Name: Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Lernen Sie ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro mit PBMCs und calciumphosphatbeschichteten Platten. Diese Methode ermöglicht gleichzeitige Darstellung von Resorptionspits und Zellen.

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Diese Arbeit wurde teilweise vom China Scholarship Council [CSC Nr. 201808440394] finanziert. W.C. wurde von CSC finanziert.

Das Protokoll wurde von der lokalen Ethikkommission überprüft und genehmigt (Genehmigungsnummer 287/2020B02).
1. Herstellung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten
<ol><li>Herstellung von Calcium-Stammlösung (25 mM CaCl 2·2H 2 O, 1,37 mM NaCl, 15 mM MgCl2·6H2O im Tris-Puffer)<ol>
<li>Bereiten Sie den 1,0 M Tris-Puffer vor und stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein.</li>
		<li>Stellen Sie ein Glasbecherglas auf einen Magnetrührer und fügen Sie 100 ml 1,0 M Tris-Puffer hinzu.</li>
		<li>0,368 g CaCl 2·2H 2 O, 8,0 gNaCl und 0,305 g MgCl2·6H2Oabwägen und nacheinander in Tris-Puffer auflösen.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Phosphatlagerlösung (11,1 mM Na2HPO4· H2O, 42 mM NaHCO 3 in Tris-Puffer)<ol>
<li>Stellen Sie ein Glasbecherglas auf einen Magnetrührer und fügen Sie 100 ml 1,0 M Tris-Puffer hinzu.</li>
		<li>0,158 g Na2HPO4· abwiegen H2Ound 0,353 gNaHCO 3 und lösen sich nacheinander im Tris-Puffer auf.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Bei Raumtemperatur lagern.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorverkalkung von 96-Well-Zellkulturplatten<ol>
<li>Es werden 30 ml Arbeitslösung hergestellt, indem 15 ml 1,0 m Tris-Puffer, 7,5 ml Calciumstock (Schritt 1.1.4) und 7,5 ml Phosphatstocklösung (Schritt 1.2.3) gemischt werden. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.</li>
		<li>Bereiten Sie eine 96-Well-Zellkulturplatte mit flachem Boden vor. Pipette 300 μL Calciumphosphatlösung (Schritt 1.3.1.) in jedes Well. Decken Sie die Platte mit einem Deckel ab und inkubieren Sie die Platte bei 37 °C für 3 Tage.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Herstellung von Calciumphosphatlösung (2,25 mM Na2HPO4· H2O, 4 mM CaCl 2·2H 2 O, 0,14 M NaCl, 50 mM Tris Base in ddH 2O)<ol>
<li>Fügen Sie 2 ml 1 M HCl zu 40 ml entionisiertem Wasser in ein Becherglas mit einer magnetischen Rührperle und lösen Sie 0,016 g Na2HPO4· H2O, 0,0295 g CaCl 2·2H2 O, 0,409 g NaCl und 0,303 g Tris-Base nacheinander.</li>
		<li>Stellen Sie den pH-Wert mit 1 M HCl auf 7,4 ein. Fügen Sie deionisiertes Wasser hinzu, um das Volumen auf 50 ml zu füllen. Filtern Sie die Lösung mit einem 0,2-μm-Filter.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verkalkung von 96-Well-Zellkulturplatten<ol>
<li>Aspirationsvorverkalkungslösung aus den vorverkalkten Zellkulturplatten mit 96 Wells und Zugabe von 300 μL Calciumphosphatlösung (Schritt 1.4.2) zu jeder Vertiefung. Die Platten mit einem Deckel abdecken und 1 Tag bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Drehen Sie die Platte um, um die Lösung auszugießen, und waschen Sie die Platte dreimal gründlich mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platte sofort mit einem Haartrockner oder einem komprimierten CO2- oderN2-Gas , um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die beschichtete Platte durch UV-Strahlung in einer sauberen Bank für 1 h. Verwenden Sie die beschichtete Platte sofort oder verschließen Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolierung von PBMCs aus menschlichem peripherem Blut
<ol><li>Entnehmen Sie 15 ml Blut aus der Vene, nachdem Sie die schriftliche Einverständniserklärung des Blutspenders eingeholt haben (ethische Abstimmung: 287/2020B02).</li>
	<li>Verdünnen Sie 15 ml frisches Blut mit einem gleichen Volumen PBS und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen mehrmals umkehren oder die Mischung in und aus einer Pipette ziehen.</li>
	<li>Bereiten Sie ein konisches 50-ml-Rohr mit 15 ml Dichtegradientenlösung (z. B. Ficoll, Table of Materials) pro Tube vor. Kippen Sie das Röhrchen und schichten Sie vorsichtig 30 ml verdünnte Blutprobe auf die 15 ml Dichtegradientenlösung (verdünnte Blutprobe: Dichtegradientenlösung, Verhältnis 1: 0,5-1). HINWEIS: Achten Sie beim Überlagern der Probe darauf, die Dichtegradientenlösung nicht mit der verdünnten Blutprobe zu mischen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 810 x g für 20 min bei 20 °C in einem Schwenkschaufelrotor ohne Bremse.</li>
	<li>Aspirieren Sie die obere Schicht und lassen Sie die mononukleäre Zellschicht (Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten) in der Interphase ungestört.</li>
	<li>Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig auf eine neue konische 50-ml-Röhre.</li>
	<li>Füllen Sie das Röhrchen mit PBS, Mix und Zentrifuge bei 300 x g für 10 min bei 20 °C (Bremse kann ab dieser Stufe verwendet werden).</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig. Resuspendiert das Zellpellet in 50 ml PBS und zentrifugiert bei 300 x g für 10 min bei 20 °C. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig.</li>
	<li>Zur Entfernung von Blutplättchen das Zellpellet in 50 ml PBS resuspendieren und bei 200 x g für 10 min bei 20 °C zentrifugieren. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig vollständig.</li>
	<li>Transfer von resuspendierten Zellen in Zellkulturflaschen zur Expansion von OC-Vorläufern.</li>
</ol>3. Erweiterung der OC-Vorläufer
<ol><li>Resuspendiert PBMCs in vollständigem α-MEM (10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% Amphotericin B) mit 20 ng/mL M-CSF. Saat-PBMCs mit einer Dichte von 2,5 x 105 Zellen/cm2. Normalerweise können Zellen, die aus 15-20 ml frischem Blut isoliert wurden, in einem 75 cm 2 Kolben (1,5-2 x 107 Zellen) ausgesät werden.</li>
	<li>Füttern Sie die Zellen jeden dritten Tag mit frischem komplettem α-MEM mit 20 ng/mL M-CSF, bis die angehängten Zellen einen gewünschten Zusammenfluss erreichen. Typische Erträge sind 1,5-2 x 10 6 Zellen/Kolben, wenn die Zellen zu 95% konfluent sind. Normalerweise dauert die Expansionsphase 6 Tage. HINWEIS: Das osteoklastogene Potential der Vorläufersubstanzen kann mit längerer Kultivierungszeit abnehmen.</li>
</ol>4. Induktion der Osteoklastogenese in CaP-beschichteten Platten
<ol><li>Um die Zelladhäsion zu erleichtern, inkubieren Sie die CaP-beschichteten Platten mit 50 μL FBS für 1 h in einem 37 °C Inkubator.</li>
	<li>Um die OC-Vorläufer zu lösen, waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS, um tote oder nicht adhärente Zellen zu entfernen. Fügen Sie 4 ml Trypsin (Table of Materials) pro 75 cm2 Kolben für 30 min hinzu.<ol>
<li>Fügen Sie 4 ml vollständiges α-MEM hinzu, um die Verdauung zu stoppen, lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellenschaber und übertragen Sie die Zellen in eine 50-ml-Röhre.</li>
		<li>Ermitteln Sie die Gesamtzellzahl mit einer Neubauer-Kammer oder ähnlichem.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pelletieren Sie die Zellen durch Zentrifugation für 7 min bei 350 x g. Resuspendiert das Pellet in ausreichend vollständigem α-MEM mit 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL RANKL, um eine Konzentration von 1 x 106 Zellen/ml zu erhalten.</li>
	<li>Aspirieren Sie FBS-Lösung aus der CaP-beschichteten 96-Well-Platte und pipettieren Sie 200 μL Zellsuspension pro Well (2 x 105 Zellen/Well).</li>
	<li>Inkubieren Sie die OC-Vorläufer für den gewünschten Zeitraum oder mit den gewünschten Reagenzien, die für das experimentelle Design relevant sind. Normalerweise kann eine hohe Anzahl von großen und mehrkernigen OCs nach 6 Tagen beobachtet werden und wenn sich Resorptionsgruben bilden. Futterzellen mit frischem komplettem α-MEM-Medium mit 20 ng/mL M-CSF und 20 ng/mL RANKL jeden dritten Tag.</li>
	<li>Am Ende der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen, mit 4% Paraformaldehyd für 10 min fixieren und erneut mit PBS waschen.</li>
	<li>Verwenden Sie die festen OCs direkt zur Fluoreszenzfärbung oder lagern Sie sie bei 4 °C.</li>
</ol>5. Fluoreszenzfärbung von OCs und CaP-Beschichtung
<ol><li>Inkubieren Sie die fixierten Zellen mit Permeabilisierungspuffer (0,1% Triton in PBS) für 5 min.</li>
	<li>Färben Sie Aktinfilamente mit 100 μL AlexaFluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 min und aspirieren Sie die Färbelösung. 100 μL Hoechst 33342 Färbelösung (10 μg/ml in PBS) für 10 min in die Färbung von Kernen geben. DAPI kann auch verwendet werden.</li>
	<li>Färbung CaP-Beschichtung mit 100 μL 10 μM Calcein in PBS für 10 min. Dreimal mit PBS waschen und Bilder aufnehmen.</li>
	<li>Nach der Fluoreszenzbildgebung können die gleichen Platten verwendet werden, um die Resorptionsgrubenfläche durch Von-Kossa-Färbung zu quantifizieren. Waschen Sie dazu die Platten zweimal mit entionisiertem Wasser.</li>
</ol>6. Quantifizierung der gesamten Resorptionsgrubenfläche
<ol><li>Um die CaP-Beschichtung mit Von-Kossa-Färbung zu färben, inkubieren Sie mit 50 μL von 5% AgNO3 in deionisiertem Wasser pro Bohrung unter UV-Strahlung für 1 h, bis die Beschichtung auf dem Boden der Bohrlöcher braun geworden ist.</li>
	<li>Waschen Sie die Platte dreimal mit deionisiertem Wasser und nehmen Sie Hellfeldbilder auf. Ein Objektiv mit geringer Vergrößerung, z. B. ein 1,25-faches Objektiv, kann verwendet werden, um den gesamten Brunnen in einem Bild zu erfassen. Dies erleichtert die anschließende Bildanalyse. Alternative Methoden zur Erfassung des gesamten Bereichs des Brunnens können angewendet werden.</li>
	<li>Öffnen Sie eine Bilddatei mit ImageJ: File | | öffnen Bild | Typ | 8-Bit. Überprüfen Sie die Maßstabseinheit in der unteren rechten Ecke des Bildes mit der | "Gerade Linie" | analysieren Skalieren einstellen. Geben Sie die Länge in die Decke "Bekannte Entfernung" ein, geben Sie unter Längeneinheit eine neue Maßstabseinheit ein und aktivieren Sie das Kontrollkästchen Global.</li>
	<li>Liste der zu analysierenden Messparameter: | analysieren Legen Sie die Maße fest. Aktivieren Sie im Fenster Messwerte festlegen die Kontrollkästchen Fläche und Limit auf Schwellenwert.</li>
	<li>Messen Sie die Fläche der Gruben: Bild | | anpassen Schwellenwert. Aktivieren Sie im Fenster Schwellenwert das Kontrollkästchen Dunkler Hintergrund , und klicken Sie auf Auto. Der Bereich der Gruben färbt sich rot. Schließen Sie das Fenster Schwellenwert und wählen Sie | analysieren aus. Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei: Datei | Speichern unter.</li>
</ol>7. Quantifizierung der OC-Anzahl und -Größe sowie der normalisierten Resorptionsgrubenfläche
<ol><li>Öffnen Sie ein Fluoreszenzbild von Osteoklasten mit ImageJ und überprüfen Sie die Skalierungseinheit (siehe Schritt 6.3).</li>
	<li>Liste der zu analysierenden Messparameter: | analysieren Legen Sie die Maße fest. Aktivieren Sie im Fenster Messwerte festlegen das Kontrollkästchen Bereich .</li>
	<li>Skizzieren Sie die OCs mit ROI Manager und Polygon-Auswahl: Analysieren | Tools | ROI-Manager. Klicken Sie im Toolset auf Polygonauswahl, skizzieren Sie ein OC (Zellen mit Aktinring und ≥ drei Kernen) und klicken Sie im ROI-Manager-Fenster auf [t] hinzufügen . Wiederholen Sie die Gliederung, bis alle OCs enthalten sind.</li>
	<li>Anzahl und Größe von OCs messen: Wählen Sie alle Elemente im ROI-Manager aus und klicken Sie auf Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei: Datei | Speichern unter (Abbildung 3E).</li>
	<li>Messen Sie die Grubenfläche von Fluoreszenzbildern. Öffnen Sie das fluoreszierende Bild der Beschichtung, die mit dem Bild in Schritt 7.3 korreliert ist, und überprüfen Sie die Maßstabseinheit (siehe Schritt 6.3).<ol>
<li>Listen Sie die zu analysierenden Messparameter auf (siehe Schritt 6.4). Bild | auswählen | anpassen Schwellenwert. Deaktivieren Sie im Fenster Schwellenwert alle Kontrollkästchen, und klicken Sie auf Auto. Der Bereich der Gruben färbt sich rot. Schließen Sie das Fenster Schwellenwert und wählen Sie | analysieren aus. Messen. Speichern Sie die Ergebnisdatei.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Berechnen Sie die normalisierte Grubenfläche anhand der OC-Zahl.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier beschreiben wir eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay unter Verwendung von OCs, die in vitro von PBMCs abgeleitet und expandiert wurden. Die verwendeten CaP-beschichteten Zellkulturplatten können mit laborverfügbaren Materialien einfach vorbereitet und visualisiert werden. Zusätzlich zu den unsortierten PBMCs, die in diesem Protokoll übernommen wurden, wurden OCs, die aus murinen monozytären Zellen21 und Knochenmarkmakrophagenzellen<sup cl...

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Erratum: A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Osteoklasten (OCs) sind gewebespezifische Makrophagen, die aus hämatopoetischen Stammzellen (HSCs) gewonnen werden und zusammen mit Osteoblasten 1 eine zentrale Rolle beim Knochenumbauspielen. Sexualhormon-induzierte, immunologische und maligne Knochenerkrankungen, die Knochen systemisch oder lokal zerstören, sind auf übermäßige osteoklastische Aktivität zurückzuführen, einschließlich Menopause-bedingte Osteoporose2, rheumatoide Arthritis3, Parodontitis4, Myelom-Knochen-Krankheit5 und osteolytische Knochenmetastasen6. Im Gegensatz dazu können Defekte in der OC-Bildung und -Funktion auch Osteopetrose7 verursachen. HSCs werden unter Stimulation des Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF, Gensymbol ACP5) in OC-Vorläufer differenziert. In Gegenwart von M-CSF und Rezeptoraktivator des NF-κB-Liganden (RANKL, Gensymbol TNFSF11) differenzieren OC-Vorläufer weiter in mononukleäre OCs und fusionieren anschließend zu mehrkernigen OCs 8,9,10. Beide Zytokine M-CSF und RANKL sind unverzichtbar und ausreichend für die Induktion osteoklastischer Marker wie Calcitonin-Rezeptor (CT), Rezeptoraktivator des Kernfaktors κ B (RANK), Protonenpumpe V-ATPase, Chloridkanal 7 alpha-Untereinheit (CIC-7), Integrin β3, tartratresistente Säurephosphatase (TRAP, Gensymbol ACP5), lysosomale Cysteinprotease-Cathepsin K (CTSK) und Matrix-Metallopeptidase 9 (MMP9). Aktivierte OCs bilden eine Dichtungszone auf der Knochenoberfläche durch die Bildung eines Aktinrings mit einem gerüschten Rand11,12. Innerhalb der Dichtungszone vermitteln OCs die Resorption durch Sekretion von Protonen über die Protonenpumpe V-ATPase 12,13, MMP914 und CTSK 15, was zur Bildung von Lücken führt.
Für In-vitro-Experimente können OC-Vorläufer durch Expansion von Knochenmarkmakrophagen aus Femur und Tibia 16,17 von Mäusen sowie durch Isolierung von humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) aus Blutproben und Buffy Coats18,19,20 oder durch Differenzierung der immortalisierten murinen monozytären Zellen RAW 264.7 21,22 erhalten werden.
Im vorliegenden Protokoll beschreiben wir einen osteoklastischen Resorptionsassay in CaP-beschichteten Zellkulturplatten unter Verwendung von OCs, die von primären PBMCs abgeleitet sind. Die hier verwendete CaP-beschichtete Zellkulturplattenmethode wurde von der zuvor von Patntirapong et al.17 und Maria et al.21 beschriebenen Methode übernommen und verfeinert. Um OC-Vorläufer zu erhalten, werden PBMCs durch Dichtegradientenzentrifugation isoliert und wie zuvor beschriebenexpandiert 20.

<table><tbody><tr><td>AgNO3</td><td>SERVA Electrophoresis GmbH</td><td>35110</td><td>Silbernitrat</td></tr><tr><td>a-MEM</td><td>Gibco</td><td>32561-029</td><td>MEM alpha, GlutaMAX, keine Nukleoside</td></tr><tr><td>Amphotericin B</td><td>Biochrom</td><td>03-028-1B</td><td>Amphotericin B Lösung</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21097-50G</td><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td></tr><tr><td>Calcein</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0875</td><td>Calcein</td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7524</td><td>fötales Rinderserum</td></tr><tr><td>Ficoll</td><td>Cytiva</td><td>17144002</td><td>Ficoll Paque Plus</td></tr><tr><td>Fixierungspuffer</td><td>Biolegend</td><td>420801</td><td>Paraformaldehyd</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Merk</td><td>1.09057.1000</td><td>Salzsäure</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Promokine</td><td>PK-CA707-40046</td><td>Hoechst 33342</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>PeproTech</td><td>300-25</td><td>Rekombinantes humanes M-CSF</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7791-18-6</td><td>Magnesiumchlorid</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2943,0250</td><td>di- Natriumhydrogenphosphat wasserfrei</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td>S7653-250G</td><td>Natriumchlorid</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Merk</td><td>K15322429</td><td>Natriumbikarbonat</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>17-512F</td><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1X), DBPS ohne Calcium und Magnesium</td></tr><tr><td>Pen-Strep</td><td>Lonza</td><td>DE17-602E</td><td>Penicillin-Streptomycin-Gemisch</td></tr><tr><td>Phalloidin-Alexa Fluor 546</td><td>Invitrogen</td><td>A22283</td><td>Alexa Fluor 546 Phalloidin</td></tr><tr><td>RANKL</td><td>PeproTech</td><td>310-01</td><td>Rekombinanter humaner sRANK-Ligand (E.coli-abgeleitet)</td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93362</td><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Alkylphenyl-Polyethylenglykol</td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Gibco</td><td>12605010</td><td>rekombinante Zelldissoziationsenzyme</td></tr></tbody></table>

ein einfaches pit-assay-protokoll zur visualisierung und quantifizierung der osteoklastischen resorption in vitro

A Simple Pit Assay Protocol to Visualize and Quantify Osteoclastic Resorption In Vitro

Reife Osteoklasten sind mehrkernige Zellen, die Knochen durch die Sekretion von Säuren und Enzymen abbauen können. Sie spielen eine entscheidende Rolle bei verschiedenen Erkrankungen (z.B. Osteoporose und Knochenkrebs) und sind daher wichtige Forschungsgegenstände. In vitro kann ihre Aktivität durch die Bildung von Resorptionsgruben analysiert werden. In diesem Protokoll beschreiben wir eine einfache Pit-Assay-Methode unter Verwendung von mit Calciumphosphat (CaP) beschichteten Zellkulturplatten, die leicht visualisiert und quantifiziert werden können. Osteoklastenvorläufer, die aus humanen peripheren mononukleären Blutzellen (PBMCs) gewonnen wurden, wurden auf den beschichteten Platten in Gegenwart von osteoklastogenen Reizen kultiviert. Nach 9 Tagen Inkubation wurden Osteoklasten fixiert und für die Fluoreszenzbildgebung gefärbt, während die CaP-Beschichtung durch Calcein gefärbt wurde. Um die resorbierte Fläche zu quantifizieren, wurde die CaP-Beschichtung auf Platten mit 5% AgNO3 gefärbt und durch Hellfeldbildgebung visualisiert. Die Resorptionsgrubenfläche wurde mit ImageJ quantifiziert.

Die Calciumphosphatbeschichtung auf dem Boden der Zellkulturplatten wurde in zwei Beschichtungsschritten durchgeführt, die eine 3-tägige Vorverkalkung und einen 1-tägigen Verkalkungsschritt umfassten. Wie in Abbildung 1 gezeigt, wurde gleichmäßig verteiltes Calciumphosphat auf der Unterseite der 96-Well-Platten erhalten. Die Beschichtung haftet nach den durchgeführten Waschschritten sehr gut am Boden.
<img alt="Figure 1" ...

Hier stellen wir ein einfaches und effektives Assay-Verfahren für Resorptionsgruben-Assays mit Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten vor.

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

Mature osteoclasts are multinucleated cells that can degrade bone through the secretion of acids and enzymes. They play a crucial role in various diseases ...

Unser Protokoll beschreibt eine einfache und zuverlässige Methode für einen osteoklastischen Resorptionsassay. Die Verwendung von mit Calciumphosphat beschichteten Zellkulturplatten kann mit Hilfe von im Labor verfügbaren Materialien leicht vorbereitet und visualisiert werden. Im Gegensatz zu undurchsichtigen Knochen- oder Dentinscheiben ermöglicht die Calciumphosphatbeschichtung die gleichzeitige Visualisierung von Resorptionsgruben und -zellen.In diesem Protokoll verwenden wir PBMCs zur Osteoklastendifferenzierung. Es kann jedoch auch auf andere Zelltypen wie aus Knochenmark abgeleitete Monozyten oder Raw 264.7-Zellen angewendet werden. Nehmen Sie zuerst eine flache Bodenzellkulturplatte mit 96 Vertiefungen und pipettieren Sie 300 Mikroliter zuvor vorbereitete Calciumphosphatlösung in jede Vertiefung.Dann bedecken Sie die Platte mit dem Deckel und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius für drei Tage. Nach drei Tagen aspirieren Sie die Vorverkalkungslösung aus den vorverkalkten 96 Zellkulturplatten und fügen Sie 300 Mikroliter Calciumphosphatlösung zu jeder Vertiefung hinzu. Decken Sie die Platten mit einem Deckel ab und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für einen Tag.Dann drehen Sie die Platte um, um die Lösung auszugießen, und waschen Sie die Platte dreimal gründlich mit deionisiertem Wasser. Trocknen Sie die Platte sofort mit einem Haartrockner oder komprimiertem Kohlendioxid oder Stickstoffgas, um eine gleichmäßige Oberfläche zu erhalten. Bestrahlen Sie nun die beschichtete Platte auf einer sauberen Bank eine Stunde lang mit ultravioletten Strahlen.Verwenden Sie die beschichtete Platte sofort oder versiegeln Sie die Platte mit Parafilm und lagern Sie sie bei Raumtemperatur. Verdünnen Sie 15 Milliliter frisches Blut mit einem gleichen Volumen PBS und mischen Sie sie durch mehrmaliges Umdrehen oder Pipettieren. Nehmen Sie dann 15 Milliliter Dichtegradientenlösung in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen, kippen Sie das Röhrchen und schichten Sie vorsichtig 30 Milliliter verdünnte Blutprobe auf die 15 Milliliter Dichtegradientenlösung.Später zentrifugieren Sie das Rohr in einem schwingenden Schaufelrotor ohne Pause bei 810 mal G für 20 Minuten bei 20 Grad Celsius. Dann aspirieren Sie die obere Schicht und lassen Sie die mononukleäre Zellschicht ungestört an der Grenzfläche. Übertragen Sie die mononukleäre Zellschicht vorsichtig auf ein neues 50-Milliliter-konisches Rohr.Füllen Sie das Röhrchen mit PBS, mischen und zentrifugieren Sie bei 300 mal G für 10 Minuten bei 20 Grad Celsius. Resuspendieren Sie PBMCs in einem vollständigen Alpha-MEM, das 20 Nanogramm pro Milliliter Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor enthält, und säen Sie 2,5 mal 10 bis die fünften Zellen pro Zentimeter Quadrat PBMCs in einem Kolben. Inkubieren Sie die mit Calciumphosphat beschichteten Platten mit 50 Mikrolitern fetalem Rinderserum bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.Als nächstes waschen Sie den Kolben zweimal mit PBS, um die Osteoklastenvorläufer von toten oder nicht adhärenten Zellen zu lösen, und fügen Sie dann vier Milliliter Trypsin pro 75 Quadratzentimeter Kolben hinzu. Stoppen Sie nach 30 Minuten die Verdauung, indem Sie vier Milliliter vollständiges Alpha-MEM hinzufügen, und lösen Sie die Zellen vorsichtig mit einem Zellenschaber ab. Übertragen Sie die Zellen in ein 50-Milliliter-Röhrchen und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen mit einer Zählkammer.Zentrifen Sie das Röhrchen bei 350 mal G für sieben Minuten, um die Zellen zu pelletieren und das Pellet wiederzubeleben und das Alpha-MEM mit M-CSF und RANKL zu vervollständigen, um einmal 10 bis zu den sechs Zellen pro Milliliter zu erhalten. Saugen Sie das fetale Rinderserum von der mit Calciumphosphat beschichteten Platte ab und pipettieren Sie 200 Mikroliter Zellsuspension pro Well. Nach der Inkubation die Zellen zweimal mit PBS waschen.Fixieren Sie die Zellen mit 4% Paraformaldehyd für 10 Minuten und waschen Sie sie erneut mit PBS. Für die Färbung fügen Sie den festen Zellen Permeabilisierungspuffer hinzu und inkubieren Sie sie für fünf Minuten. Um die Aktinfilamente zu färben, inkubieren Sie die Zellen mit 100 Mikrolitern Alexa Fluor 546-markierter Phalloidinlösung in PBS für 30 Minuten, saugen dann die Färbelösung ab und färben Sie die Kerne mit 100 Mikrolitern Hoechst für 10 Minuten.Färben Sie die Calciumphosphatbeschichtung mit 100 Mikrolitern 10 mikromolarem Calcein und PBS für 10 Minuten. Nachdem Sie dreimal mit PBS gewaschen haben, nehmen Sie Bilder auf. Für die Von Kossa-Färbung der Calciumphosphatbeschichtung fügen Sie 50 Mikroliter 5% Silbernitrat und deionisiertes Wasser zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie die Platte unter ultravioletter Strahlung für eine Stunde, bis die Beschichtung auf dem Boden der Bohrlöcher braun geworden ist.Die Calciumphosphatbeschichtung am Boden der 96 Wellplatten schien gleichmäßig und gut haftend zu sein. Nach neun Tagen Kultur in M-CSF und RANKL auf den mit Calciumphosphat beschichteten Platten bildeten Osteoklastenvorläufer Resorptionsgruben und große Osteoklasten. Die in den Gruben befindlichen mehrkernigen Osteoklasten drückten hohe TRAP-Werte aus.Die reifen Osteoklasten zeigten das Vorhandensein von drei oder mehr Kernen und den ausgeprägten Aktinring. Die grüne Calciumphosphatbeschichtung zeigte das Vorhandensein von schwarzen Resorptionsgruben. Die Fluoreszenzbilder der Grubenfläche wurden mit dem Schwellenwertwerkzeug von Bild J gemessen.Die Anzahl und Größe der Osteoklasten wurden mit dem ROI-Manager und dem Polygonauswahlwerkzeug von Bild J berechnet.Osteoklasten-Vorläufer, die in Abwesenheit von RANKL gezüchtet wurden, konnten keine Resorptionsgruben bilden, jedoch erleichterten M-CSF und RANKL die Bildung von osteoklastogenen Gruben.Und die Grubenfläche wurde mit dem Bild J quantifiziert.Das sofortige Trocknen der beschichteten Platte mit Luftstrom hilft, eine gleichmäßige Calciumphosphatbeschichtung herzustellen. Andernfalls neigt es dazu, eine dickere Beschichtung in der Mitte des Brunnens zu bilden.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video demonstriert die tartratresistente saure Phosphatase-Färbetechnik zum Nachweis des Vorhandenseins von TRAP-haltigen Granulaten in Osteoklasten. Die Technik bildet magentafarbene Farbstoffgranulatablagerungen im Zytoplasma von Osteoklasten und macht sie unter einem inversen Mikroskop sichtbar.

Tartrat-resistente saure Phosphatase-Färbung: Eine In-vitro-Technik zum Nachweis von TRAP-Enzym-haltigen kultivierten Osteoklasten

In diesem Video beschreiben wir einen in vitro osteoklastischen Resorptionsassay auf Calciumphosphat-beschichteten Zellkulturplatten, die mit mononukleären Osteoklasten aus humanem peripherem Blut kultiviert wurden. Die Osteoklasten bilden einen charakteristischen Aktinring auf der mit Calciumphosphat ummantelten Matrix der Zellkulturplatte und bauen die Matrix innerhalb der Aktinringregion ab, um Calcium- und Phosphationen freizusetzen, was zur Bildung ausgeprägter Resorptionsgruben innerhalb...

Resorptionsgruben-Assay: Eine In-vitro-Technik zur Quantifizierung der Calciumresorptionsaktivität reifer Osteoklasten unter Verwendung von Calciumphosphat-beschichteten Kulturplatten

In diesem Video beschreiben wir eine Methode zum Nachweis von Osteoblasten-sezernierten Kalziumablagerungen mit einem anionischen Farbstoff, Alizarin Red S. Die kultivierten Osteoblasten werden zuerst gefärbt und dann wird der Farbstoff für die kolorimetrische Quantifizierung von Kalziumablagerungen oder des Grades der Osteoblastenmineralisierung zurückgewonnen.

In-vitro-Mineralisierungsassay: Eine kolorimetrische Methode zur Quantifizierung von Osteoblasten-Kalziumablagerungen auf Knochentransplantatersatz durch Alizarinrot-Färbung und -Extraktion

Osteoklasten sind die Haupt knochenresorbierenden Zellen im Körper. Eine Fähigkeit, die Osteoklasten in großer Zahl zu isolieren hat erhebliche Fortschritte im Verständnis der Osteoklasten Biologie geführt. In diesem Protokoll beschreiben wir ein Verfahren zur Isolierung, Kultivierung und Quantifizierung der Osteoklastenaktivität in vitro.

Osteoklasten Ableitung aus Knochenmark der Maus

Dieses Manuskript beschreibt ein Protokoll zum isolieren und Kultur Osteoklasten in Vitro aus Maus Knochenmark und zur Untersuchung der Rolle von Säugetieren/mechanistischen Ziel von Rapamycin Komplex 1 in Osteoklasten-Formation.

Ein RANKL-basierte Osteoklasten Kultur Assay der Maus Knochenmark zu untersuchen, die Rolle von mTORC1 in Osteoklasten Bildung

Uran ist bekannt, Knochenstoffwechsel beeinflussen. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Untersuchung der Wirkung von natürlichem Uranexposition auf die Lebensfähigkeit, die Differenzierung und die Funktion der Osteoklasten, die Zellen verantwortlich für Knochenabbau.

Methoden zur Analyse der Auswirkungen des natürlichen Urans auf In-vitro- Osteoclastogenesis

In diesem Artikel präsentieren wir Methoden zum isolieren und Stromazellen Knochenmarkzellen und Blutstammzellen von Röhrenknochen Maus unterscheiden. Zwei verschiedene Protokolle sind nachgiebig unterschiedliche Zellpopulationen geeignet für Erweiterung und Differenzierung in Adipozyten, Osteoblasten und Osteoklasten vorgestellt.

Isolation, Kultur und Differenzierung von Stromazellen Knochenmarkzellen und Osteoklasten-Vorläufer von Mäusen

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Biologische Verträglichkeit Profil auf Biomaterialien für Knochenregeneration

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Osteoklasten sind wichtige knochenresorbierende Zellen im Körper. Dieses Protokoll beschreibt eine zuverlässige Methode zur in vitro Differenzierung von Osteoklasten aus humanen Monozyten im peripheren Blut. Diese Methode kann als wichtiges Werkzeug verwendet werden, um die Osteoklastenbiologie in der Homöostase und bei Krankheiten besser zu verstehen.

Abgrenzung funktioneller Osteoklasten von CD14+ Monozyten aus humanem peripherem Blut

Lernen Sie ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro mit PBMCs und calciumphosphatbeschichteten Platten. Diese Methode ermöglicht gleichzeitige Darstellung von Resorptionspits und Zellen.

Ein einfaches Pit-Assay-Protokoll zur Visualisierung und Quantifizierung der osteoklastischen Resorption in vitro

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