Charakterisierung einzelner extrazellulärer Vesikel-Transmembranproteine mittels Nano-Durchflusszytometrie

Die eingehende Charakterisierung von Elektrofahrzeugen kann eine Herausforderung darstellen und erfordert mehrere Instrumente, um einzelne Parameter zu beschreiben. Die Messung dieser Schlüsselkriterien in einer einzigen Technik wie der Nano-Durchflusszytometrie beschreibt mehrere EVs-Subpopulationen gleichzeitig. So wird jedes EV einzeln gemessen, um Partikel mit einem Durchmesser von mehr als 14 Nanometern markierungsfrei zu identifizieren, bevor ihre Fluoreszenz bestimmt wird.

Dies sorgt für einen robusten Datensatz, indem falsch positive Ergebnisse entfernt werden. Die Nano-Durchflusszytometrie kann auf EVs aus einer Vielzahl von Quellen angewendet werden, einschließlich solcher, die mit Plasma, Liquor und Kulturmedium angereichert sind. Diese Technik wird auch für die Analyse von Viren, Lipidnanopartikeln und Nanomaterialien verwendet.

Es ist wichtig, das Kennzeichnungsprotokoll zu optimieren. Dies maximiert die mit einem Partikel verbundene Fluoreszenz im Vergleich zu einer Restfluoreszenz, die im Puffer verbleibt. Schalten Sie zunächst das Gerät ein, laden Sie Nano-Flow Profession und wählen Sie Start Up aus dem Dropdown-Menü Sheath Flow, laden Sie Wasser in die Ladebucht und wählen Sie Boosting aus dem Dropdown-Menü Sheath Flow aus.

Verdünnen Sie die QC-Perlen eins auf 100 in destilliertem Wasser in einem 0,6-Mikroliter-Röhrchen und legen Sie sie in die Laderampe, um die Probe in das System einzuführen. Steigern Sie dann die Probe für 45 Sekunden, wie zuvor gezeigt, um die vorherige Probe, das Wasser oder die Reinigungslösung vollständig zu ersetzen. Stellen Sie während des Boostens die Laserleistung auf die voreingestellte Vorlage für QC-Perlen auf 250 Nanometer FL QC-Standard ein.

Um später den Systemdruck zu reduzieren, wählen Sie den Probenahmedruck aus demselben Dropdown-Menü aus und stellen Sie den automatischen Probenahmedruck auf ein Kilo Pascal ein, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Starten Sie dann die einminütige Analyse, indem Sie in den Erfassungssteuerelementen die Option Aufnahmezeit auswählen. Die Daten werden im Punktdiagramm dargestellt, das eine logarithmische Skala für die Seitenstreuintensität und eine ausgewählte Fluoreszenzintensität zeigt.

Geben Sie vor dem Speichern der Datei den Dateinamen und die Probenverdünnung ein. Wählen Sie anschließend Entladen, um das Rohr aus der Laderampe zu entfernen. Ersetzen Sie die QC-Perlen durch 150 Mikroliter Reinigungslösung und reinigen Sie sie länger als 30 Sekunden, indem Sie Boosting auswählen.

Entfernen Sie mit einem Röhrchen mit 150 Mikrolitern Wasser überschüssige Reinigungslösung von der Kapillarspitze, indem Sie die Spitze in Wasser tauchen. Anschließend die Größe Standardperlen eins auf 100 in Wasser verdünnen und 100 Mikroliter in die Laderampe laden. Stellen Sie nun die Laserleistung auf die voreingestellte Vorlage S16 EXO 68 auf 155 Nanometer ein.

Diese Einstellung gilt sowohl für den Größenstandard als auch für Proben, die Elektrofahrzeuge kleiner als 200 Nanometer enthalten. Wählen Sie die Probenahme und fahren Sie mit der Aufzeichnung der Probe für eine Minute fort. Führen Sie die dritte Messung entweder mit einer Wasser- oder PBS-Probe durch, um eine leere Messauswertung zu erstellen, die Fehlalarme zur Entfernung durch die Software identifiziert.

Die unmarkierten EV-Proben in PBS werden auf einen geeigneten Partikelkonzentrationsbereich von einmal 10 bis achtmal 10 bis achte Partikel pro Milliliter für die nFCM-Analyse verdünnt. Und laden Sie 10 bis 100 Mikroliter der verdünnten Probe in die Laderampe. Wenn die Partikelkonzentration unbekannt ist, beginnen Sie mit einer Verdünnung der EV-Probe von eins bis 100.

Die Probenkonzentration kann schnell durch die Größe des Laserspots auf der CCD-Kamera während der Verstärkung oder durch Beobachtung der Ereignis-Burst-Spur während der Probenahme angenähert werden. Sobald die geladene Probe für 45 Sekunden erhöht wurde, zeichnen Sie eine Minute lang auf und speichern Sie die Datei wie zuvor gezeigt. Beginnen Sie nach der Aufzeichnung mit der Analyse dieser Daten, wechseln Sie von der Registerkarte Erfassung zur Registerkarte Analyse und öffnen Sie die gespeicherten NFA-Dateien.

Für eine genaue Probenmessung verwenden Sie die beiden Standardmessungen, die vor der Probenahmemessung durchgeführt wurden, um Werte für den Probenvergleich sowie den Blindwert festzulegen. Erstellen Sie die Größenstandardkurve für die Konvertierung von Seitenstreuung in Durchmesser, indem Sie die Größenstandarddatei auswählen und das Werkzeug zum Festlegen des Schwellenwerts verwenden. Der Schwellenwert, der in der Ereignis-Burst-Spur sichtbar ist, identifiziert die minimale Signalintensität, die erforderlich ist, damit ein Ereignis als signifikant angesehen wird.

Überprüfen Sie bei festgelegtem Schwellenwert die Punktplotparameter SS-H oder SS-A auf der X-Achse und FITC-A auf der Y-Achse. Öffnen Sie das Werkzeug Standardkurvengenerierung und wählen Sie S16 EXO 68 bis 155 Nanometer als Größenvorlage aus. Klicken Sie auf Peaks suchen, um die Streuintensitäten der Peakseite als Partikel mit einem Durchmesser von 68, 91, 113 oder 155 Nanometern zu identifizieren.

Überprüfen Sie vor dem Schließen des Fensters, ob die auf Durchmesser gestreute Seitenkurve mit einem R-Wert nahe Eins erzeugt wurde. Legen Sie den Konzentrationsstandard fest. Wählen Sie die gespeicherte Datei aus, klicken Sie auf Zählstandard und geben Sie die Partikelkonzentration des Standards ein.

Legen Sie die Standardinformationen fest. Wählen Sie die EV-Beispieldatei aus und legen Sie den Schwellenwert fest. Wählen Sie die leere Datei aus und klicken Sie auf leer setzen, um die Anzahl der Fehlalarme zu identifizieren, die aus der Stichprobenzählung entfernt werden sollen.

Sobald das PDF-Generierungstool geöffnet ist, überprüfen Sie die Größe, Konzentration und die Verdünnungen der Probe. Zeigen Sie dann die Konzentration der Probe und die Größenverteilung der Partikel. Nachdem Sie die EV-Proben wie im Manuskript beschrieben gekennzeichnet haben, nehmen Sie einen Mikroliter der markierten Probe und verdünnen Sie einen auf 50 in PBS in einem 0,6-Milliliter-Röhrchen.

Laden Sie die Probe in die Laderampe und üben Sie 45 Sekunden lang einen Verstärkungsdruck aus. Stellen Sie außerdem sicher, dass die richtigen Lasereinstellungen und die entsprechenden Linsen geladen sind. Wechseln Sie nun zum Abtastdruck und wählen Sie die Aufnahmezeit aus.

Nach der einminütigen Erfassung benennen Sie die Datendatei und speichern sie. Entladen Sie die Probe, ersetzen Sie sie durch eine Reinigungslösung und verstärken Sie die Reinigungslösung für mehr als 30 Sekunden, bevor Sie die nächste beschriftete Probe laden, wie zuvor gezeigt. Wenden Sie für die PDF-Generierung die gleichen Standards wie zuvor demonstriert an.

Nur die Blindwertmessung wird anders eingestellt. Wählen Sie die Beispieldatei aus, und legen Sie den Schwellenwert fest. Wählen Sie das Gating-Tool aus und verwenden Sie den Linksklick, um eine Linie zu zeichnen, die die fluoreszenzpositive Population trennt.

Legen Sie die Namen und Farben für die Darstellung fest. Legen Sie die leere Datei fest und klicken Sie auf leer festlegen, um die Anzahl der Fehlalarme zu ermitteln, die aus jeder einzelnen Population entfernt werden sollen. Öffnen Sie das PDF-Generierungswerkzeug und identifizieren Sie die Größenverteilung, Konzentration und den Prozentsatz der fluoreszenzpositiven Teilpopulation.

Ändern Sie im Punktdiagramm die Y-Achse, um Fluoreszenzmessungen aus dem grünen oder roten Kanal anzuzeigen. Setzen Sie das Leerzeichen und generieren Sie die PDF-Datei wie zuvor gezeigt. Legen Sie im Punktdiagramm die X-Achse auf FITC und die Y-Achse auf APC fest.

Verwenden Sie das Quadrantenwerkzeug, um doppelt fluoreszierende positive Populationen zu identifizieren. Legen Sie Namen und Farben so fest, dass sie repräsentativ sind, öffnen Sie dann die PDF-Datei und wählen Sie die fluoreszierenden Teilpopulationen aus. C2C12-abgeleitete Elektrofahrzeuge zeigten etwa 50% CD9, 30% CD63-Präsentation, und 70% der Bevölkerung wiesen mindestens einen der drei EV-Marker auf.

Die Größenprofile für einzelne Tetraspanin-markierte EV-Subpopulationen zeigten eine größere mediane Größe von etwa 75 bis 85 Nanometern und weniger als 65 Nanometer EVs im Vergleich zur gesamten Partikelpopulation. SW620-abgeleitete Elektrofahrzeuge zeigten etwa 40% CD9, 7% CD63-Präsentation und 42% der Partikel mit mindestens einem der drei Marker. Die SW620-abgeleiteten, Tetraspanin-markierten EVs zeigten eine normalere Verteilung und einen größeren Mediandurchmesser zwischen 90 und 110 Nanometern mit ähnlichen Verteilungen zwischen einzelnen Tetraspanin-positiven Subpopulationen.

Die Membranmarkierung zeigte wiederholt eine Positivität von 80% von C2C12- und SW620-abgeleiteten EVs. Die Seitenstreuintensität korrelierte mit der FITC-Intensität in den Punktdiagrammen von C2C12 und SW620. Die doppelt positiven Prozentsätze sind den Tetraspanin-positiven Prozentsätzen sehr ähnlich.

Und die CD63-Markierung scheint die schwächste Korrelation zur Membranmarkierung zu zeigen. Die prozentualen Positivitätsmessungen waren zwischen der Antikörpermarkierung mit und ohne zusätzliche Membranmarkierung ähnlich. Die mittlere Fluoreszenzintensität für die fluoreszierenden Populationen von C2C12-abgeleiteten EVs deutete auf eine niedrigere Präsentation von CD63 und CD81 im Vergleich zu CD9-EVs hin, während SW620 zeigte, dass die Verwendung aller drei Antikörper ein größeres Fluoreszenzsignal liefert als jede einzelne Antikörpermarkierung In diesem Protokoll wurden gängige EV-Marker fluoreszierend markiert, aber viele der Antikörperziele können ausgewählt werden, um den EV-Ursprung zu zeigen. die EV-Funktion oder der Krankheitszustand.