophysical Journal. 104 (7), 1465-1475 (2013).</li>
<li>Vogel, S. K., Greiss, F., Khmelinskaia, A., Schwille, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+lipid+domain+organization+by+a+biomimetic+contractile+actomyosin+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Control of lipid domain organization by a biomimetic contractile actomyosin cortex.</a> eLife. 6, 24350(2017).</li>
<li>Block, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brownian+motion+at+lipid+membranes%3A+A+comparison+of+hydrodynamic+models+describing+and+experiments+quantifying+diffusion+within+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Brownian motion at lipid membranes: A comparison of hydrodynamic models describing and experiments quantifying diffusion within lipid bilayers.</a> Biomolecules. 8 (2), 30(2018).</li>
<li>JoVE, JoVE. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((JoVE+Methods+Collection.+In+vitro+reconstitution+of+cytoskeleton+networks+for+biomaterials%2C+biophysics+and+active+matter+research%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">JoVE Methods Collection. In vitro reconstitution of cytoskeleton networks for biomaterials, biophysics and active matter research.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Pardee, J. D., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+muscle+actin%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Purification of muscle actin.</a> Methods in Enzymology. 85, 164-181 (1982).</li>
<li>Spudich, J. A., Watt, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regulation+of+rabbit+skeletal+muscle+contraction.+I.+Biochemical+studies+of+the+interaction+of+the+tropomyosin-troponin+complex+with+actin+and+the+proteolytic+fragments+of+myosin%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The regulation of rabbit skeletal muscle contraction. I. Biochemical studies of the interaction of the tropomyosin-troponin complex with actin and the proteolytic fragments of myosin.</a> Journal of Biological Chemistry. 246 (15), 4866-4871 (1971).</li>
<li>Pollard, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+purification+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Myosin purification and characterization.</a> Methods in Cell Biology. 24, 331-371 (1982).</li>
<li>JoVE Science Education Database. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Separating+protein+with+SDS-PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Separating protein with SDS-PAGE.</a> Journal of Visualized Experiments. , Cambridge, MA. (2022).</li>
<li>Bieling, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((WH2+and+proline-rich+domains+of+WASP-family+proteins+collaborate+to+accelerate+actin+filament+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22The+EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">WH2 and proline-rich domains of WASP-family proteins collaborate to accelerate actin filament elongation.</a> The EMBO Journal. 37 (1), 102-121 (2018).</li>
<li>Shrivastava, R., Köster, D., Kalme, S., Mayor, S., Neerathilingam, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tailor-made+ezrin+actin+binding+domain+to+probe+its+interaction+with+actin+in-vitro%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Tailor-made ezrin actin binding domain to probe its interaction with actin in-vitro.</a> PLoS One. 10 (4), 0123428(2015).</li>
<li>Nye, J. A., Groves, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+control+of+histidine-tagged+protein+surface+density+on+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Kinetic control of histidine-tagged protein surface density on supported lipid bilayers.</a> Langmuir. 24 (8), 4145-4149 (2008).</li>
<li>Honigmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scanning+STED-FCS+reveals+spatiotemporal+heterogeneity+of+lipid+interaction+in+the+plasma+membrane+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Scanning STED-FCS reveals spatiotemporal heterogeneity of lipid interaction in the plasma membrane of living cells.</a> Nature Communications. 5, 5412(2014).</li>
<li>Selden, N. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+programmed+cell+adhesion+with+membrane-anchored+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Chemically programmed cell adhesion with membrane-anchored oligonucleotides.</a> Journal of the American Chemical Society. 134 (2), 765-768 (2012).</li>
<li>Seu, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+surface+treatment+on+diffusion+and+domain+formation+in+supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysical+Journal%22%5BJournal%5D)">Effect of surface treatment on diffusion and domain formation in supported lipid bilayers.</a> Biophysical Journal. 92 (7), 2445-2450 (2007).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K., DiBenedetto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+equation+to+extract+diffusion+coefficients+from+confocal+FRAP+data%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Simplified equation to extract diffusion coefficients from confocal FRAP data.</a> Traffic. 13 (12), 1589-1600 (2012).</li>
<li>Kang, M., Day, C. A., Kenworthy, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+computational+framework+for+D%28t%29+from+Fluorescence+Recovery+after+Photobleaching+data+reveals+various+anomalous+diffusion+types+in+live+cell+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">A novel computational framework for D(t) from Fluorescence Recovery after Photobleaching data reveals various anomalous diffusion types in live cell membranes.</a> Traffic. 20 (11), 867-880 (2019).</li>
<li>Lorén, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+recovery+after+photobleaching+in+material+and+life+sciences%3A+Putting+theory+into+practice%5BTitle%5D)+AND+%22Quarterly+Reviews+of+Biophysics%22%5BJournal%5D)">Fluorescence recovery after photobleaching in material and life sciences: Putting theory into practice.</a> Quarterly Reviews of Biophysics. 48 (3), 323-387 (2015).</li>
<li>Alvarado, J., Sheinman, M., Sharma, A., MacKintosh, F. C., Koenderink, G. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+motors+robustly+drive+active+gels+to+a+critically+connected+state%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Molecular motors robustly drive active gels to a critically connected state.</a> Nature Physics. 9 (7), 1-7 (2013).</li>
<li>Andrecka, J., Spillane, K. M., Ortega-Arroyo, J., Kukura, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+and+control+of+Supported+lipid+bilayer+formation+with+interferometric+scattering+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Direct observation and control of Supported lipid bilayer formation with interferometric scattering microscopy.</a> ACS Nano. 7 (12), 10662-10670 (2013).</li>
<li>Lin, W. -C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supported+membrane+formation%2C+characterization%2C+functionalization%2C+and+patterning+for+application+in+biological+science+and+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Supported membrane formation, characterization, functionalization, and patterning for application in biological science and technology.</a> Current Protocols in Chemical Biology. 2 (4), 235-269 (2010).</li>
<li>Richter, R. P., Bérat, R., Brisson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+solid-supported+lipid+bilayers%3A+An+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of solid-supported lipid bilayers: An integrated view.</a> Langmuir. 22 (8), 3497-3505 (2006).</li>
<li>Sapuri-Butti, A. R., Butti, R. C., Parikh, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+supported+membranes+on+topographically+patterned+polymeric+elastomers+and+their+applications+to+microcontact+printing%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Characterization of supported membranes on topographically patterned polymeric elastomers and their applications to microcontact printing.</a> Langmuir. 23 (25), 12645-12654 (2007).</li>
<li>Leptihn, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Constructing+droplet+interface+bilayers+from+the+contact+of+aqueous+droplets+in+oil%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Constructing droplet interface bilayers from the contact of aqueous droplets in oil.</a> Nature Protocols. 8 (6), 1048-1057 (2013).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Moghimianavval, H., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulated+actomyosin+patterns+drive+cell-like+membrane+shape+changes%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">Encapsulated actomyosin patterns drive cell-like membrane shape changes.</a> iScience. 25 (5), 104236(2022).</li>
<li>Bashirzadeh, Y., Wubshet, N., Litschel, T., Schwille, P., Liu, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+encapsulation+of+reconstituted+cytoskeleton+inside+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid encapsulation of reconstituted cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles.</a> Journal of Visualized Experiments. (177), e63332(2021).</li>
<li>Murrell, M., Chen, S., Sun, Z. G. In vitro reconstitution of actin cytoskeleton inside giant unilamellar vesicles. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMurrell%2C+M+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22">Journal of Visualized Experiments</a>. , (2022).</li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte zu erklären.

Dieses Protokoll bietet eine vielseitige Plattform und einen Ausgangspunkt für Designexperimente zur Untersuchung der Membran-Kortex-Schnittstelle von Zellen. Kritische Schritte sind die Herstellung sauberer Objektträger, die Verwendung frischer Lipide für eine effiziente SUV-Bildung (beides beeinflusst die Qualität von SLBs) und die Verwendung von frisch recycelten Myosin-II-Proteinen für die dynamische Reorganisation von Aktinfilamenten. Bei der Abbildung von Dynamiken über einen langen Zeitraum ist es sehr wichtig, ein Sauerstofffängersystem zu integrieren (z. B. Protocatechusäure und Protocatechuate 3 4-Dioxygenase 5,31).
Das Open-Chamber-Design ermöglicht die sequentielle Zugabe von Komponenten zu einem bestehenden System, ohne Lipidflüsse zu induzieren. Dies kann ein wichtiger Vorteil gegenüber häufig verwendeten, geschlossenen Kammeransätzen sein oder mit verkapselten Proteinen in Liposomenarbeiten 36. Konträre Effekte wie proteininduzierte Membranverformungen können mit glasadsorbierten Lipiddoppelschichten nicht untersucht werden.
Die Lipiddoppelschichten können mit einer Vielzahl von Lipidzusammensetzungen gebildet werden. Es beginnt mit der Adsorption der Lipidvesikel an die hydrophile Glasoberfläche, gefolgt von entweder spontaner Vesikelruptur aufgrund von Oberflächen-Vesikel und direkten Vesikel-Vesikel-Wechselwirkungen oder die adsorbierten Vesikel erreichen eine kritische Abdeckung, nach der ein kleiner Teil der Vesikel reißt und aktive Kanten bildet, was schließlich zur Doppelschichtbildung führt32 . Neben Glas können verschiedene Substrate verwendet werden, um gestützte Lipiddoppelschichten zu bilden, wie z.B. Glimmer (z.B. für die Rasterkraftmikroskopie), weiche Substrate (z.B. Poly-di-methyl-siloxan), Polymerpolster33,34,35, die sich zwischen Löchern von Elektronenmikroskopiegittern 14 spannen. Tröpfchengrenzflächendoppelschichten sind eine weitere interessante Methode zur Erzeugung stabiler, freistehender Lipiddoppelschichten36. Der Einschluss von Acto-Myosin-Netzwerken in Vesikel oder Emulsionen ist eine sehr leistungsfähige Methode, um dieses minimale System in einer zellähnlichen Geometrie37,38 zu untersuchen, und die an anderer Stelle39 ausführlich beschrieben wird.

Die Plasmamembran einer lebenden tierischen Zelle interagiert ständig mit dem benachbarten Aktinzytoskelett, und zusammen bilden sie ein aktives Verbundmaterial, das eine Vielzahl zellulärer Funktionen erfüllt 1,2. Um Prozesse an dieser Lipidmembran-Aktin-Grenzfläche zu untersuchen, hat sich die Rekonstitution von Zytoskelettnetzwerken auf gestützten Lipiddoppelschichten (SLBs) als sehr hilfreich erwiesen. Dieser minimale Systemansatz ermöglicht die präzise Kontrolle der Komponenten des Zytoskelett-Netzwerks und der Lipidzusammensetzung. Im Vergleich zu den freistehenden Lipidmembranen riesiger unilamellärer Vesikel ermöglicht die planare Geometrie von SLBs den effizienten Einsatz modernster Mikroskopietechniken wie Super-Resolution3,4, Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)5,6,7 oder interferometrische Streuung 8 Untersuchung der räumlichen Organisation und Dynamik von Zytoskelettnetzwerken. TIRF bietet den höchsten Kontrast für fluoreszierend markierte Komponenten, da das Signal von ungebundenen markierten Molekülen in der Lösung, die zum Hintergrundsignal beitragen, minimal ist.
Hier beschreiben wir ein grundlegendes Protokoll für die Bildung von Actomyosin-Netzwerken, die an unterstützte Lipiddoppelschichten gebunden sind, die in der Praxis weit verbreitet sind, um die Physik aktiver, quasi-2D-Netzwerke 9,10,11 und ihre Wirkung auf die Membranorganisation 3,5,12,13,14,15,16 zu untersuchen (Abbildung 1 ). Dieser Ansatz ist nicht auf Aktin-basierte Netzwerke beschränkt, sondern kann auch leicht angepasst werden, um Mikrotubuli, Zwischenfilamente oder zusammengesetzte Netzwerke gemischter Natur zu erforschen und eine Vielzahl von Wechselwirkungen zwischen Lipidmembranproteinen und Zytoskelettkomponenten mit oberflächensensitiven Mikroskopiemethoden zu untersuchen.
Um dieses Protokoll fokussiert zu halten, haben wir eine detaillierte Beschreibung der Reinigung und Markierung von Aktin- und Myosinproteinen oder Details zur Abstimmung und Kontrolle der Kontraktilität und Organisation von Actomyosin-Netzwerken ausgeschlossen. Man sollte auf andere Protokolle verweisen, die neben diesem in der JoVE Methods Collection, In Vitro Reconstitution of Cytoskeleton Networks for Biomaterials, Biophysics and Active Matter Research17 veröffentlicht sind.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung des in vitro Aktin-Membran-aktiven Verbundsystems. Erstellt mit Biorender. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>

<table><tbody><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N- (Lissamin, Rhodamin, B-Sulfonyl)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>810158</td><td>16:0 RhoPE</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-[(N-(5-amino-1-carboxypentyl)iminodiacetic acid)-succinyl] (Nickelsalz)</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>790404</td><td>DGS-NTA-Ni2+</td></tr><tr><td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>, Avanti Polare Lipide</td><td>850375</td><td>DOPC</td></tr><tr><td>1,2-Dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholin</td><td>Avanti Polare Lipide</td><td>850355</td><td>DPPC</td></tr><tr><td>Braunglasfläschchen</td><td>ThermoFisher</td><td>B7990-2A</td><td></td></tr><tr><td>ATP Dinatriumsalz</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A26209</td><td></td></tr><tr><td>Attofluor-Zellkammer</td><td>ThermoFisher</td><td>A7816</td><td></td></tr><tr><td>Badsonicator</td><td>GT Sonic</td><td>1860QTS</td><td></td></tr><tr><td>Beta-Kasein</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6905</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>12135</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>650471</td><td>alternativ von Electron Microscopy Sciences,</td></tr><tr><td>50980296 Deckgläser, #1, 25 mm Durchmesser, Gold Seal</td><td>Harvard Apparatur</td><td>64-0705B</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser, #1, 40x22 mm, Gold Seal</td><td>ThermoFisher</td><td>48404-031</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td>G12635</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Himedia</td><td>MB130</td><td></td></tr><tr><td>Gasdichte Glasspritzen, mit abnehmbarer Nadel, stumpf, Volumen 10 & Mikro; L, 100 &Mikro; L, 500 &Mikro; L</td><td>Hammilton</td><td>1700 Serie</td><td></td></tr><tr><td>Hellmanex III</td><td>Hellma Analytics</td><td>Z805939</td><td>Reinigungslösung</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Himedia</td><td>RM380</td><td></td></tr><tr><td>KaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G13405</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>ThermoFisher</td><td>G13305</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G26708</td><td></td></tr><tr><td>Lipid-Extruder</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>61000-1EA</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher</td><td>G15535</td><td></td></tr><tr><td>Microtip</td><td>Ultraschallgerät Sonics</td><td>VC750</td><td>3 mm Spitzendurchmesser</td></tr><tr><td>Na2CO3</td><td>ThermoFisher</td><td>G15955</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Himedia</td><td>GRM853</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>ThermoFisher</td><td>G15825</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>ThermoFisher</td><td>G27815</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Ti Eclipse TIRF Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td>Mit einer TIRF-Einheit, die über eine polarisationserhaltende Glasfaser mit einem monolithischen Laserkombinierer MLC400 von Agilent verbunden ist, mit mehreren Laserlinien mit einem 100X, 1,45 NA Nikon Ölobjektiv mit zwei 512 x 512 Pixel EMCCD-Kameras (Photometrics Evolve 512) mit einem 100X, 1,45 NA Nikon Ölobjektiv mit zwei 512 x 512 Pixel EMCCD-Kameras (Photometrics Evolve 512)</td></tr><tr><td>NOA88</td><td>Norland Products</td><td>8801</td><td></td></tr><tr><td>PTFE-beschichtete Pinzette Style #2A</td><td>Struktursonde</td><td>0S2AT-XD</td><td></td></tr><tr><td>Gekühlte Mikrozentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>ThermoFisher</td><td>G15925</td><td></td></tr><tr><td>UV-Strahler</td><td>Novascan</td><td>PSD PRO-UV</td><td>benötigt Vakuum und O2 Versorgung</td></tr></tbody></table>

rekonstitution membrangebundener minimaler aktinkortices auf gestützten lipiddoppelschichten

Reconstitution of Membrane-Tethered Minimal Actin Cortices on Supported Lipid Bilayers

Die Oberfläche einer lebenden Zelle bietet eine vielseitige aktive Plattform für zahlreiche zelluläre Prozesse, die aus dem Zusammenspiel der Plasmamembran mit dem darunter liegenden Aktinkortex entstehen. In den letzten Jahrzehnten haben sich rekonstituierte, minimale Systeme, die auf unterstützten Lipiddoppelschichten in Kombination mit Aktinfilamentnetzwerken basieren, als sehr hilfreich erwiesen, um grundlegende Mechanismen und Konsequenzen membrangebundener Aktinnetzwerke zu entschlüsseln und die Funktionen einzelner membranassoziierter Proteine zu untersuchen. Hier beschreiben wir, wie solche aktiven Verbundsysteme in vitro rekonstruiert werden können, die aus flüssigkeitsgestützten Lipiddoppelschichten bestehen, die über membranassoziierte Aktin-bindende Proteine an dynamische Aktinfilamente und Myosinmotoren gekoppelt sind, die leicht über die Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie beobachtet werden können. Ein Open-Chamber-Design ermöglicht es, das System Schritt für Schritt zusammenzubauen und viele Parameter wie Linkerproteinkonzentration, Aktinkonzentration, Aktinfilamentlänge, Aktin/Myosin-Verhältnis sowie ATP-Spiegel systematisch zu steuern. Schließlich diskutieren wir, wie die Qualität des Systems kontrolliert werden kann, wie häufig auftretende Probleme erkannt und behoben werden können und einige Einschränkungen dieses Systems im Vergleich zur lebenden Zelloberfläche.

Zur Darstellung wird hier ein typisches Postbleichprofil aus dem 1. Bild nach dem Photobleaching (Bild bei t = 0 s in Abbildung 3A) und dessen Anpassung an folgende Funktion28 (siehe Abbildung 6A) gezeigt:
<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq04.jpg" style="margin: auto;">
Der Wert von r e (23,94 μm), der durch die Anpassung an diese Kurve berechnet wird, ist dem in Schritt 2.8.4 berechneten Wert von r e sehr ähnlich. (23,24 μm). Hier ist K ein Bleichtiefenparameter, der direkt von F0 geschätzt werden kann (beschrieben in Schritt 2.8.4.). In ähnlicher Weise zeigt Abbildung 6B das Wiederherstellungsprofil und seine Anpassung an die folgende Funktion28:
<img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/63968/63968eq05.jpg" style="margin: auto;">
Wir finden, dass der angepasste Wert des Diffusionskoeffizienten 1,34 μm 2/s beträgt, ein Wert, der eng mit dem Wert von 1,39 μm 2/s übereinstimmt, der nach der Formel in Schritt2.8.4 berechnet wird. Hier steht MF für den mobilen Anteil der Lipiddoppelschicht, der den Anteil der gebleichten Population darstellt, der sich erholt. Die Mobilität lipidverankerter Moleküle hängt natürlich von der Lipidzusammensetzung und ihrem physikalischen Zustand (Flüssig- oder Gelphase) ab. Für unsere Experimente mit DOPC-basierten Lipidmembranen sollte die Mobilität &gt;1 μm2/s betragen, und die mobile Fraktion sollte nicht kleiner als 0,9 sein, um eine gute Lipiddoppelschicht anzuzeigen. Wir empfehlen die Verwendung der manuellen anpassungsfreien Methode für einen schnellen Test der Qualität und Beweglichkeit der Doppelschicht. Die Anpassungsmethode kann bei der Automatisierung der Analyse für viele FRAP-Kurven nützlich sein. Wenn man ein anspruchsvolleres FRAP-Experiment durchführen möchte, um die Diffusion im System systematisch zu charakterisieren, empfehlen wir dem Leser diesen Review von Lorén et al.30, um mehr Details zu Anpassungsmodellen und möglichen Fallstricken im Versuchsdesign zu erhalten.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig06.jpg"> Abbildung 6: Quantifizierung des Diffusionskoeffizienten von Lipiddoppelschichten. (A) Linienprofil des ersten Bildes nach dem Photobleichen (t = 0 s in Abbildung 3A) und seine Anpassung an Gleichung 4 zur Berechnung des effektiven Bleichradius. (B) Das Wiederfindungsprofil des gebleichten Bereichs und seine Anpassung an Gleichung 5 zur Berechnung des Diffusionskoeffizienten und des mobilen Anteils. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ein typisches Ergebnis der oben beschriebenen Experimente, das den dynamischen Aufbau und die Organisation eines Acto-Myosin-Netzwerks zeigt, das auf einer durch TIRF-Mikroskopie abgebildeten unterstützten Lipiddoppelschicht verknüpft ist, ist in Abbildung 7 und Supplementary Video S1 dargestellt.
Abbildung 7 zeigt eine Bildmontage des Linkerproteins F-Aktin und Myosin-II.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/63968/63968fig07.jpg"> Abbildung 7: Kontraktile Actomyosinflüsse treiben die lokale Clusterbildung des Membran-Aktin-Linkerproteins HYE an. TIRF-Schnappschüsse von HYE (YFP-markiert), Aktinfilamenten (markiert mit Atto-635-Malemid) und Myosin-II-Filamenten (markiert mit Atto-565-Malemid) nach Zugabe von Myosin II zu einem SLB, das HYE und F-Aktin enthält. Die Zeit ist oben angegeben: 0 min ist unmittelbar bevor fluoreszierende Myofilamente im TIRF-Feld erscheinen. HYE und F-Aktin werden vor der Myosin-Addition homogen über die Lipiddoppelschicht verteilt (0 min). Die Myosinaktivität induziert kontraktile Actomyosin-Ströme, die im stationären Zustand (15 min) zu asterartigen Strukturen austreten und die lokale Clusterbildung der gekoppelten Membrankomponente (HYE) vorantreiben. Die unterste Zeile ist eine Verschmelzung von Aktin- (gelb) und Myosin-II-Bildern (Magenta), die die Organisation von Aktin und Myosin zu verschiedenen Zeitpunkten zeigen. Die Bilder, die bei der Erstellung dieser Montagen verwendet wurden, wurden in Fidschi für Hintergrundsignale, ungleichmäßige Intensitätsmuster und translatorische Bewegungen korrigiert. Maßstabsbalken = 10 μm. Weitere Informationen finden Sie unter Ergänzendes Video S1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/63968fig07large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Name des Puffers</td>
			<td colspan="2">Zusammensetzung</td>
		</tr><tr><td>Lipid-Rehydratationspuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5% Saccharose, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>SLB-Formationspuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 5-6</td>
		</tr><tr><td>SLB-Speicherpuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>Protein-Verdünnungspuffer</td>
			<td colspan="2">20 mM HEPES, 100 mM KCl, 1mM TCEP oder DTT, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>1X ME- oder Actin-Ionenaustauschpuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM MgCl2, 0,2 mM EGTA, 10 mM HEPES, pH 7,2 (bei 4°C lagern)</td>
		</tr><tr><td>1X KMEH oder Aktin Polymerisationspuffer</td>
			<td colspan="2">50 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, 50 mM HEPES, pH 7,2</td>
		</tr><tr><td>100 mM ATP-Vorrat</td>
			<td colspan="2">100 mM ATP Dinatriumsalz, 50 mM Tris, 50 mM NaCl, 5 mM MgCl2, 2 mM EGTA, pH 7,5 (lagern bei -20°C)</td>
		</tr><tr><td>2x Zielpuffer</td>
			<td colspan="2">2x KMEH, 2 mg/ml BSA, 2mM ATP, 5mM TCEP (gelagert bei 4°C)</td>
		</tr><tr><td>G-Puffer</td>
			<td colspan="2">2 mM Tris, 0,1 mM CaCl2, 0,2 mM ATP, 0,5 mM TCEP, 0,04 % NaN3, pH 8 (bei 4°C lagern)</td>
		</tr><tr><td>Myosin II Puffer</td>
			<td colspan="2">500 mM KCl, 1 mM EDTA, 10-20 mM Hepes, pH 7,0</td>
		</tr><tr><td>Gelfiltrations-Chromatographie-Puffer</td>
			<td colspan="2">50 mM Tris-HCl, 150-300 mM NaCl, 5 mM TCEP, 0,1% Tween-20, pH 7,5</td>
		</tr><tr><td>Capping Protein Speicherpuffer</td>
			<td colspan="2">10 mM Tris· Cl, 50 mM NaCl, 1 mM TCEP, pH 7,5, 20% Glycerin</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Liste der in diesem Protokoll verwendeten Pufferzusammensetzungen.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Häufige Probleme und deren Fehlerbehebung</td>
			<td>Problem</td>
			<td colspan="4">Verursachen</td>
			<td colspan="4">Mögliche Lösungen</td>
		</tr><tr><td>1</td>
			<td>Lipiddoppelschicht zeigt keine Diffusion</td>
			<td colspan="4">Die wahrscheinlichste Ursache für dieses Problem ist verschmutztes Deckglas, das auftreten kann, wenn die Reinigungslösung gealtert ist oder die Heizung während der Badbeschallung nicht stattgefunden hat. Diese Doppelschichten haben ein "vesikuläres" Aussehen, da die geplatzten Vesikel am Deckglas haften, aber nicht miteinander verschmelzen. Die Verwendung von MLVs, die älter als 6 Wochen oder SUVs älter als 6 Tage sind, oder die Zugabe geringer Mengen an SUVs kann ebenfalls zur Bildung vesikulärer Doppelschichten führen.</td>
			<td colspan="4">Verwenden Sie eine frische Reinigungslösung. Stellen Sie sicher, dass die Heizung eingeschaltet ist und die Temperatur zwischen 45-65 ° C liegt. Verwenden Sie frische Lipidmischungen. (Die Verwendung einer fluoreszierenden Lipidsonde im Vergleich zu einer fluoreszierenden Proteinsonde kann sich manchmal anders manifestieren. Wenn z.B. die Doppelschicht Subbeugungsdefekte aufweist und der Oberflächenpassivierungsschritt übersprungen wird (oder nicht funktioniert), zeigt die Lipidsonde eine gleichmäßige Intensitätsverteilung, aber die fluoreszierende Proteinsonde kann helle fluoreszierende Flecken aufweisen.)</td>
		</tr><tr><td>2</td>
			<td>Lipiddoppelschicht hat helle Flecken</td>
			<td colspan="4">Eine lange Inkubation von SUVs für die Doppelschichtbildung kann eine Lipiddoppelschicht erzeugen, die insgesamt diffundiert, aber gelegentlich helle Flecken aufweist. Diese Patches können mehrschichtige Doppelschichten sein, die große Mengen fluoreszierender Sonden anziehen können.</td>
			<td colspan="4">15-20 min Inkubation mit SUVs ist ausreichend. Stellen Sie sicher, dass die Sonde nicht aggregiert: Ein schneller harter Spin des Linkerproteins (300 x g für 15 min bei 4 °C) kann die Aggregate entfernen</td>
		</tr><tr><td>3</td>
			<td>Lipiddoppelschicht hat dunkle Löcher</td>
			<td colspan="4">Dies geschieht, wenn die Doppelschicht aus alten SUVs hergestellt und für längere Stunden (&gt; 4 Stunden nach der Bildung) abgebildet wird oder sich der pH-Wert der Lösung aufgrund längerer Bildgebung drastisch ändert (z. B. im hohen ATP-Zustand und in Gegenwart bestimmter Sauerstofffänger) oder wenn die Oberfläche mit Beta-Casein überpassiviert ist (Zugabe von zu viel Beta-Casein für mehr als 10-15 min und oder nicht auswaschen).</td>
			<td colspan="4">Verwenden Sie frische Lipide. Reduzieren Sie die Bildrate oder die effektive Laserbeleuchtungszeit. Verwenden Sie Puffer mit höherer Pufferkapazität.</td>
		</tr><tr><td>4</td>
			<td>Lipiddoppelschicht zeigt langsame Diffusion</td>
			<td colspan="4">Lipiddoppelschichten mit hohem Cholesterinanteil, lange gesättigte Lipide oder geladene Lipide diffundieren langsamer.</td>
			<td colspan="4">In solchen Fällen bereiten Sie Ihre Probe bei hoher Temperatur vor. Man kann auch eine einfache, getestete Lipidzusammensetzung als Kontrolle zusammen mit komplexen und ungetesteten Lipidzusammensetzungen verwenden. Stellen Sie sicher, dass das Glas sauber ist.</td>
		</tr><tr><td>5</td>
			<td>Aktin polymerisiert nicht</td>
			<td colspan="4">Zielpuffer ist alt, G-Aktin-Bestand ist zu alt, altes und neues G-Aktin wurden co-polymerisiert.</td>
			<td colspan="4">Stellen Sie sicher, dass das Ca 2+ vor der Polymerisation (mit ME-Puffer) durch Mg2+ ersetzt wird. Verwenden Sie frische ATP-Mg2+ Brühe. Verwenden Sie frisch recyceltes G-Actin. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration von F-Aktin (in Bezug auf G-Aktin), die der Doppelschicht zugesetzt wird, höher als 0,2 μM ist. Für niedrigere Konzentrationen verwenden Sie Phalloidin-stabilisiertes F-Aktin.</td>
		</tr><tr><td>6</td>
			<td>Aktin bindet nicht an die Doppelschicht</td>
			<td colspan="4">Membran-Aktin-Linker wird nicht oder in sehr geringer Konzentration hinzugefügt - dies kann aus der Fluoreszenz des Linkerproteins abgeleitet werden. Wenn die Fluoreszenz anständig ist, hat der Membran-Aktin-Linker die Aktinbindungskapazität verloren. Auch wenn das Linkerprotein unspezifisch an die Glasoberfläche gebunden ist (wenn die Doppelschicht schlecht ist), rekrutiert es möglicherweise keine Aktinfilamente.</td>
			<td colspan="4">Stellen Sie sicher, dass die Doppelschicht diffundiert. Verwenden Sie frisches Linkerprotein</td>
		</tr><tr><td>7</td>
			<td>Fluoreszierendes F-Aktin-Signal ist schwach</td>
			<td colspan="4">Das Verhältnis von markiertem zu dunklem Aktin ist zu gering. Entweder ist das markierte Aktin oder das unmarkierte Aktin zu alt und sie copolymerisieren nicht miteinander.</td>
			<td colspan="4">Recyceln Sie Aktin erneut und versuchen Sie die Beschäftigung mit frisch recyceltem Aktin. Lichtschäden können F-Aktin zerstören oder depolymerisieren; Wenn möglich, verwenden Sie rote oder tiefrote Farbstoffe für Aktin (und Myosin).</td>
		</tr><tr><td>8</td>
			<td>Myosin zeigt keine Kontraktilität</td>
			<td colspan="4">Es kann beobachtet werden, dass nach Zugabe von ATP zum Myosin-infundierten System keine Kontraktilität des Acto-Myosins vorliegt.</td>
			<td colspan="4">Überprüfen Sie, ob die Myosinkonzentration oder der Reinheitsgrad gut ist. Verwenden Sie frisch recyceltes Myosin (innerhalb von 6 Wochen nach dem Recycling verwenden). Die Zugabe von frischem ATP zum Myosin-Mix kann helfen. Entgasungspuffer und Verwendung von Sauerstofffängern usw. kann Lichtschäden der Motoren reduzieren.  Weitere Informationen finden sich in den Protokollen von Plastino et al. oder Stam et al. derselben Methodensammlung</td>
		</tr><tr><td>9</td>
			<td>Deckglas ist nicht hydrophil</td>
			<td colspan="4">Deckglas wird nicht richtig gereinigt.</td>
			<td colspan="4">Sauberes hydrophilllisches Deckglas ist entscheidend für die Bildung von Lipiddoppelschichten. Eine nützliche, visuelle Anzeige der Hydrophilie des Deckglases nach dem Reinigungsprotokoll ist die Beobachtung der Benetzung des Glases durch Wasser. Fügen Sie eine kleine Menge Wasser zu einem flach liegenden Deckglas hinzu. Das Wasser bleibt in Form eines runden Tröpfchens, wenn das Deckglas nicht richtig gereinigt wird. Das gleiche Wasservolumen breitet sich jedoch aus und bildet eine dünne Schicht auf einem behandelten hydrophilen Deckglas. Anhand dieses Benetzungsverhaltens des Wassers auf der Deckglasoberfläche kann festgestellt werden, ob die Reinigungsschritte mit der Reinigungslösung/NaOH funktioniert haben.</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2: Anleitung zur Fehlerbehebung mit einer Zusammenfassung häufiger Probleme und entsprechender Lösungen. 
Ergänzendes Video S1: Kontraktile Actomyosinflüsse treiben lokales Clustering des Membran-Aktin-Linkerproteins HYE voran. TIRF-Zeitraffer von HYE (YFP-markiert), Aktinfilamenten (markiert mit Atto-635-Maleimid) und Myosin-II-Filamenten (markiert mit Atto-565-Malemid) nach Zugabe von Myosin II zu einem SLB, das HYE und F-Aktin enthält. Die Zeit ist oben angegeben: 0 min ist unmittelbar bevor fluoreszierende Myofilamente im TIRF-Feld erscheinen. Maßstabsbalken = 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/63968/S1Movie_Act_myo_Hye_merge_timestamp_15fps.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von unterstützten Lipiddoppelschichten und die Zugabe von Zytoskelettfilamenten und Motorproteinen, um die Dynamik rekonstituierter, membrangebundener Zytoskelettnetzwerke mittels Fluoreszenzmikroskopie zu untersuchen.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

The surface of a living cell provides a versatile active platform for numerous cellular processes, which arise from the interplay of the plasma membrane ...

Hier demonstrieren wir ein relativ einfaches und unkompliziertes Verfahren, um membrangebundene Actomyosin-Netzwerke aufzubauen und die Dynamik mit fortschrittlichen lichtmikroskopischen Techniken zu untersuchen. Der entscheidende Vorteil ist, dass unser Assay die sequentielle Addition von Proteinen und kleinen Molekülen ermöglicht, ohne die membrangebundenen Netzwerke zu stören. Diese Methode kann leicht angepasst werden, um andere Zytoskelettproteine oder zusammengesetzte Netzwerke zu untersuchen.Der kritischste Teil des Protokolls besteht darin, sicherzustellen, dass die unterstützte Lipiddoppelschicht korrekt gebildet wird, daher mussten wir diesen Schritt zuerst beherrschen, bevor wir mit der Zugabe der Zytoskelettproteine beginnen konnten. Nehmen Sie zunächst drei bis fünf rechteckige Glasdeckgläser und legen Sie sie in ein Koplinglas. Schalten Sie den Badsonikator ein und stellen Sie die Temperatur auf 65 Grad Celsius ein.Füllen Sie das Kapplinglas mit 2% Reinigungslösung, um die Deckgläser vollständig einzutauchen, und legen Sie es für 30 Minuten im vollen Pulsmodus in den Sonicator. Verwenden Sie stumpfe PTFE-beschichtete Pinzetten, um die Deckgläser einzeln zu entfernen. Spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes Koplinglas, das mit zwei normalen Natriumhydroxiden gefüllt ist.Beschallen Sie die Deckgläser für 20 Minuten im vollen Pulsmodus. Entfernen Sie die Deckgläser, spülen Sie sie gründlich mit destilliertem Wasser ab und stellen Sie sie in ein anderes mit destilliertem Wasser gefülltes Tuch. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, nehmen Sie das Glas in eine chemische Haube, die mit einer Stickstoffgasversorgung ausgestattet ist.Verwenden Sie Handschuhe und Pinzetten, um die Deckgläser zu entfernen, um sie unter dem Stickstoffstrom zu trocknen. Trocknen Sie beide Seiten und legen Sie sie auf ein sauberes Kunststoffgitter mit einer Abdeckung. Legen Sie die Box mit den Deckgläsern in einen Exsikkator, um den Kontakt mit Staubpartikeln zu vermeiden, nehmen Sie dann autoklavierte PCR-Röhrchen und schneiden Sie ihre Deckel und unteren konischen Hälften mit einer scharfen chirurgischen Klinge aus.Nehmen Sie die zylindrischen halbgeschnittenen Tuben, tragen Sie UV-härtenden Klebstoff auf den glatten Rand jedes geschnittenen Röhrchens auf und legen Sie ihn umgekehrt auf ein frisch gereinigtes Deckglas, so dass der Rand flach auf dem Deckglas sitzt. Bewegen Sie den Zylinder nicht seitlich, sobald er auf dem Deckglas positioniert ist, um sicherzustellen, dass der Klebstoff nicht in den zentralen Raum der Kammer gelangt. Legen Sie die Kammer mit Deckgläsern in einen UV-Ozonreiniger mit Sauerstoffzufuhr und Vakuum.Schalten Sie das UV-Licht ein und beleuchten Sie es drei bis fünf Minuten, damit der Klebstoff polymerisieren kann. Nehmen Sie die Deckgläser heraus und testen Sie die Kammern auf Leckagen und entsorgen Sie die undichten Kammern. Waschen Sie jede Kammer mit SLB-Formationspuffer, wobei am Ende 100 Mikroliter Puffer übrig bleiben.Markieren Sie den Pufferspiegel bei 100 Mikrolitern mit einem Permanentmarker, geben Sie dann zwei Mikroliter 0,1 molares Calciumchlorid in die Kammer, gefolgt von acht Mikrolitern der SUV-Lösung in jede Kammer und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 25 Grad Celsius. Entfernen Sie 50 Mikroliter des SLB-Formationspuffers, lassen Sie nur 50 Mikroliter in der Probenkammer, geben Sie dann 100 Mikroliter eines XKMEH in die Kammer und mischen Sie vorsichtig. Entfernen Sie 100 Mikroliter des Puffers, ohne den Boden zu berühren.Wiederholen Sie die Wäschen acht bis 10 Mal, indem Sie 100 Mikroliter eines XKMEH hinzufügen und 100 Mikroliter entfernen. 10 Mikroliter eines Milligramms pro Milliliter Beta-Casein in die Doppelschicht geben, vorsichtig mischen und fünf bis 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Beta-Casein dreimal mit einem XKMEH abwaschen und den Pufferspiegel wieder auf die 100-Mikroliter-Marke bringen.Nehmen Sie während der Beta-Casein-Inkubation ein Aliquot Membran-Aktin-Linkerprotein für minus 80 Grad Celsius, das schnell bei 37 Grad Celsius aufgetaut ist, und halten Sie es dann auf Eis. Das Aliquot wird mit einem Proteinverdünnungspuffer auf eine Konzentration von einem Mikromolaren verdünnt. Das Linkerprotein in einer definierten Endkonzentration in die Lösung geben und vorsichtig mischen.30 bis 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren und drei- bis fünfmal mit einem XKMEH-Puffer waschen, um das ungebundene HSE-Protein zu entfernen. Bringen Sie den Pufferstand in jeder Kammer wieder auf die 100-Mikroliter-Marke. Die Probe ist nun bereit für die Bildgebung.Schalten Sie das Mikroskop, die Anregungslaser und die Detektionskameras ein. Stellen Sie sicher, dass der Laser ausgerichtet ist, das Objektiv gereinigt wird und die Software bereit ist, Bilder aufzunehmen. Öl auf das 100-fache Objektiv geben, die Probe auf den Mikroskoptisch montieren und das Objektiv auf die Doppelschicht fokussieren.Stellen Sie sicher, dass die Laserposition so ist, dass sie eine vollständige interne Reflexion auf der Probe erfährt. Verwenden Sie eine 488-Nanometer-Anregung. Um die Integrität der Doppelschicht zu bestimmen, führen Sie einen schnellen FRAP-Assay durch, indem Sie einen Bereich von Interesse auf der Doppelschicht auswählen und einige Bilder des Sichtfelds unter Verwendung von Bildgebungsbedingungen aufzeichnen, die ein Signal-Rausch-Verhältnis von fünf zu eins oder höher liefern.Pausieren Sie die Aufnahme und schließen Sie die Feldmembran des TIRF-Mikroskops, um einen konzentrierten Laserstrahl auf einen kleinen kreisförmigen Bereich der Doppelschicht zu fokussieren, um die Fluorophore lokal zu bleichen. Schalten Sie den Laser auf seine maximale Leistung ein, um den kleinen Bereich für drei bis 10 Sekunden zu photobleichen, und schalten Sie dann den Laser aus. Öffnen Sie die Feldblende wieder auf ihren ursprünglichen Radius, stellen Sie den Bildgebungszustand wieder auf die Einstellungen vor dem Bleichmittel ein und setzen Sie sofort die Aufzeichnung der Wiederherstellung des Fluoreszenzsignals im Sichtfeld fort.Überprüfen Sie, ob die Doppelschicht flüssig ist, und speichern Sie die Bilder als 16-Bit-Punkt-TIF-Dateien. Mischen Sie unmarkiertes und fluoreszierend markiertes G-Aktin in einem Verhältnis von 10 zu eins und füllen Sie es mit G-Puffer auf, so dass die Konzentration von G-Aktin 20 Mikromolar beträgt. Fügen Sie der Mischung ein Zehntel des 10-fachen ME-Puffers für eine einmalige Lösung hinzu und inkubieren Sie zwei Minuten bei Raumtemperatur.Als nächstes tauen Sie die Durchstechflasche mit dem Deckeln der Proteinbrühe schnell bei 37 Grad Celsius auf und halten Sie sie dann auf Eis. Mit G-Puffern so verdünnen, dass die Konzentration des Capping-Proteins jetzt doppelt so hoch ist wie die gewünschte Endkonzentration, und dann ein gleiches Volumen der verdünnten Capping-Proteinlösung zur Aktinmischung geben. Schließlich fügen Sie der Reaktionsmischung ein gleiches Volumen frischen, zweifachen Zielpuffers hinzu.Das Endvolumen der Lösung sollte das Vierfache des Volumens der Aktinmischung betragen. Stellen Sie sicher, dass die endgültige Konzentration der Komponenten wie im Textmanuskript beschrieben ist. Inkubieren Sie die Proben im Dunkeln bei 25 Grad Celsius für 45 bis 60 Minuten, um die Polymerisation zu ermöglichen.Pipettieren Sie vorsichtig fünf mikromolar polymerisiertes Aktin mit einer stumpfen Pipettenspitze und geben Sie es in ein sauberes autoklaviertes PCR-Röhrchen. Fügen Sie ein XKMEH in das Röhrchen hinzu, um das Endvolumen mehr als 20 Mikroliter zu erreichen, und mischen Sie vorsichtig, um ein Scheren von F-Aktin zu vermeiden. Entfernen Sie aus der montierten Probenkammer ein gleiches Volumen des Puffers.Fügen Sie die polymerisierte Aktinlösung in die Kammer hinzu und pipetten Sie dreimal vorsichtig auf und ab, ohne die Doppelschicht am Boden zu berühren. Montieren Sie die Probe auf dem TIRF-Mikroskop und lassen Sie sie 20 bis 30 Minuten ruhen. Nehmen Sie einige Bilder aus verschiedenen Sichtfeldern auf, nachdem F-Actin zusätzlich einen stabilen Zustand erreicht hat.Nach 30 Minuten Aktininkubation montieren Sie die Probe wieder auf das Mikroskop. Überprüfen Sie das Signal auf den Linkerprotein- und F-Aktin-Kanälen. Passen Sie die Bildgebungsbedingungen bei Bedarf an.Wählen Sie eine gute Region für eine lange Zeitrafferaufnahme. Nehmen Sie 10 bis 15 Bilder mit 0,1 bis 0,2 Hertz vor Myosin auf und pausieren Sie die Aufnahme. Pipettieren Sie das erforderliche Volumen an recyceltem Muskelmyosin zwei aus der Durchstechflasche mit einer stumpfen Pipettenspitze und fügen Sie es in ein sauberes autoklaviertes PCR-Röhrchen hinzu.Fügen Sie sofort einen XKMEH in die Tube hinzu, um das Volumen mehr als 20 Mikroliter zu erhöhen, und mischen Sie vorsichtig. Entfernen Sie vorsichtig ein gleiches Volumen des KMEH-Puffers aus der montierten Probenkammer, ohne sie zu stören, und geben Sie die Myosinlösung vorsichtig in die Probenkammer. Pipettieren Sie nicht nach oben und unten, da dies die oberflächengebundenen Filamente stört.Setzen Sie die Zeitrafferaufnahme sofort fort, speichern Sie alle Bilder und nehmen Sie dann Hintergrundbilder für alle Kanäle mit einem reinen Puffersample auf. Speichern Sie alle Bilder als TIF-Dateien. Der angepasste Wert des Diffusionskoeffizienten betrug 1,34 Quadratmikrometer pro Sekunde, was eng mit dem formelbasierten berechneten Wert von 1,39 Quadratmikrometern pro Sekunde übereinstimmte.Das Linienprofil nach dem Photobleaching und das Erholungsprofil des gebleichten Bereichs passen zu den Gleichungen vier bzw. fünf. Der mobile Anteil der Lipiddoppelschicht, der den Anteil der gebleichten Population darstellt, der sich wieder erholt, war größer als 0,9, was auf eine gute Lipiddoppelschicht hinweist. Myosinaktivität induzierte kontraktile Actomyosin-Ströme, die im stationären Zustand zu astroähnlichen Strukturen auftraten und die lokale Clusterbildung der gekoppelten Membrankomponente antreiben.Man kann eine Vielzahl von Mikroskopietechniken wie interferometrische Streumikroskopie verwenden, um die Dynamik von unmarkierten Actomyosin-Netzwerken zu untersuchen, ohne Photoschäden zu verursachen, oder hochauflösende Fluoreszenzmikroskopie verwenden. Diese Technik ebnet den Weg für Forscher, die verstehen möchten, wie Membranproteinkomplexe mit einem dynamischen Actomyosin-Netzwerk interagieren, um ihre Architektur und Zusammensetzung zu modulieren.

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Biology

Biologie

Wir beschreiben ein Protokoll zur Herstellung von gestützten Lipiddoppelschichten und dessen Charakterisierung mittels Rasterkraftmikroskopie und Kraftspektroskopie.

Rasterkraftmikroskopie und Imaging Kraftspektroskopie von unterstützten Lipiddoppelschichten

Hier präsentieren wir ein Protokoll Single, SNARE-vermittelte Fusion Ereignisse zwischen Liposomen und unterstützt Bilayer in mikrofluidischen Kanälen unter Verwendung von polarisierten TIRFM, mit Einzelmolekülempfindlichkeit und ~ 15 ms Zeitauflösung zu erfassen. Lipid und lösliche Ladung Freisetzung können gleichzeitig erfasst werden. Liposomgröße, Lipid-Diffusität und Fusion Poreneigenschaften gemessen werden.

SNARE-vermittelte Fusion von Einzelproteoliposomen mit Tethered Unterstützte Bilayers in einer Zelle Mikrofluidik-Flow-Überwacht durch polarisierte TIRF Mikroskopie

Diese Arbeit beschreibt eine Methode zur Bewertung der Wechselwirkungen und Assemblierungen von integralen Membranproteinen in vitro mit verschiedenen Partnerfaktoren in einer lipidproximalen Umgebung.

Scaffold Liposomen zu rekonstituieren Lipid-proximalen Protein-Protein-Wechselwirkungen In Vitro

Wir bieten ein Protokoll für in-vitro- Assays der Selbstorganisation von Verstand und mir auf einem unterstützten Lipid Bilayer in eine offene Kammer. Darüber hinaus beschreiben wir, wie der Assay in Lipid-plattiert PDMS Microcompartments in Vivo -Bedingungen durch Reaktion Entbindung imitieren einzuschließen.

In-vitro- Rekonstitution der selbstorganisierenden Proteinmuster auf unterstützten Lipid Bilayer

Mitochondriale Fusion ist eine wichtige panostatische Reaktion, die der mitochondrialen Dynamik zugrunde liegt. Hier wird ein In-vitro-Rekonstitutionssystem beschrieben, um die mitochondriale Innenmembranfusion zu untersuchen, die Membran-Tethering, Andocken, Hämifusion und Porenöffnung auflösen kann. Die Vielseitigkeit dieses Ansatzes bei der Erforschung von Zellmembransystemen wird diskutiert.

Eine Modellmembranplattform zur Rekonstituierung der mitochondrialen Membrandynamik

Dieses Protokoll beschreibt die Bildung von Zell-imitierenden Uni-Lipid- und Multi-Lipid-Vesikeln, unterstützten Lipiddoppelschichten und suspendierten Lipiddoppelschichten. Diese In-vitro-Modelle können angepasst werden, um eine Vielzahl von Lipidtypen zu integrieren und können verwendet werden, um verschiedene Molekül- und Makromolekül-Interaktionen zu untersuchen.

Assemblierung von zellimitierenden unterstützten und suspendierten Lipiddoppelschichtmodellen zur Untersuchung molekularer Wechselwirkungen

Dieser Artikel stellt eine einfache Methode zur schnellen Herstellung von riesigen unilamellären Vesikeln mit verkapselten zytoskelettalen Proteinen vor. Die Methode erweist sich als nützlich für die Bottom-up-Rekonstitution von Zytoskelettstrukturen in Enstrikt- und Zytoskelett-Membran-Interaktionen.

Schnelle Verkapselung des rekonstituierten Zytoskeletts in riesigen unilamellären Vesikeln

In diesem Manuskript demonstrieren wir die experimentellen Techniken zur Verkapselung des F-Aktin-Zytoskeletts in riesige unilamellare Lipidvesikel (auch Liposomen genannt) und die Methode zur Bildung einer Kortex-bioimitierenden F-Aktin-Schicht am inneren Blättchen der Liposomenmembran.

In vitro Rekonstitution des Aktinzytoskeletts in riesigen unilamellaren Vesikeln

Dieses Protokoll ist ein Leitfaden für die Visualisierung von dynamischem Aktin und Mikrotubuli unter Verwendung eines in vitro TIRF-Mikroskopie-Assays ( Total Internal Fluorescence).

Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Die zellfreie Rekonstitution war ein Schlüsselwerkzeug, um die Zytoskelett-Montage zu verstehen, und die Arbeit in den letzten zehn Jahren hat Ansätze zur Untersuchung der Septindynamik in minimalen Systemen etabliert. Hier werden drei komplementäre Methoden zur Beobachtung der Septinmontage in verschiedenen Membrankontexten vorgestellt: planare Doppelschichten, sphärische Stützen und Stabstützen.

Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Hier stellen wir Methoden zur Herstellung quasi-zweidimensionaler (2D) verschränker, vernetzter und flüssigkristalliner Aktin-Anordnungen aus gereinigten Proteinen vor.

Abstimmung der Kontraktilität und des Verformungsmodus aktiver Aktin-basierter Anordnungen in vitro: Von zweidimensionalen aktiven Netzwerken bis hin zu Flüssigkristalltropfen

Erfahren Sie die Rekonstitution membrangebundener Aktomyosin-Netzwerke auf gestützten Lipiddoppelschichten für die Zellbiologie. Diese Methode ermöglicht die sequenzielle Proteinzugabe ohne Netzwerkstörung und liefert Einblicke in Zytoskelettdynamik.

Rekonstitution membrangebundener minimaler Aktinkortices auf gestützten Lipiddoppelschichten

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