Demonstration der Sequenzausrichtung zur Vorhersage über Spezies hinweg Suszeptibilitätstool zur schnellen Bewertung der Proteinkonservierung

Im Zusammenhang mit der chemischen Sicherheit bietet das SeqAPASS-Protokoll einen schnellen und optimierten Prozess zur Bewertung der Proteinkonservierung über die Vielfalt der Arten hinweg, zur Extrapolation sowohl der Toxizität als auch des Wissens über biologische Signalwege. SeqAPASS wurde als vereinfachte, transparente und benutzerfreundliche webbasierte Schnittstelle für eine schnelle artenübergreifende Extrapolation entwickelt, die sowohl für Forscher als auch für Entscheidungsträger gedacht ist. Das Tool befasst sich mit der Herausforderung, das Wissen über chemische Toxizität unter Verwendung verfügbarer Informationen über die Empfindlichkeit von Arten zu extrapolieren, um die chemische Anfälligkeit für Hunderte bis Tausende von Arten konsistent vorherzusagen, die niemals in einer Laborumgebung getestet werden könnten.

Um mit dem SeqAPASS-Tool zu arbeiten, navigieren Sie zunächst zu seqapass.epa.gov. Bestehende Benutzer können die Anmeldeschaltfläche für Ihr Konto auswählen. Neue Benutzer können ein Konto erstellen, indem sie auf den Link auf der Startseite klicken.

Nachdem Sie sich beim SeqAPASS-Tool angemeldet haben, navigieren Sie zur Registerkarte SeqAPASS-Ausführung anfordern. SeqAPASS enthält mehrere hilfreiche Ressourcen, die Benutzern helfen, ein Abfrageproteinziel zu identifizieren. Diese können aufgerufen werden, indem Sie auf die Dropdown-Schaltflächen unter Identify a Protein Target klicken.

Sobald ein Proteinziel identifiziert ist, klicken Sie entweder auf Nach Spezies oder Nach Beitritt unter Primäre Aminosäuresequenzen vergleichen. Um beispielsweise die Erhaltung des mu-Opioidrezeptors zu analysieren, klicken Sie auf Nach Beitritt, und geben Sie die Zugangsnummer in das Protein-Beitrittsfeld ein. Sofern nicht bereits ein Proteinzugang vom Benutzer identifiziert wurde, wird die Artensuche empfohlen.

Wählen Sie Anforderungsausführung aus, um die Abfrage zu initiieren. Sobald Ihre Abfrage gesendet wurde, wählen Sie die Registerkarte SeqAPASS Run Status oben auf der Seite, um den Status der übermittelten Ausführung anzuzeigen. Die Zeit bis zur Fertigstellung hängt von der aktuellen Werkzeugnutzung ab.

Auf der Registerkarte SeqAPASS-Berichte anzeigen werden alle unter einem bestimmten Konto durchgeführten Läufe aufgelistet. Wählen Sie Bericht anzeigen aus, um Daten im Webbrowser anzuzeigen, und klicken Sie auf Ausgewählten Bericht anfordern, um die Seite Proteininformationen der ersten Ebene abzufragen zu öffnen und Ergebnisse und Datenanpassungsoptionen anzuzeigen. Um eine SeqASPASS-Analyse der zweiten Ebene zu entwickeln und auszuführen, bei der die Erhaltung bestimmter Proteindomänen bewertet wird, klicken Sie auf das Pluszeichen neben der Überschrift Ebene Zwei auf der Seite Level One Query Protein Information, um das Abfragemenü der Ebene Zwei aufzufüllen.

Klicken Sie auf das Feld Domäne auswählen, um eine Liste funktionaler Domänen für das Abfrageprotein aufzufüllen. Sobald eine Domäne aus der NCBI Conserved Domain Database identifiziert und in der SeqAPASS-Dropdown-Liste ausgewählt wurde, starten Sie die Abfrage der zweiten Ebene. Klicken Sie dazu auf die Schaltfläche Domain Run anfordern.

Klicken Sie auf Ausführen der Ebenen zwei und drei aktualisieren, um Daten der Ebene zwei aufzufüllen. Klicken Sie unter Daten der zweiten Ebene anzeigen auf das Feld Abgeschlossene Domäne auswählen, um den abgeschlossenen Domänenbeitritt auszuwählen. Sie können dann auf die Schaltfläche Daten der zweiten Ebene anzeigen klicken, um die Ergebnisse zu öffnen.

Die Daten werden unter der Registerkarte SeqAPASS anzeigen für die ausgewählte Ebene angezeigt. Sehen wir uns zunächst die Daten der ersten Ebene an. Aktivieren Sie auf der Seite Proteininformationen abfragen das Optionsfeld neben dem primären oder vollständigen Bericht, um die Daten in einem komprimierten oder erweiterten Format anzuzeigen. Die Spezies haben entweder eine Suszeptibilitätsvorhersage von ja oder nein, die angibt, ob das Protein relativ zur Abfragesequenz konserviert ist.

Klicken Sie im Bericht auf die entsprechende Proteinzugangs- oder Spezies-ID, um auf die NCBI-Datenbanken zu verweisen und auf weitere Informationen zuzugreifen. Um die entsprechenden Toxizitätsdaten für die Arten mit Suszeptibilitätsvorhersagen zu untersuchen, scrollen Sie zur rechten Seite der Ergebnistabelle, um die Spalte ECOTOX anzuzeigen. Klicken Sie auf die Links, um die betreffende Tierart in der ECOTOXicology-Wissensdatenbank zu öffnen, wo Sie Toxizitätsdaten finden können. Zusätzlich zu vollständigen und primären Berichten kann ein zusammenfassender Bericht der Daten angezeigt werden, indem Sie View Level One Summary Report auswählen.

Der zusammenfassende Bericht zeigt zusammenfassende Metriken und Suszeptibilitätsvorhersagen über taxonomische Gruppen hinweg. Daten in jedem Berichtsformat können einfach heruntergeladen werden. Klicken Sie bei ausgewähltem Berichtstyp auf Tabelle herunterladen, um sie als Tabellenkalkulationsdatei zu speichern.

Um Daten der zweiten Ebene anzuzeigen, scrollen Sie zum Anfang der Registerkarte SeqAPASS anzeigen und wählen Sie Ebene zwei aus. SeqAPASS-Daten der zweiten Ebene werden in Berichten wie dem der ersten Ebene angezeigt und sind auch unten auf der Seite Proteininformationen abfragen verfügbar. Aktivieren Sie das Optionsfeld neben dem gewünschten Berichtstyp, um die Daten anzuzeigen.

Berichte der zweiten Ebene zeigen ähnliche Informationen wie die der ersten Ebene an, mit zusätzlichen Informationen zur Proteindomäne. SeqAPASS-Daten können leicht visualisiert werden, um die Interpretation zu erleichtern. Klicken Sie auf das Pluszeichen neben Visualisierung, gefolgt von der Schaltfläche Daten visualisieren, um einen interaktiven BoxPlot in einem neuen Tab zu öffnen.

Wählen Sie auf der neuen Registerkarte die Schaltfläche BoxPlot aus. Oben auf der BoxPlot-Seite können Steuerelementoptionen dem Benutzer helfen, das Diagramm anzupassen. Benutzer können taxonomische Gruppen hinzufügen oder aus dem Diagramm entfernen, sie können Arten auswählen, die in einer Legende angezeigt werden sollen, auswählen, wie die Namen der Arten angezeigt werden, und bestimmte Artenuntergruppen hervorheben, z. B. bedrohte oder gefährdete Arten.

Visualisierungen können einfach exportiert und gespeichert werden. Klicken Sie auf Box Plot herunterladen, um einen Dateityp auszuwählen und die Abbildung herunterzuladen. Vor dem Herunterladen können Benutzer die Dateitypauflösung des Bildes anpassen.

Obwohl die Standardberichtseinstellungen für die meisten Analysen ausreichend sind, können Parameter über die Untermenüs oben im Menü Proteininformationen abfragen geändert werden. Um aktuelle Berichtseinstellungen aufzuzeichnen, klicken Sie auf die Schaltfläche Aktuelle Berichtseinstellungen herunterladen, um eine Datei herunterzuladen, in der die aktuell angewendeten Einstellungen erfasst werden. Dies kann für Level eins und Level zwei erfolgen.

Hier ist das Beispiel für Ebene eins. Um eine SeqAPASS-Analyse der Stufe drei zu initiieren, navigieren Sie zur Seite Level One Query Protein Information und klicken Sie auf das Pluszeichen neben dem Level Three Header, um das Level Three Query Menu aufzufüllen, das individuelle Aminosäurerestvergleiche ermöglicht. Bevor eine Analyse der Stufe drei durchgeführt werden kann, müssen spezifische Aminosäurereste durch eine Überprüfung der vorhandenen Literatur identifiziert werden.

Klicken Sie auf das Pluszeichen neben dem Verweis-Explorer, um das Verweis-Explorer-Tool zu öffnen. Auf diese Weise können Sie eine vordefinierte boolesche Zeichenfolge generieren, um verfügbare Literatur abzufragen. Klicken Sie auf den Link Google Scholar generieren, um eine Literatursuchzeichenfolge zu generieren.

Diese kann entweder kopiert und zur Suche in gewünschten Literaturdatenbanken verwendet werden. Wenn Sie Google Scholar durchsuchen auswählen, wird Google Scholar-Literatur automatisch anhand der vordefinierten Suchzeichenfolge durchsucht. Sobald die Aminosäurereste ausgewählt wurden, können Benutzer eine Analyse der Stufe drei einrichten.

Wählen Sie die Vorlagensequenz aus, an der die vom Benutzer ausgewählte Art ausgerichtet und verglichen werden soll. Optional können zusätzliche Vorlagensequenzen in das Feld Zusätzliche Vergleiche eingegeben werden. Vor dem Ausrichten bestimmter Sequenzen müssen Benutzer einen benutzerdefinierten Ausführungsnamen eingeben.

Dies wird verwendet, um den Lauf zu identifizieren. Wählen Sie die taxonomische Gruppe im Feld Taxonomische Gruppe auswählen aus. Es ist zu beachten, dass dieser Vorgang für alle taxonomischen Gruppen wiederholt wird, für die der Benutzer eine Bewertung für die Erhaltung vornehmen möchte.

Sobald alle gewünschten Arten für die Ausrichtung an der Vorlagensequenz ausgewählt wurden, wählen Sie Rückstandslauf anfordern. Sobald alle Arten ausgerichtet wurden, klicken Sie auf Stufe zwei und drei Läufe aktualisieren, um das Menü Run Name der Stufe Drei auswählen mit den abgeschlossenen Level-Drei-Jobs zu füllen. Daten der dritten Ebene können entweder nach einzelnen taxonomischen Gruppen oder über mehrere taxonomische Gruppen hinweg angezeigt werden.

Klicken Sie auf Daten der dritten Ebene kombinieren, um das Dialogfeld Kombinierte Ebene drei zu öffnen und mehrere taxonomische Gruppen gleichzeitig zu analysieren. Wählen Sie im Dialogfeld Berichte der dritten Ebene kombinieren die Vorlage der dritten Ebene aus, die als Vergleichsgrundlage verwendet werden soll. Wählen Sie als Nächstes aus, welche abgeschlossenen Aufträge verglichen werden sollen.

Bestellen Sie Aufträge der dritten Ebene wie gewünscht, und klicken Sie auf Daten der dritten Ebene anzeigen, um eine Berichtsseite der dritten Ebene zu erstellen. Auf der Seite Level Three Template Protein Information werden zuvor identifizierte Aminosäurenpositionen aus der Vorlagensequenz angezeigt und können für die Ausrichtung ausgewählt werden. Geben Sie Positionen durch Kommas getrennt in das Textfeld ein, oder wählen Sie alternativ aus der Rückstandsliste aus.

Sobald alle Positionen eingegeben sind, wählen Sie In Rückstandsliste kopieren, um Rückstände in das Auswahlfeld zu transportieren. Nachdem alle Aminosäurepositionen ausgewählt und auf Genauigkeit überprüft wurden, klicken Sie auf Bericht aktualisieren, um ausgerichtete Sequenzen mit den angegebenen Positionen zu aktualisieren. Führen Sie einen Bildlauf zum Ende der Seite durch, um einen Bericht über die Ergebnisse anzuzeigen.

Aktivieren Sie wie bei vorherigen Ebenen das Optionsfeld neben dem primären oder vollständigen Bericht, um den Berichtstyp auszuwählen. Berichte der dritten Stufe zeigen ähnliche Spezies und Proteine und enthalten Ausrichtungs- und Konservierungsinformationen für jeden bewerteten Aminosäurerest. Um den Bericht zu speichern, klicken Sie unten im Bericht auf Tabelle herunterladen, und speichern Sie ihn als Tabellenkalkulationsdatei.

Benutzer können auch Zusammenfassungsbericht der dritten Ebene anzeigen auswählen, um eine Zusammenfassungsberichtstabelle anzuzeigen und herunterzuladen. Um eine Visualisierung für Daten der dritten Ebene anzuzeigen, klicken Sie auf das Pluszeichen neben der Visualisierungskopfzeile und wählen Sie Daten visualisieren, um eine neue Seite zu öffnen. Klicken Sie auf der Visualisierungsinformationsseite auf Heat Map, um die interaktive Grafik und die Steuerelemente zu öffnen.

Wählen Sie auf der Visualisierungsseite unter Steuerelemente die taxonomischen Gruppen aus, die in der Heatmap angezeigt werden sollen, wechseln Sie sie mithilfe der Pfeilschaltfläche und ordnen Sie sie bei Bedarf neu an. Standardmäßig zeigt die Heatmap-Visualisierung den allgemeinen Namen der Art, die allgemeinen Suszeptibilitätsvorhersagen und den Übereinstimmungsstatus jedes Aminosäurerests an. Optionen zum Bearbeiten von Heatmap-Einstellungen finden Sie in den erweiterbaren Menüs unter der Überschrift Steuerung.

Unter Berichtsoptionen kann ein einfacher oder vollständiger Bericht ausgewählt werden, und die angezeigten Arten können zwischen gebräuchlichen oder wissenschaftlichen Namen umgeschaltet werden. Unter Optionale Auswahl können Teilmengen von Arten, z. B. orthologe Kandidaten, bedrohte Arten, gefährdete Arten und häufige Modellorganismen, ausgewählt und in der Heatmap hervorgehoben werden. Unter Heatmap-Einstellungen können die auf der Heatmap angezeigten Informationen angepasst werden, indem Sie die Kontrollkästchen deaktivieren und aktivieren.

Suszeptibilitätsvorhersagen und Suszeptibilitätstext können entfernt werden, und Aminosäureausrichtungen und Aminosäureinformationen können entfernt werden. Um die Heatmap-Visualisierung zu speichern, klicken Sie auf Heatmap herunterladen und wählen Sie den gewünschten Dateityp aus. SeqAPASS verfügt über einen zusammenfassenden Entscheidungsbericht, mit dem Benutzer Anfälligkeitsvorhersagen über Ebenen und Arten hinweg gleichzeitig bewerten können.

Wenn Sie auf den Seiten Ergebnisse oder Datenvisualisierung auf Ebene in DS-Bericht übertragen klicken, werden die Daten auf die Registerkarte DS-Bericht übertragen, auf der alle Analyseebenen kombiniert und angezeigt werden können. Die Ergebnisse der Level-One-Analyse für den mu-Opioidrezeptor zeigen einen Suszeptibilitätsgrenzwert von 55% mit prozentualen Ähnlichkeiten für Säugetiere, Vögel, Reptilien, Amphibien und die meisten Fischarten, die über diesen Grenzwert fallen und eine Empfindlichkeitsvorhersage von Ja erhalten. Die Boxen, die vollständig unter dem Cutoff liegen, erhalten eine Suszeptibilitätsvorhersage eines Nein.

Die Analyse der zweiten Stufe für die funktionelle Domäne von mu Opioiden ergab eine höhere Suszeptibilitätsgrenze von 88% Ähnlichkeit mit Säugetieren, Vögeln, Reptilien, Amphibien und den meisten Fischarten oberhalb dieses Cutoffs, was eine weitere Beweislinie für die Erhaltung oder den mu-Opioidrezeptor über Wirbeltiere hinweg liefert. Innerhalb der Analyse der Stufe drei ergaben alle untersuchten Arten eine Suszeptibilitätsvorhersage von ja. Da diese Aminosäuren sowohl für die Bindung von starken mu-Opioidrezeptoragonisten als auch von starken Antagonisten wichtig sind, deuten diese Daten darauf hin, dass Opioidverbindungen, die auf menschliche Rezeptoren abzielen, ähnlich mit Rezeptoren über Wirbeltierarten hinweg interagieren können.

Stufe drei von SeqAPASS ist nützlich für die Hypothesengenerierung. Selbst wenn kritische Aminosäurereste für das interessierende Protein nicht bekannt sind, kann das Tool verwendet werden, um Arten zu untersuchen und festzustellen, wo Naturschutz existiert oder weniger konserviert ist. Diese Hypothesen können dann mit molekularbiologischen Techniken, wie z.B. ortsgerichteten Mutagenesestudien, getestet werden.

Der anfängliche Fokus von SeqAPASS lag auf chemischen Zielen. Unsere Forschung erweitert sich jedoch auf die Erforschung primär metabolisierender Enzyme, Transportproteine sowie Proteine, die an der Bioakkumulation beteiligt sind.