Mikrotransplantation synaptischer Membranen zur Reaktivierung humaner synaptischer Rezeptoren für funktionelle Studien

Neurodegenerative und psychische Störungen resultieren aus Veränderungen der synaptischen Kommunikation. Multifaktorielle Ereignisse verändern synaptische Rezeptoren auf eine Weise, die wir nicht vollständig verstehen. Die Mikrotransplantation synaptischer Membranen gibt Aufschluss über diese Veränderungen.

Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Möglichkeit, die Aktivität nativer Gehirnrezeptoren aufzuzeichnen, die im menschlichen Gehirn arbeiten, und somit die von uns untersuchten Krankheiten darzustellen. Synaptische Rezeptoren sind wichtige Ziele für die Medizin, die die elektrische Aktivität des Gehirns reguliert, aber wenn man versteht, wie sich diese Rezeptoren verändern, können bessere Therapien entwickelt werden, die ihre Funktionalität wiederherstellen. Diese Methode wurde erfolgreich auf verschiedene Arten angewendet, von Insekten, Fischen, Säugetieren, kann aber auch auf Membranrezeptoren außerhalb des Gehirns angewendet werden, zum Beispiel Muskeln und Tumore.

Die Möglichkeiten sind vielfältig. Das Trimmen von Injektionsnadeln ist schwierig. Zu klein kann die Proteininjektion verhindern, und zwei große können die Zelle töten.

Es hilft, eine konsistente Messung zu verwenden, wie die Kante einer Rasierklinge. Beginnen Sie mit der Beschallung der ausgewählten Proben, die aus der interessierenden menschlichen Gehirnregion hergestellt wurden, dreimal in einem Bad mit schwimmendem Nasseis. Verwenden Sie jedes Mal fünf Sekundenzyklen und warten Sie zwischen den Zyklen eine Minute auf nassem Eis.

Legen Sie einen Mikroliter der Probe auf den Thermoplast und machen Sie bei Bedarf eine Einkerbung auf der Oberfläche, bevor Sie die Probe platzieren, um eine Bewegung der Probe zu verhindern. Verwenden Sie die Knöpfe des Manipulators, der den Nanoinjektor hält, um die Nadel zu positionieren, und bewegen Sie sie in Richtung der zu füllenden Probe. Sobald sich die Nadelspitze in der Probe befindet, halten Sie die Fülltaste gedrückt, bis genügend Probe entnommen ist.

Etwa 0,5 Mikroliter Probe wird für 10 Eizellen benötigt. Verwenden Sie die Knöpfe, um die Nadel des Nanoinjektors wieder in die höchste Position zu bringen. Dringen Sie mit einer Nadel in die Eizelle direkt unter der Oberfläche ein, nicht tiefer, und verwenden Sie das Fußpedal, um die Probe zu injizieren.

Warten Sie etwa zwei bis drei Sekunden. Nach erfolgreicher Injektion dehnt sich die Zelle aus. Verwenden Sie die Knöpfe am Manipulator, um die Zelle zu verlassen.

Bewegen Sie die Petrischale so, dass die nächste Eizelle mit der Nadel ausgerichtet ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die gewünschte Anzahl von Eizellen in der Schale injiziert wurde, ziehen Sie dann den Nanoinjektor in seine ursprüngliche Position zurück und entfernen Sie die Nadel. Stellen Sie sicher, dass eine Zelle der Eizellen nicht injiziert bleibt, um als Kontrolle verwendet zu werden.

Schalten Sie alle Geräte ein, die für die Aufzeichnung von Ionenströmen verwendet werden, schalten Sie dann den Desktop-Computer ein und melden Sie sich bei WinEDR Version 3.9.1 an. Stellen Sie sicher, dass das Programm ausgeführt wird und der Datensatz auf Disc festgelegt ist. Legen Sie anschließend die Aufnahmedauer fest und deaktivieren Sie die Option Simulator.

Schalten Sie für den Spannungselektrodenabschnitt die negative Kapazitätskompensation aus. Stellen Sie den Verstärkungswahlschalter für den Badelektrodenabschnitt auf 10 und dann den dreistufigen Kippschalter, der den Verstärkungsmultiplikator auswählt, auf x1 ein. Die LED-Leuchten zeigen die Auswahl des Verstärkungsmultiplikators an.

Schalten Sie den Klemmmoduswähler aus, setzen Sie den DC-Verstärkungsregler ein und stellen Sie den Verstärkungsregler auf etwa die Hälfte des offenen Regelkreises mit voller Bandbreite ein. Legen Sie Befehle auf 40 Millivolt, die Halteregler auf negativ und den Skalenmultiplikator auf x2 fest. Verwenden Sie für die Stromelektrode den VE-Offset, um eine Nullreferenz herzustellen, bevor Sie die Eizelle aufspießen.

Öffnen Sie als Nächstes die Software WinEDR Version 3.9.1, gehen Sie zum oberen Menü und wählen Sie Datei, gefolgt von Neu. Erstellen Sie Ihren eigenen Ordner und speichern Sie die Datei. Wählen Sie im Hauptmenü "Aufzeichnen" und anschließend "Auf Festplatte aufzeichnen".

Platzieren Sie die Agarbrücken in den jeweiligen kreisförmigen Löchern hinter der Aufnahmekammer und verbinden Sie die Vertiefungen für die Elektroden, die als Bodenreferenz in der Aufnahmekammer verwendet werden. Fügen Sie 1x Ringer's Working Solution zum entsprechenden Perfusionsventil hinzu. Öffnen Sie das Ventil, bis die Aufnahmekammer mit Ringer's Solution gefüllt ist.

Mit dem rechten und linken Manipulator, der die Elektroden hält, führen Sie die Elektrodennadeln in die Aufnahmekammer, die mit Ringer's Solution gefüllt ist. Überprüfen Sie den Widerstand jeder Elektrode, indem Sie die VM- und VE-Offset-Regler auf Null setzen und dann die Elektrodentesttasten drücken. Der Widerstand sollte zwischen 0,5 und drei Megaohm liegen.

Wenn der Widerstand außerhalb des Bereichs liegt, ersetzen Sie ihn durch neue Mikroelektroden. Als nächstes füllen Sie die Aufnahmekammer mit frischer Ringer's Solution. Verwenden Sie eine Glaspipette, um eine nicht injizierte oder mikrotransplantierte Eizelle in der Mitte der Aufnahmekammer zu platzieren.

Stellen Sie sicher, dass die Eizelle unter dem Mikroskop mit der Tierseite deutlich sichtbar ist. Führen Sie die Elektrode in die Ringerlösung, bis sie die Eizellmembran berühren. Durchbohren Sie vorsichtig die Eizellmembran auf der Tierseite mit beiden Elektroden und zeichnen Sie das ruhende Membranpotential auf.

Aktivieren Sie den Ringer's Solution-Fluss. Ändern Sie mit dem Oocyte Clamp Amplifier den Modus auf Spannung klemmen langsam und stellen Sie die Haltespannung auf 80 Millivolt ein. Der Strom auf dem Monitor sollte negativ sein, normalerweise zwischen 0 und 0,4 Mikroampere.

Wechseln Sie zu Datei, Neu, und speichern Sie dann die Aufzeichnung in der Software, um eine neue Datei zu erstellen, und speichern Sie die Aufzeichnung. Drücken Sie Record, gefolgt von Record to Disc, um die Aufnahme zu starten. Fügen Sie der Datei mithilfe des Dialogfelds Diagramm markieren relevante Informationen hinzu.

Wenden Sie Agonisten zur chemischen Stimulation an, indem Sie die Ventile öffnen und sie 15 Sekunden lang in die Aufnahmekammer durchdringen. Sobald die Aufzeichnung abgeschlossen ist, drehen Sie die Spannungsklemme in die Aus-Position und schalten Sie das Ringer's Solution-Ventil aus. Entfernen Sie die Eizelle und verwerfen Sie sie gemäß den institutionellen Richtlinien für menschliche Gehirnproben, stoppen Sie dann die Aufnahme und speichern Sie die Datei.

Speichern Sie eine Kopie der Aufnahmen auf einem USB-Laufwerk. Von dort aus öffnen Sie die gewünschte Datei, die analysiert werden soll. Um die maximale AMPA-Antwort und die GABA-A-Spitzenantwort zu messen, legen Sie zunächst eine 0-Ebene oder Baseline fest, indem Sie die rote Linie suchen, und ziehen Sie sie dann auf den von der Ringer-Anwendung oder Baseline generierten Strom.

Sobald die 0-Stufe festgelegt ist, bestimmen Sie die Antwortmessungen, indem Sie den grünen vertikalen Auslesecursor auf den gewünschten Teil des Graph-Tracers ziehen. Ionenströme aus den Eizellen, die mit den Membranen der menschlichen synaptischen Rezeptoren injiziert wurden, wurden aufgezeichnet. AMPA-Rezeptoren wurden mit 100 mikromolaren Kainate- und GABA-A-Rezeptoren mit einem millimolaren GABA aktiviert.

Die Co-Injektion der gefilterten Membranen aus dem elektrischen Organ des Torpedos, das reich an Acetylcholinrezeptoren ist, und cDNA, die für den GABA-Row-One-Rezeptor in den Tierpol kodieren, produzierte hauptsächlich zwei Gruppen von Eizellen, basierend auf ihren Reaktionen. Eine Gruppe von Eizellen hatte große Reaktionen auf Acetylcholin, aber keine Reaktionen auf eine mikromolare GABA. Eizellen in einer anderen Gruppe hatten null oder niedrige Reaktionen auf Acetylcholin, aber große Reaktionen auf GABA.

Die grafische Abbildung zeigt den Mittelwert plus minus Standardfehler des Mittelwerts des Spitzenstroms in Gruppe eins und Gruppe zwei. Eine Eizelle in Gruppe zwei hatte große GABA- und Acetylcholinreaktionen, was auf den Bruch des Kerns hindeutet. Folglich war die Verteilung der Antworten auf niedrige Werte verzerrt, wie die Differenz zwischen dem Mittelwert und dem Median der Verteilung des Membranstroms zeigt.

Eine der Ursachen für die Eizellen mit geringer Reaktion ist, dass Membranen injiziert und in den Zellkern der Eizelle eingeschlossen werden. GABA- und Kainate-Reaktionen von Eizellen, die mit ungefilterten Membranen, die aus einem Nicht-AD-Gehirn und einem AD-Gehirn in die tierischen oder pflanzlichen Pole injiziert wurden, injiziert wurden, werden hier gezeigt. Eizellen, die in der Nähe des Tierpols injiziert wurden, ohne auf den Kern abzuzielen, gaben größere Reaktionen als Eizellen, die in den Pflanzenpol injiziert wurden, was die Untersuchung von Gewebeproben mit einer sehr geringen Anzahl von Rezeptoren ermöglichte.

Überwachen Sie beim Ausführen dieses Verfahrens immer Ihren Ringer-Pegel. Es ist immer während der wichtigen Aufnahmen, dass Sie ausgehen, und dann wird es Ihr Ergebnis und den Tod der Eizelle und den Verlust sehr wertvoller Daten verwenden. Nach diesem Verfahren können wir westliche Lasten durchführen, um das Vorhandensein der synaptischen Rezeptoren oder Proteine von Interesse zu validieren.

Es ermöglicht die Messung der globalen Erregung zur Hemmung synaptischer Verhältnisse in verschiedenen Hirnregionen und verschiedenen Gehirnstörungen, so dass theoretische Vorhersagen über die Ursachen von Krankheiten direkt getestet werden können.