Synthese von Stimuli-responsiven Nanogelen mittels wässriger Ein-Schritt-Vernetzung und Co-Nanopolymerisation
24. Januar 2025
Nanogele sind eine hervorragende und vielseitige Nanopartikelplattform für die Verabreichung von Biologika. Stimuli-responsive polymere Nanogele auf Poly(ethylen)-glykol-Basis, die in der Lage sind, proteinbasierte Nutzlasten zu verkapseln, wurden unter Verwendung einer einstufigen Vernetzungs-Co-Nanopolymerisationsstrategie unter wässrigen Bedingungen synthetisiert. Die optimale Herstellung und Charakterisierung dieser neuartigen Nanopartikel wird hier vorgestellt.
Unser Protokoll bietet einen bedeutenden Fortschritt bei der Synthese von proteinbeladenen Nanogelen unter 100 Nanometern in einem einzigen Schritt Vernetzungs- und Copolymerisationstechnik unter milden wässrigen Reaktionsbedingungen. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt in ihrer Fähigkeit, proteinbeladene Nanogele unter milden Bedingungen zu synthetisieren, aggressive organische Lösungsmittel und hohe Temperaturen zu vermeiden und so die Integrität der biologischen Nutzlast zu erhalten. Beginnen Sie damit, die Gläser mit gefiltertem enionisiertem Wasser zu waschen.
Um die Gläser zu trocknen, befestigen Sie eine sichere Düse am Druckluftauslass an der Seite des Abzugs. Halten Sie das Fläschchen fest, positionieren Sie die Düse im Inneren und aktivieren Sie die Druckluft, um einen kontrollierten Strom abzugeben. Füllen Sie anschließend ein 10-Milliliter-Glasfläschchen mit entionisiertem Wasser und verschließen Sie es mit einem Gummiseptum.
Um das Wasser sauerstoffarm zu machen, füllen Sie einen Ballon mit Stickstoffgas und befestigen Sie eine Nadel am Ballon. Legen Sie es auf das Septum und stechen Sie in das Gummiseptum, um den Stickstofffluss zu ermöglichen. Befestigen Sie außerdem eine Austrittsnadel am Kolben, um einen gleichmäßigen Stickstofffluss aufrechtzuerhalten.
Als nächstes lösen Sie BSA oder Cy7-markiertes BSA in sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf. Geben Sie diese Lösung dann in ein sauberes 10-Milliliter-Glasfläschchen. Geben Sie AETC-Lösung in den Kolben und verschließen Sie ihn mit einem weiteren Gummiseptum.
Lösen Sie Acrylamid und sauerstoffarmes, deionisiertes Wasser auf und fügen Sie diese Lösung der Mischung des Fläschchens hinzu. Lösen Sie dann den Disulfidvernetzer in entionisiertem Wasser auf und geben Sie ihn zu der Mischung im Fläschchen. Spülen Sie das Gemisch 20 Minuten lang mit Stickstoffgas.
Lösen Sie anschließend SDS in sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser auf. Führen Sie es mit einer stickstoffgasgespülten Spritze in die Mischung ein. Als nächstes fügen Sie TEMED zum Reaktionsgemisch hinzu.
Lassen Sie das Gemisch drei Minuten lang unter einem kontinuierlichen Strom von Stickstoffgas sauerstoffarm werden. Ammoniumpersulfat wird in einem Milliliter sauerstoffarmem, deionisiertem Wasser gelöst und in das Reaktionsgemisch eingebracht. Dann verschließen Sie den Kolben unter einer Stickstoffatmosphäre und rühren Sie das Gemisch drei Stunden und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur um.
Um die Reaktion zu beenden, ist die Versiegelung vom Kolben zu entfernen. Die Reaktion endet, sobald die Mischung klar und farblos wird. Um Nanogele zu reinigen, geben Sie das Reaktionsgemisch in eine 15-Milliliter-Zentrifugalfiltereinheit.
Füllen Sie das Gerät mit entionisiertem Wasser und zentrifugieren Sie, um nicht reaktive Chemikalien oder nicht verkapselte Nutzlast zu entfernen. Geben Sie zwei Milliliter entionisiertes Wasser in die Zentrifugaleinheit, um die Nanogelprobe zu verdünnen. Lagern Sie die endgültige Probe bei zwei bis acht Grad Celsius, um einen Abbau des verkapselten Proteins zu verhindern.
Nehmen Sie eine Küvette oder eine gefaltete Einweg-Kapillarzelle zur Analyse. Reinigen Sie es mit deionisiertem Filterwasser und blasen Sie anschließend Druckluft, um große Staubpartikel zu entfernen. Füllen Sie dann die Küvette mit 50 bis 100 Mikrolitern der Probe und verdünnen Sie sie mit 750 bis 1.000 Mikrolitern gefiltertem deionisiertem Wasser.
Um die Küvette in das DLS-Instrument einzusetzen, öffnen Sie die Abdeckung des Probenfachs und halten Sie die Küvette an den oberen Rändern, um Fingerabdrücke auf den optischen Fenstern zu vermeiden. Platzieren Sie die Küvette richtig ausgerichtet mit dem Strahlengang des Instruments. Schließen Sie dann den Probenraum, um das Umgebungslicht zu blockieren.
Starten Sie die Partikelgrößenmessung mit der entsprechenden Software an der DLS-Maschine. Wählen Sie nach der Messung die für die Probe relevanten Ergebnisse aus, einschließlich des Z-Durchschnitts, des durchschnittlichen PI, der Zählrate pro Minute, des Zetapotenzials und der zugehörigen Grafiken. Vergewissern Sie sich, dass die Korrelationsfunktion eine glatte sigmoidale Kurve anzeigt, die auf eine einheitliche Stichprobe hinweist.
Sobald die Analyse abgeschlossen ist, nehmen Sie die Küvette vorsichtig aus dem DLS-Gerät. Es wurde eine allmähliche Abnahme der Intensität des mit dem BSA-Protein assoziierten Peaks beobachtet, was auf eine Verkapselung des Proteins innerhalb der Nanogelstruktur hindeutet. Die physikalisch-chemische Charakterisierung der Cy7-markierten BSA-beladenen Nanogele zeigte einen einzigen definierten Peak bei 50 bis 100 Nanometern.
Leere Nanogele zeigten jedoch inkonsistente und größere Größen. Bis zu 86 % der verkapselten Cy7-markierten BSA wurden innerhalb von 48 Stunden freigesetzt. Auf der anderen Seite führten Kontrollexperimente ohne Zusatz von Glutathion nur zu einer Proteinfreisetzung von 15 %.
Die Fourier-Transformations-Infrarotanalyse zeigte, dass BSA, das während der Nanogelsynthese und nach der Glutathion-Inkubation isoliert wurde, seine Struktur beibehielt, was durch den Peak bei 1.662 Zentimetern invers angezeigt wird, der intakte Beta-Windungen darstellt. BSA aus Nanogelen, die 30 Tage gelagert wurden, zeigte jedoch einen Peak bei 1.613 Zentimetern invers, was auf intermolekulare Beta-Faltblattstrukturen und Proteinaggregation hinweist. Der Zirkulardichroismus zeigte unveränderte Spektren wie bei nativem BSA, was auf eine erhaltene alpha-helikale Struktur hinweist.
Geringfügige Abweichungen in den charakteristischen Peaks für BSA, die nach 30 Tagen isoliert wurden, deuteten jedoch auf eine gewisse Aggregation hin. Die Aufrechterhaltung eines kontinuierlichen Stickstoffflusses ist entscheidend, um zu verhindern, dass Sauerstoff die Polymerisation freier Radikale hemmt. Darüber hinaus müssen die initiierenden Systemkomponenten für eine erfolgreiche Synthese schnell hinzugefügt werden.
Nach diesem Verfahren können die nanogelgroße Verteilung, die Morphologie und die Kinetik der Nutzlastfreisetzung durch DLS, TEM und Redox-Responsiveness durch Inkubation mit dem physiologischen Reduktionsmittel Glutathion weiter charakterisiert werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt eine neuartige Methode zur Synthese von proteinbeladenen Nanogelen mittels einer einstufigen Vernetzungs- und Copolymerisationstechnik vor. Der Ansatz ermöglicht die Herstellung von Nanogelen mit einer Größe unter 100 Nanometern unter milden wässrigen Bedingungen, wodurch die Integrität der biologischen Fracht erhalten bleibt.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Nanopartikelsynthese
- Biologika-Abgabe
- Polymermaterialien
Hintergrund
- Nanogele sind vielseitige Plattformen für die Arzneimittelfreisetzung.
- Herkömmliche Methoden beinhalten oft harsche Bedingungen, die biologische Materialien beschädigen können.
- Diese Studie untersucht eine neue Synthesemethode, die diese Probleme verringert.
- Die Verwendung von Poly(ethylen)glykol verbessert die Eigenschaften der Nanogele.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur effizienten Herstellung proteinbeladener Nanogele.
- Aufzeigen der Vorteile milder Synthesebedingungen.
- Charakterisierung der resultierenden Nanopartikel hinsichtlich potenzieller Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Einstufige Vernetzungs-Copolymerisationstechnik.
- Verwendung von filtriertem deionisiertem Wasser zum Spülen des Glasgeräts.
- Kontrolliertes Trocknen des Glasgeräts mit Druckluft.
- Einkapselung proteinbasierter Wirkstoffe in Nanogelen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Synthese von unter 100 Nanometer großen, proteinbeladenen Nanogelen.
- Erhaltung der Integrität der biologischen Wirkstoffe während der Synthese.
- Charakterisierung der Nanopartikel bestätigte deren Eignung für die Arzneimittelabgabe.
- Nachweis der Effizienz der einkomponentigen Synthesemethode.
Schlussfolgerungen
- Die neue Synthesemethode ist wirksam für die Herstellung von Nanogelen.
- Milde Bedingungen sind entscheidend, um die Integrität des Wirkstoffs zu bewahren.
- Dieser Ansatz könnte die Abgabe von Biologika in der Forschung und klinischen Anwendung verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Durch wasserbasierte Ein-Schritt-Vernetzung hergestellte stimuliempfindliche Nanogele ermöglichen die Einschlussverkapselung und kontrollierte Freisetzung von Proteintherapeutika unter milden Bedingungen und lösen damit direkt die Herausforderungen bezüglich der Integrität der Wirkstofffracht im frühen biopharmazeutischen Forschungs- und Entwicklungsstadium. Diese Plattform trägt zur vorhersagbaren Zuverlässigkeit bei der Freigabe biologischer Wirkstoffe bei und verringert Formulierungsrisiken an der Schnittstelle zwischen Entdeckung und präklinischer Phase. Die Verträglichkeit des Verfahrens mit empfindlichen Biomolekülen stellt es als wiederverwendbares Instrument für translationsorientierte Forschung über das gesamte Portfolio hinweg dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung der Proteinstabilität und Freisetzungskinetik unter physiologisch relevanten Bedingungen.
- Ermöglicht die funktionelle Validierung von Transportvehikeln für biologische Wirkstoffe ohne Risiko der Denaturierung.
- Unterstützt die mechanistische Risikominimierung, indem die Proteinstruktur während der Einschließung und Freisetzung erhalten bleibt.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet standardisierte Nanogel-Formulierungen für die reproduzierbare Untersuchung der Einschlusswirkung und Freisetzungsprofile.
- Liefert quantitative Ergebnisse wie Größe, Polydispersität und Einschlusswirkung zur Optimierung von Assays.
- Ermöglicht die skalierbare Herstellung von Nanogelen für die Bewertung nachgeschalteter Verbindungen und die Wiederverwendung der Plattform.
Translationale und präklinische Forschung
- Trägt den krankheitsrelevanten Herausforderungen bei der Abgabe Rechnung, indem es eine redoxabhängige, kontrollierte Freisetzung in biomimetischen Umgebungen ermöglicht.
- Unterstützt die Kontinuität von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem es die Integrität des Wirkstoffs und die Vorhersagbarkeit der Freisetzung erhält.
- Verringert das Risiko eines spätzeitigen Versagens aufgrund von Formulierungsinstabilität oder Verlust biologischer Aktivität.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode zur Synthese von Nanogelen reicht von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Leitverbindungen bis hin zur präklinischen Formulierung und unterstützt die Überprüfung von Hypothesen sowie die Optimierung der Abgabe von Biologika.
- Entdeckungsbiochemie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung zur Proteineinschließung und -freisetzung unter physiologischen Redoxbedingungen.
- Screening: Liefert reproduzierbare, quantitative DLS- und TEM-Daten zur Charakterisierung von Nanogelen und zur Beurteilung der Eignung für Assays.
- Analytik: Ermöglicht die Bestimmung der Einschließungseffizienz, der Freisetzungskinetik sowie der strukturellen Integrität des Proteins nach der Freisetzung.
- Translationale Forschung: Verbindet in-vitro-Freisetzungsprofile mit in-vivo-relevanten reduzierenden Umgebungen für eine biomarkerbasierte Abgabe.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, milde Synthesepaltform, die an unterschiedliche Proteinfrachtstoffe über verschiedene Programme hinweg anpassbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der biologischen Abgabe und verringert die mechanistische Uneindeutigkeit in der Formulierung.
- Operativer Wert: Standardisiert die Synthese und Charakterisierung von Nanogelen zur Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit.
- Strategischer Wert: Ermöglicht fundierte Go/No-Go-Entscheidungen durch robuste Daten zur Integrität und Freisetzung des Wirkstoffs.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Priorisierung von Abgabesystemen und biologischen Kandidaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in der Polymerchemie, der Charakterisierung von Nanopartikeln und der Proteinanalytik.
- Benötigt Zugang zu DLS, TEM und analytischen Assays zur Quantifizierung der Einschließung und Freisetzung.
- Erfordert eine strenge, übergreifende Standardisierung der Synthese- und Messprotokolle.
- Einsatz für verschiedene Proteinfrachtstoffe möglich, erfordert jedoch möglicherweise eine Optimierung bezüglich unterschiedlicher Molekulargewichte oder Ladungen.
- Ein kontinuierlicher Stickstoffstrom und eine schnelle Reagenzzugabe sind entscheidend für Reproduzierbarkeit und Ausbeute.
