Name: Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Blut und festem Gewebe für die Analyse von Oberflächenantigenen und Proteinen. Diese Methode ermöglicht physiologische und pathologische Studien sowie diagnostische Anwendungen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der National Natural Science Foundation of China (32000974, 81870796, 82170988 und 81930025) und der China Postdoctoral Science Foundation (2019M663986 und BX20190380) unterstützt. Wir sind dankbar für die Unterstützung des National Experimental Teaching Demonstration Center for Basic Medicine (AMFU).

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<li>Zheng, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apoptotic+vesicles+restore+liver+macrophage+homeostasis+to+counteract+type+2+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Apoptotic vesicles restore liver macrophage homeostasis to counteract type 2 diabetes.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (7), 12109(2021).</li>
<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+apoptotic+bodies+maintain+mesenchymal+stem+cell+homeostasis+and+ameliorate+osteopenia+via+transferring+multiple+cellular+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Circulating apoptotic bodies maintain mesenchymal stem cell homeostasis and ameliorate osteopenia via transferring multiple cellular factors.</a> Cell Research. 28 (9), 918-933 (2018).</li>
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<li>Dawson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+lipid+rafts+%28detergent-resistant+microdomains%29+and+comparison+to+extracellular+vesicles+%28exosomes%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation of lipid rafts (detergent-resistant microdomains) and comparison to extracellular vesicles (exosomes).</a> Methods in Molecular Biology. 2187, 99-112 (2021).</li>
<li>Zhang, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles%3A+Natural+liver-accumulating+drug+delivery+vehicles+for+the+treatment+of+liver+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Extracellular+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles: Natural liver-accumulating drug delivery vehicles for the treatment of liver diseases.</a> Journal of Extracellular Vesicles. 10 (2), 12030(2020).</li>
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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Bei der Untersuchung der Merkmale, des Verbleibs und der Funktion von Elektrofahrzeugen ist es von entscheidender Bedeutung, Elektrofahrzeuge mit hoher Ausbeute und geringer Kontamination zu isolieren. Es gibt verschiedene Methoden zur Extraktion von EVs, wie z. B. Dichtegradientenzentrifugation (DGC), Größenausschlusschromatographie (SEC) und Immunocapture-Assays 4,20. Hier kam eine der am häufigsten verwendeten Methoden, die Differentialzentrifugation, zum Eins...

Extrazelluläre Vesikel (EVs) wurden vorgeschlagen, um zellfreigesetzte Lipiddoppelschicht-eingeschlossene extrazelluläre Strukturenzu definieren 1, die eine wichtige Rolle bei verschiedenen physiologischen und pathologischen Ereignissenspielen 2. EVs, die von gesunden Zellen freigesetzt werden, können grob in zwei Hauptkategorien unterteilt werden, nämlich Exosomen (oder kleine EVs), die durch einen intrazellulären endozytären Transportweg3 gebildet werden, und Mikrovesikel (oder große EVs), die durch die nach außen gerichtete Knospung der Plasmamembran der Zelle4 entstehen. Während sich viele Studien auf die Funktion von EVs konzentrieren, die aus kultivierten Zellen in vitro5 gewonnen wurden, sind EVs, die aus dem Kreislauf oder Gewebe stammen, komplexer und heterogener, was den Vorteil hat, dass sie den wahren Zustand des Organismus in vivo widerspiegeln 6. Darüber hinaus können fast alle Arten von Geweben EVs in vivo produzieren, und diese EVs können als Botenstoffe innerhalb des Gewebes fungieren oder von verschiedenen Körperflüssigkeiten, insbesondere dem peripheren Blut, übertragen werden, um die systemische Kommunikation zu erleichtern7. EVs im Kreislauf und im Gewebe sind auch Ziele für die Diagnose und Behandlung von Krankheiten8.
Während Exosomen in den letzten Jahren intensiv erforscht wurden, haben Mikrovesikel auch wichtige biologische Funktionen, die ohne Ultrazentrifugation leicht extrahiert werden können und so die Grundlagen- und klinische Forschung fördern9. Ein kritisches Problem in Bezug auf EVs, die aus dem Kreislauf und dem Gewebe isoliert wurden, besteht darin, dass sie von verschiedenen Zelltypen stammen10. Da Mikrovesikel von der Plasmamembran abgeblasen werden und durch eine Fülle von Zelloberflächenmolekülen9 gekennzeichnet sind, ist die Verwendung von Markern für die Mutterzellmembran zur Identifizierung des zellulären Ursprungs dieser EVs möglich. Insbesondere kann die Technik der Durchflusszytometrie (FC) zum Nachweis von Membranmarkern eingesetzt werden. Darüber hinaus können die Forscher die Elektrofahrzeuge isolieren und weitere Analysen auf der Grundlage der funktionalen Ladungen durchführen.
Das vorliegende Protokoll bietet ein gründliches Verfahren zur Extraktion und Charakterisierung von EVs aus in vivo Proben. Die EVs werden mittels Differentialzentrifugation isoliert, und die Charakterisierung der EVs umfasst die morphologische Identifizierung mittels Nanopartikel-Tracking-Analyse (NTA) und Transmissionselektronenmikroskopie (TEM), Herkunftsanalyse mittels FC und Proteinfrachtanalyse mittels Western Blot. Das Blutplasma und der Oberkieferknochen von Mäusen werden als Repräsentanten verwendet. Forscher können auf dieses Protokoll für Elektrofahrzeuge aus anderen Quellen zurückgreifen und entsprechende Änderungen vornehmen.

<table><tbody><tr><td>4% Paraformaldehyd&nbsp;</td><td>Biosharp</td><td>143174</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Ziegen-Sekundärantikörper</td><td>Yeason</td><td>34306ES60</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Anti-Kaninchen-Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-CD18-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab131044</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Anti-CD81-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab109201</td><td>Western-Blot-Anti-CD9-Antikörper</td></tr><tr><td></td><td>Huabio</td><td>ET1601-9</td> Western-Blot-Anti-Mitofilin-Antikörper <td></td></tr><tr><td></td><td>Abcam</td><td>ab110329</td><td>Western-Blot</td></tr><tr><td>APOA1 Kaninchen-pAb</td><td>Abclone</td><td>A14211</td><td>Western-Blot</td></tr><tr><td>BCA-Protein-Assay-Kit</td><td>TIANGEN</td><td>PA115</td><td>Western-Blot</td></tr><tr><td>BLUeye Vorgefärbte Proteinleiter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>94964-500UL</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>MP Biomedical</td><td>218072801</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Caveolin-1 Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-53564</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>CellMask Orange Plasmamembranfärbung</td><td>Invitrogen</td><td>C10045</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Chemilumineszenz</td><td>Amersham Biosciences</td><td>N/A</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Gebogene Operationsschere</td><td>JZ Chirurgisches Instrument</td><td>J21040</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>Elektronische Waage</td><td>Zhi Ke</td><td>ZK-DST</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>Epochen-Spektralphotometer</td><td>BioTek</td><td>N/A</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Eppendorf Röhrchen</td><td>Eppendorf</td><td>3810X</td><td>EV Isolierung</td></tr><tr><td>Flotillin-1 Antikörper</td><td>PTM BIO</td><td>PTM-5369</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Gel-Imaging-System</td><td>Tanon</td><td>4600</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Golgin84</td><td>Novus</td><td>nbp1-83352</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Gitter - Formvar/Carbon Coated - Kupfer 200 mesh</td><td>Polysciences</td><td>24915</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Heparin Lösung</td><td>StemCell&nbsp;</td><td>7980</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401127001</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>Mikroskopische Pinzette</td><td>JZ Chirurgisches Instrument</td><td>JD1020</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>NovoCyte Durchflusszytometer</td><td>ACEA</td><td>N/A</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Omni-PAGE Hepes-Tris Gele Hepes 4~20%, 10 Wells</td><td>Epizyme</td><td>LK206</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>OSCAR( D-19) Antikörper</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-34235</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>PBS (2x)</td><td>ZHHC</td><td>PW013</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Pentobarbital Natrium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>57-33-0</td><td>Anästhesieperoxidase</td></tr><tr><td>AffiniReine Ziege Anti-Maus IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>115-035-003</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Peroxidase AffiniReine Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>Jacson</td><td>111-035-003</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Phosphotungssäure</td><td>RHAWN</td><td>12501-23-4</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>PKM2(d78a4) xp Kaninchen&nbsp; mab&nbsp;</td><td>Cell Signaling</td><td>4053t</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Polyethylen (PE) Film</td><td>Xiang yi</td><td>200150055</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Polyvinylidenfluorid-Membranen&nbsp;</td><td>Roche</td><td>3010040001</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Protease-Inhibitoren</td><td>Roche</td><td>4693132001</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Rekombinanter Anti-PID-Antikörper</td><td>Abcam</td><td>ab129199</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>RIPA Lysepuffer</td><td>Beyotime</td><td>P0013</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Ladepuffer (5x)</td><td>Cwbio</td><td>CW0027S</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Beads</td><td>Invitrogen</td><td>F13839</td><td>Durchflusszytometrie</td></tr><tr><td>Tisch-Hochgeschwindigkeits-Mikrozentrifugen</td><td>Hitachi</td><td>CT15E</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>Transmissionselektronenmikroskop</td><td>HITACHI</td><td>H-7650</td><td>Transmissionselektronenmikroskop</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>MP Biomedicals</td><td>19472</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Vortex Mixer Genie</td><td>Scientific Industries</td><td>SI0425</td><td>EV-Isolierung</td></tr><tr><td>ZetaView BASIC NTA - Nanopartikel-Tracking-Videomikroskop PMX-120</td><td>Particle Metrix</td><td>N/A</td><td>Nanopartikel-Tracking-Analyse</td></tr><tr><td>&alpha;-Actinin-4 Kaninchen mAb</td><td>Abclone</td><td>A3379</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>&beta;-Aktin</td><td>Cwbio</td><td>CW0096M</td><td>Western Blot</td></tr></tbody></table>

isolierung und analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären vesikeln aus dem plasma und festen geweben

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Zirkulierende und geweberesidente extrazelluläre Vesikel (EVs) stellen vielversprechende Ziele als neuartige theranostische Biomarker dar und erweisen sich als wichtige Akteure bei der Aufrechterhaltung der organismischen Homöostase und dem Fortschreiten eines breiten Spektrums von Krankheiten. Während sich die aktuelle Forschung auf die Charakterisierung endogener Exosomen mit endosomalem Ursprung konzentriert, haben Mikrovesikel, die aus der Plasmamembran blähen, zunehmend an Aufmerksamkeit in den Bereichen Gesundheit und Krankheit gewonnen, die sich durch eine Fülle von Oberflächenmolekülen auszeichnen, die die Membransignatur von Elternzellen rekapitulieren. In dieser Arbeit wird ein reproduzierbares Verfahren vorgestellt, das auf der Differentialzentrifugation basiert, um EVs aus dem Plasma und festen Geweben, wie z.B. dem Knochen, zu extrahieren und zu charakterisieren. Das Protokoll beschreibt darüber hinaus die anschließende Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die somit auf ihre Ableitungen zurückgeführt und mit Komponenten identifiziert werden können, die mit einer potenziellen Funktion in Verbindung stehen. Diese Methode wird für die korrelative, funktionelle und mechanistische Analyse von EVs in biologischen, physiologischen und pathologischen Studien nützlich sein.

Entsprechend dem experimentellen Arbeitsablauf können EVs aus dem peripheren Blut und festen Geweben extrahiert werden (Abbildung 1). Der Oberkieferknochen einer Maus im Alter von 8 Wochen beträgt ca. 0,1 ± 0,05 g, und es können ca. 300 μl Plasma aus der Maus entnommen werden. Nach den Protokollschritten können 0,3 mg bzw. 3 μg EVs gesammelt werden. Wie mittels TEM und NTA analysiert, sind die typischen morphologischen Merkmale von EVs runde becherförmige Membranvesikel mit einem Durchmesser...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode zur Extraktion extrazellulärer Vesikel aus dem peripheren Blut und festem Gewebe mit anschließender Profilierung von Oberflächenantigenen und Proteinladungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Dieses Protokoll bietet eine praktikable Möglichkeit, die richtigen extrazellulären Vesikel aus den meisten Blut- und Feststoffgeweben zu isolieren und zu sammeln, insbesondere ihre Quelle und den Proteingehalt zu analysieren, was weitere funktionelle Experimente unterstützt. Neben der hohen Ausbeute und der geringen Kontamination ist der Hauptvorteil dieses Protokolls die Analyse von Oberflächenantigenen und Proteinladungen von EVs, die für physiologische und pathologische Studien nützlich ist. Es erleichtert die Diagnose von Krebserkrankungen wie entzündlichen Erkrankungen und Osteoporose durch die Detektion von Oberflächenmarkern von Elternzellen extrazellulärer Vesikel mit einem Durchflusszytometer.Die Menge der extrazellulären Gewebevesikel ist entscheidend für die folgenden Experimente. Stellen Sie sicher, dass die Konzentration der extrazellulären Vesikel nicht hoch ist. Seien Sie geduldig, um die Verdünnung durchzuführen.Bereiten Sie zunächst die Oberkieferknochenproben vor, indem Sie den Oberkieferknochen mit einer Augenpinzette und einer Schere isolieren und mit PBS waschen, um das Weichgewebe mit einer Pinzette zu entfernen. Dann legen Sie den Oberkieferknochen in 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und schneiden den Knochen mit einer Schere in kleine Stücke von einem Millimeter Durchmesser. Fügen Sie eine bestimmte Menge Liberase hinzu, um das Gewebe zu bedecken, und inkubieren Sie es 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius.Anschließend zentrifugieren Sie die Probe bei 800 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und überführen den Überstand vorsichtig mit einer Pipette in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen. Nachdem die vorbereiteten Plasma- und Knochenproben 15 Minuten lang bei 2.500 G und vier Grad Celsius zentrifugiert wurden, um großzellige Trümmer und verbleibende Blutplättchen zu entfernen, werden die Überstände vorsichtig in neue und saubere 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt und bei 16.800 G für 30 Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugiert. Als nächstes wird der Überstand entsorgt und die Pellets in jedem Röhrchen mit einem Milliliter PBS resuspendiert.Nach dem Zentrifugieren und Verwerfen des Überstands, wie zuvor gezeigt, resuspendieren Sie die Pellets in jedem Röhrchen mit 50 Mikrolitern PBS und lagern Sie diese Proben bei vier Grad Celsius für weniger als 24 Stunden oder verwenden Sie sie vorzugsweise sofort für die Analysen. Resuspendieren Sie die Proben mit 500 Mikrolitern PBS und übertragen Sie 50 Mikroliter in ein neues und sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als Leerkontrolle, das als Röhrchen A gekennzeichnet ist, und weitere 50 Mikroliter in ein weiteres sauberes 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen als einfaches Färberöhrchen für FITC, das als Röhrchen B gekennzeichnet ist.Geben Sie 0,5 Mikroliter Membranfarbstoff in das Primärröhrchen für die Membranfärbung, während Sie fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Nachdem das Primärröhrchen 30 Minuten lang bei 16.800 G zentrifugiert und der Überstand verworfen wurde, werden die Pellets mit 200 Mikrolitern PBS resuspendiert.Jede 50-Mikroliter-Probe wird in vier 1,5-Milliliter-Zentrifugenröhrchen aufgeteilt, um einfache Färberöhrchen für PE zu erhalten, die als Röhrchen C markiert sind, Oberflächenmarker zu färben, die als Röhrchen D markiert sind, und sekundäre Antikörperkontrollen, die als Röhrchen E gekennzeichnet sind.Geben Sie den primären Antikörper von Osteoklasten-assoziierten Rezeptor- und Knochenextrazellulären Vesikelproben sowie CD-18-Antikörper- und Plasma-extrazelluläre Vesikelproben separat in Röhrchen B und Röhrchen D. eine Stunde lang bei vier Grad Celsius inkubieren. Zentrifugieren Sie die Röhrchen und entsorgen Sie den Überstand wie zuvor gezeigt und resuspendieren Sie die Pellets mit 500 Mikrolitern PBS. Zentrifugieren Sie erneut 30 Minuten lang bei 16.800 G und vier Grad Celsius, um die zusätzlichen primären Antikörper zu entfernen.Nach dem Verwerfen des Überstandes resuspendieren Sie die Pellets mit 50 Mikrolitern PBS, gefolgt von der Zugabe von FITC-konjugierten Sekundärantikörpern in Röhrchen E.Inkubieren Sie alle Röhrchen eine Stunde lang bei vier Grad Celsius im Dunkeln. Verdünnen Sie einen Tropfen 0,2-, 0,5- bzw. eine mikrometergroße Perlensuspension in einen Milliliter PBS. Führen Sie dann jede Größe von Beads durch, um sicherzustellen, dass das für extrazelluläre Vesikel gewählte Gate ausgewählt wurde, und legen Sie den Schwellenwert des Durchflusszytometers fest, um mit einer geeigneten Vorwärts-Innenstreuung nach den Beads und der extrazellulären Vesikelpopulation zu suchen.Legen Sie als Endbedingung die Berechnung von 100.000 membrangefärbten Partikeln fest und analysieren Sie die Probe mit einem Durchflusszytometer, wie im Manuskript beschrieben. Die Pellets werden in 50 Mikrolitern RIPA-Lysepuffer resuspendiert und 30 Minuten auf Eis inkubiert. Um die Proteinkonzentrationen aller Proben in der 96-Well-Mikrotiterplatte mit dem BCA-Proteinassay zu quantifizieren, werden die zwei Milligramm pro Milliliter BSA mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung auf 0,5 Milligramm pro Milliliter verdünnt.Bei 0,5 Milligramm pro Milliliter BSA und 0,9 % normaler Kochsalzlösung in drei duplizierte Vertiefungen mit bestimmten Volumina. Lassen Sie dann zwei Mikroliter der Proben fallen und geben Sie 18 Mikroliter normale Kochsalzlösung separat in drei duplizierte Vertiefungen. Nachdem Sie eine Arbeitslösung durch Mischen von BCA-Reagenz A mit Reagenz B hergestellt haben, geben Sie 200 Mikroliter der Arbeitslösung in jede Vertiefung und schütteln Sie sie 30 Sekunden lang vorsichtig.Anschließend wird die 96-Well-Mikrotiterplatte für 20 bis 25 Minuten bei 37 Grad Celsius inkubiert und die optische Dichte bei 596 Nanometern mit dem Spektralphotometer gemessen. Exportieren Sie als Nächstes die Daten, zeichnen Sie eine Standardkurve und berechnen Sie die Proteinkonzentration der Proben. Den Ergebnissen zufolge werden die Proben mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung und der fünffachen Konzentration des SDS-PAGE-Ladepuffers auf ein Mikrogramm pro Mikroliter verdünnt, die Röhrchen mit Folie dicht verschlossen und fünf Minuten lang bei 100 Grad Celsius erhitzt.Laden Sie die Proben in der Proteinleiter in eine Gradientenkonzentration von vier bis 20 % des Trisgels von HEPy. Lassen Sie das Gel im laufenden Puffer bei 80 Volt laufen, bis die Proteine eine Linie bilden. Schalten Sie dann für eine Stunde auf 120 Volt um, bis sich der Ladefarbstoff am Boden des Gels befindet.Übertragen Sie das Gel auf die in Methylalkohol vorinkubierte Polyvinylidenfluoridmembran für 20 Sekunden mit einem Nasstransfersystem, um es eine Stunde lang bei 200 Milliampere zu übertragen. Bereiten Sie 5%BSA-Blockierpuffer vor, indem Sie 2,5 Gramm BSA und 50 Milliliter TBST in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben. Blockieren Sie die Membranen in diesem Puffer zwei Stunden lang bei Raumtemperatur unter Rühren.Inkubieren Sie die Membranen mit spezifischen Primärantikörpern, die mit TBST verdünnt sind, über Nacht bei vier Grad Celsius in die richtige Konzentration. Waschen Sie die Membranen viermal im Waschpuffer und inkubieren Sie die Membranen mit geeigneten Sekundärantikörpern eine Stunde lang bei Raumtemperatur unter Rühren. Nachdem Sie die Membranen viermal im Waschpuffer gewaschen haben, bilden Sie die Membranen mit dem Chemilumineszenz-Kit in einem Gel-Bildgebungssystem ab.Die Transmissionselektronenmikroskopie und die Nanopartikel-Tracking-Analyse zeigten, dass die typischen morphologischen Merkmale extrazellulärer Vesikel rund und becherförmig mit einem Durchmesser von 500 bis 300 Nanometern sind. Die durchflusszytometrische Analyse zeigt den prozentualen Anteil spezifischer Membranmarker, die auf extrazellulären Vesikeln exprimiert werden, was auf ihre Herkunft aus den Elternzellen hindeutet. Die Western-Blot-Analyse zeigt die Expression von PID bzw. PKM2 als repräsentativ für den Proteingehalt und die extrazellulären Plasmavesikel und die extrazellulären Knochenvesikel, was auf den metabolischen Status hinweist.Eine negative Expression von Golgin-84 in extrazellulären Vesikeln wurde durch die Anwesenheit von Mitofilin, Alpha-Actinin-4, Flotillin-1, Caveolin-1 und Beta-Aktin zusammen mit dem Vesikelmarker CD9 nachgewiesen, während die CD81-Expression gering oder gar nicht vorhanden ist und APO-A-1 in den extrazellulären Plasmavesikeln fehlt. Forscher, also unter Berücksichtigung von Schritt 2.2, die Präparation und der Aufschluss der Gewebeproben sollten ausreichend durchgeführt werden. Andernfalls ist die Anzahl der extrazellulären Vesikel, die aus dem Gewebe extrahiert werden, begrenzt.Die mit Markern markierte fluoreszierende Färbung der extrazellulären Vesikel kann in den Mund injiziert werden, um die Phase zu behandeln, die mit der potenziellen Funktion verbunden ist.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Extrazelluläre Vesikel im Blut wurden als neuartige Biomarker für verschiedene Krankheiten vorgeschlagen. In dieser Arbeit stellen wir ein Protokoll für die Isolierung von großen Mikrovesikeln aus Plasmamembranen aus peripheren Blutproben und deren anschließende Analyse mittels konventioneller Durchflusszytometrie und Western Blotting vor.

Isolierung und Charakterisierung von Mikrovesikeln aus peripherem Blut

Dies ist ein Protokoll, um Gewebe extrazelluläre Vesikel (EVs) aus der Leber zu isolieren. Das Protokoll beschreibt einen zweistufigen Prozess mit Kollagenaseperfusion, gefolgt von differentialer Ultrazentrifugation, um Lebergewebe-EVs zu isolieren.

Isolierung von Gewebe extrazellulären Vesikeln aus der Leber

In diesem Protokoll beschreiben wir den kompletten Workflow für die schnelle Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus menschlichen Vollblut und Charakterisierung spezifischer Marker durch Fluoreszenz-basierte Nanopartikel-Tracking-Analyse. Die vorgestellten Ergebnisse zeigen ein hohes Maß an Reproduzierbarkeit und Zelle Kultur Überstände angepasst werden können.

Rasche Fluoreszenz basierende Charakterisierung der einzelnen extrazelluläre Vesikel im menschlichen Blut mit Nanopartikel-Tracking Analyse

Hier bieten wir ein detailliertes Protokoll um kleine extrazelluläre Vesikel (EVs) aus dem ganzen Gewebe, einschließlich Gehirn und Tumor Proben zu isolieren. Diese Methode bietet eine reproduzierbare Technik um EVs aus festen Gewebe für weitere nachgelagerte Analysen zu extrahieren.

Gewinnung von extrazellulären Vesikel aus ganze Gewebe

Der vorliegende Bericht hebt die chronologischen Anforderungen an die extrazelluläre Vesikel-Isolierung (EV) von Mikroglia oder Blutmakrophagen hervor. Mikroglia-abgeleitete Elektrofahrzeuge wurden als Regulatoren des Neuritenwachstums evaluiert, während von Blutmakrophagen abgeleitete Elektrofahrzeuge bei der Kontrolle der C6-Gliomzellinvasion in In-vitro-Assays untersucht wurden. Ziel ist es, diese EV-Funktionen als Immunvermittler in bestimmten Mikroumgebungen besser zu verstehen.

Charakterisierung von immunzellulären Vesikeln und Untersuchung der funktionellen Auswirkungen auf die Zellumgebung

Das Protokoll zeigt hier, dass extrazelluläre Vesikel mittels Größenausschlusschromatographie adäquat von konditionierten Zellkulturmedien getrennt werden können.

Größenausschlusschromatographie zur Trennung extrazellulärer Vesikel aus konditionierten Zellkulturmedien

Die neueste Generation von EV-Charakterisierungswerkzeugen ist in der Lage, eine einzelne EV-Analyse über mehrere Parameter gleichzeitig durchzuführen. Die Nano-Durchflusszytometrie misst alle biologischen Partikel größer als 45 nm ohne Markierung und identifiziert spezifische Eigenschaften von Subpopulationen durch eine Vielzahl von fluoreszierenden Markierungstechniken.

Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Das vorliegende Protokoll enthält detaillierte Beschreibungen für die effiziente Isolierung von extrazellulären Vesikeln im Urin unter Verwendung funktionalisierter magnetischer Beads. Darüber hinaus umfasst es nachfolgende Analysen, einschließlich Western Blotting, Proteomik und Phosphoproteomik.

Chemische affinitätsbasierte Isolierung extrazellulärer Vesikel aus Bioflüssigkeiten für die Proteomik- und Phosphoproteomik-Analyse

Dieser Artikel beschreibt eine Methodik zur Isolierung, Charakterisierung und Quantifizierung von extrazellulären Vesikeln (EV) aus humanem Plasma und stellt einen Arbeitsablauf für die markierungsfreie Analyse des EV-Proteoms mittels Flüssigchromatographie-Tandem-Massenspektrometrie (LC-MS/MS) vor.

Isolierung, Charakterisierung und proteomische Analyse von aus Plasma gewonnenen extrazellulären Vesikeln zur Entdeckung kardiovaskulärer Biomarker

Hier demonstrieren wir die Charakterisierungsmethode für extrazelluläre Vesikel (EVs), die aus biologischen Flüssigkeiten wie Tränen und Speichel von menschlichen Probanden gewonnen wurden. Der bei dieser Methode verwendete Scanner ist in der Lage, den Phänotyp, die Größe und die Gesamtpartikelzahl von EVs aus 1 μl der Probe zu erkennen.

Charakterisierung extrazellulärer Vesikel aus biologischen Flüssigkeiten

Dieses Protokoll beschreibt die Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskeln und Knochenmark mittels enzymatischer Verdauung und Größenausschlusschromatographie, wodurch reproproduzierbare Rückgewinnung von vesikelangereicherten Fraktionen aus strukturell komplexen, leistungsarmen Geweben für die nachgelagerte molekulare Analyse ermöglicht wird.

Isolierung kleiner extrazellulärer Vesikel aus Mausskelettmuskulatur und Knochenmark mittels Größenausschlusschromatographie

Erfahren Sie die Isolierung von extrazellulären Vesikeln aus Blut und festem Gewebe für die Analyse von Oberflächenantigenen und Proteinen. Diese Methode ermöglicht physiologische und pathologische Studien sowie diagnostische Anwendungen.

Isolierung und Analyse von nachweisbaren und funktionalisierten extrazellulären Vesikeln aus dem Plasma und festen Geweben

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