Name: Modelle der murinen vaginalen Besiedlung durch anaerob gezüchtete Bakterien (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-25T14:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Erfahren Sie ein Mausmodell zur vaginalen Besiedlung mit anaerob gezüchteten Bakterien wie Gardnerella vaginalis. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Infektionen im weiblichen Genitaltrakt.

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Wir danken Lynne Foster für die technische Unterstützung bei der Entwicklung dieser Modelle. Wir freuen uns über Startkapital von der Abteilung für Molekulare Mikrobiologie und dem Center for Women's Infectious Disease Research (an AL) sowie den March of Dimes (Basil O'Connor-Preis an AL), die dazu beigetragen haben, Experimente im Frühstadium zu unterstützen. Auch das Nationale Institut für Allergie und Infektionskrankheiten (R01 AI114635) unterstützte die Entwicklung dieser Modelle.

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Die Autoren erklären, dass kein Interessenkonflikt besteht.

Der wichtigste Unterschied zwischen dem hier beschriebenen Modell und den bisher veröffentlichten vaginalen Impfmodellen ist die Verwendung von anaerob kultivierten Bakterien, die besondere Überlegungen für die Herstellung von lebensfähigem Inokulum und die Rückgewinnung von Bakterien aus den Mäusen erfordern. Spezifische Schritte im obigen Protokoll können je nach verwendeter Bakterienart/-stämme leicht variieren, wie in der Zusatzdatei 1 vorgeschlagen. Darüber hinaus beschreibt dieses Manuskript eine neue Verfahrensmethode für die Verabreichung von Bakterien und Vaginalspülungen, die weniger Erfahrung seitens des Prüfarztes und weniger Zurückhaltung für die Mäuse erfordert. Wenn der Experimentator mit der in Schritt 3.2 beschriebenen Form der Zurückhaltung nicht einverstanden ist. und Schritt 3.3. können die Mäuse stattdessen wie zuvor beschrieben34 mit oder ohne Anästhesie gemäß dem experimentellen Design und den institutionellen IACUC-Richtlinien gereinigt werden.
Ein wichtiger Vorbehalt bei der Verwendung von anaerob kultivierten Bakterien in Mausmodellen besteht darin, dass bestimmte Schritte (z. B. mit lebenden Tieren) außerhalb der anaeroben Kammer durchgeführt werden müssen. Daher sind die kritischsten Schritte in diesem Protokoll diejenigen, bei denen die interessierenden Bakterien einer aeroben Umgebung ausgesetzt werden, z. B. während der Impfung der Mäuse. Die Verwendung eines neuen Anaerobs in diesem Modell erfordert eine vorläufige Untersuchung seiner Fähigkeit, die Lebensfähigkeit bei Sauerstoffexposition aufrechtzuerhalten (z. B. der Vergleich von KFUs vor und nach der Impfung, wie in Schritt 2.5 und Schritt 3.4 beschrieben). Je nach Grad der Sauerstoff- und PBS-Empfindlichkeit des Organismus sollten unterschiedliche Methoden der Impfvorbereitung in Betracht gezogen werden (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.4.5.). Für Impfungen mit G. vaginalis JCP8151B haben wir festgestellt, dass ein einzelnes Inokulumröhrchen in PBS hergestellt und verwendet werden kann, um alle Mäuse zu infizieren. Wenn ein anderes anaerobes Bakterium verwendet wird, das sauerstoffempfindlicher ist, kann das Inokulum stattdessen in separaten Röhrchen für jede Maus vorbereitet werden, so dass ein wiederholtes Öffnen / Schließen des Röhrchens nicht erforderlich ist. Wenn die interessierende Bakterienart anspruchsvoller / weniger in der Lage ist, in PBS zu überleben als G. vaginalis, kann die Impfung stattdessen in Nährmedien hergestellt werden. Wenn das verwendete Medium Reduktionsmittel enthält, wie z. B. das anaerobe CDC-Medium, das zur Kultivierung von Prevotella bivia verwendet wird (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.1. und Schritt 2.2.), dann haben die Bakterien auch einen erhöhten Schutz vor Sauerstoffbelastung.
Alternative Verfahren zur Homogenisierung können ebenfalls in Betracht gezogen werden, wie z. B. das Kügelchen22,35, das bei geschlossenem Schlauchdeckel durchgeführt wird und daher weniger Sauerstoff einbringen kann als der tragbare Homogenisator. Darüber hinaus können sauerstoffempfindlichere Organismen eine längere Gleichgewichtszeit für Medien benötigen. Ein Sauerstoffindikator wie Resazurin kann verwendet werden, um zu überprüfen, ob anaerobe Bedingungen erreicht wurden (Schritt 2.1.). Alternative Methoden wie anaerobe Gläser können die Ergebnisse beeinflussen und sollten vor der Verwendung auf bakterielle Lebensfähigkeit überprüft werden.
Die Sauerstoffempfindlichkeit und -genauigkeit des Versuchsorganismus kann auch eine Rolle bei der erfolgreichen Gewinnung lebensfähiger Bakterien aus der Maus während der Lavage/Homogenisierung spielen (Ergänzungsdatei 1, Schritt 3.2. und Schritt 5.1.). Bei hochempfindlichen Organismen kann die Zeit zwischen der Spülung und der Beschichtung zu einem Verlust der Lebensfähigkeit führen und zu einer künstlich niedrigen Schätzung der bakteriellen vaginalen Besiedlung führen. Um diesen Effekt zu mildern, können gesammelte Lavagen sofort in frische anaerobe Nährmedien (mit Reduktionsmittel) verdünnt werden. In ähnlicher Weise kann die Organhomogenisierung in frischen Nährmedien anstelle von PBS durchgeführt werden, um die bakterielle Lebensfähigkeit zu erhöhen, und kann auch in der anaeroben Kammer selbst durchgeführt werden, um die Sauerstoffbelastung zu minimieren.
Je nach Zweck eines bestimmten Experiments muss der Experimentator auf Kontrollgruppen achten. Um Hypothesen zu testen, werden Baseline-Messungen von nicht infizierten Kontrollmäusen, die nur mit Vehikel behandelt werden, helfen festzustellen, ob es eine Induktion von Chemokinen / Zytokinen oder andere spezifische Infektionsergebnisse gibt. Das verwendete Kontrollvehikel muss das gleiche sein wie das Vehikel, das für die Beimpfung verwendet wird, d. h., wenn die Bakterien in Nährmedien beimpft werden, müssen unbeimpfte Nährmedien als Kontrolle verwendet werden (Ergänzungsdatei 1, Schritt 2.4.5.).
Die in diesem Protokoll beschriebenen Methoden könnten auch auf fakultative Bakterien angewendet werden, die anaerob wachsen können, aber traditionell unter aeroben Kulturbedingungen untersucht werden (wie Escherichia coli oder Streptokokken der Gruppe B). Dies könnte besonders relevant für Infektionen durch diese Organismen an Körperstellen sein, von denen angenommen wird, dass sie wenig Sauerstoff enthalten, wie z. B. der Gebärmutterhals. Es kann sein, dass ein fakultativer Organismus Stellen erfolgreicher mit weniger Sauerstoff infiziert, wenn das Inokulum anaerob als aerob hergestellt wird. In einem solchen Experiment erfordert die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien für die KBE-Zählung möglicherweise keine anaeroben Bedingungen.

Bei Säugetieren beherbergt die Vagina ein Konsortium von Bakterienarten. Das menschliche vaginale Mikrobiom ist einzigartig unter den Säugetieren in seiner Fülle an Mitgliedern der Gattung Lactobacillus und dem entsprechend niedrigen vaginalen pH-Wert (3,8-4,5)1,2,3,4. Eine Störung dieser Lactobacillus-Dominanz ist mit einer Vielzahl von negativen gesundheitlichen Folgen verbunden.
Bei der bakteriellen Vaginose (BV) gibt es weniger Laktobazillen und eine erhöhte Häufigkeit verschiedener anaeroben Bakterien wie Gardnerella vaginalis und Prevotella bivia 5,6. Frauen mit BV haben ein erhöhtes Risiko für sexuell übertragbare Infektionen 7,8,9, Unfruchtbarkeit 10, Schwangerschaftsverluste 11, Frühgeburten 12,13,14, intrauterine Infektionen 15, Gebärmutterhalsinfektionen 16 und Krebs16,17,18 . BV ist auch mit einer höheren Wahrscheinlichkeit einer vaginalen Besiedelung durch potentiell pathogene Bakterien verbunden, wie z.B. Fusobacterium nucleatum 1,19,20, ein häufiges Isolat aus Fruchtwasserinfektionen 21.
Aufgrund der Bedeutung von anaeroben Bakterien für die menschliche vaginale Gesundheit besteht ein Bedarf an Tiermodellen, mit denen die Biologie und Pathogenese dieser Organismen untersucht werden kann. Hier beschreiben wir Methoden zur vaginalen Inokulation und lebensfähigen Wiederherstellung von Gardnerella vaginalis in östrogenisierten Mäusen und schlagen zusätzliche Strategien für Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum vor. Andere Modelle der murinen vaginalen Besiedelung wurden bereits beschrieben, aber diese konzentrierten sich auf die Impfung und Erholung von fakultativen anaeroben Bakterien wie Streptococcus 22 der Gruppe B 22 und Neisseria gonorrhoeae23, die aerob kultiviert wurden. Die Beimpfung und Gewinnung von obligaten Anaerobier kann mit geeigneten experimentellen Strategien erfolgreich durchgeführt werden. Wir diskutieren Ansätze für die lebensfähige Wiederherstellung mehrerer bakterieller Taxa und schlagen eine empirische Bewertung der Bedingungen für die Lebensfähigkeit weiterer Spezies/Stämme vor.
Die klassische Methode zur Abschätzung der Besiedelung durch lebende Bakterien ist die Rückgewinnung von koloniebildenden Einheiten (KBE). Bei konventionell gezüchteten Mäusen mit ihrer eigenen endogenen Mikrobiota erfordert dies eine Erholung auf Agarmedien, die gegen Mitglieder der endogenen vaginalen Mikrobiota selektieren, während der inokulierte Bakterienstamm immer noch wachsen kann. Hier verwenden wir ein Streptomycin-resistentes Isolat von G. vaginalis24 , das selektiv auf einem Streptomycin-haltigen Agarmedium wiederhergestellt werden kann. Um sicherzustellen, dass das Medium ausreichend selektiv ist und umgekehrt keine Streptomycin-resistenten Bakterien im endogenen Mikrobiom vorhanden sind, sollten vaginale Lavagen, die kurz vor der Impfung gesammelt werden, auf selektivem (Streptomycin-haltigen) Agar plattiert werden.
Die beste Methode zur Impfvorbereitung kann je nach Bakterienart und -stämme variieren. Vor Beginn der Versuche an Mäusen sollten Vorarbeiten durchgeführt werden, um die bevorzugten Bedingungen für das Kulturmedium, den Wachstumsendpunkt und die Herstellung des Inokulums sowie die Empfindlichkeit gegenüber Sauerstoff und die Lebensfähigkeit bei PBS zu bestimmen. Bei sauerstoffempfindlicheren Bakterien können alternative Präparationen des Inokulums in Betracht gezogen werden (z.B. in einem anaeroben Nährmedium mit einer geeigneten Vehikel-Kontrollgruppe)25,26.

<table><tbody><tr><td>&beta;-Östradiol-17-Valerat</td><td>Sigma</td><td>E1631</td><td>Östrogenisierung von Mäusen</td></tr><tr><td>0,22 &micro; m, 50 mL Steriflip Vakuumfilter</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; SCGP00525</td><td>steril filtrierendes Sesamöl</td></tr><tr><td>14 mL Tube</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>Östrogenisierung von Mäusen</td></tr><tr><td>190-festes Ethanol</td><td>Koptec</td><td> V1105M</td><td>Dissektion, Gewebehomogenisierung, CDC und Columbia Medien</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Fisher</td><td>MT21040CM</td><td>vaginale Spülung, G. vaginlalis Inokulum Vorbereitung, Gewebeentnahme und Homogenisierung</td></tr><tr><td>25 G & times 5/8 -in Nadel</td><td>BD</td><td>305122</td><td>Östrogenisierung von Mäusen</td></tr><tr><td>5 ml Röhrchen</td><td>Falcon</td><td>352063</td><td>Gewebeentnahme und Homogenisierung</td></tr><tr><td>Anaerobe Kammer</td><td>Coy</td><td>7200000</td><td>Wachstum von anaeroben Bakterien</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Fisher</td><td>DF0140074</td><td>G. vaginalis, F. nucleatum und P. bivia Agarplatten</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>Fisher</td><td>DF0118170</td><td>CDC anaerobes Medium für das Wachstum von P. bivia</td></tr><tr><td>Columbia Bouillon</td><td>Fisher</td><td>DF0944170</td><td>Columbia Medium für das Wachstum von F. nucleatum</td></tr><tr><td>Defibriniert </td><td>Hämostat für</td> Schafblut <td>DSB500</td><td>CDC anaerobe Medien für das Wachstum von P. bivia</td></tr><tr><td>Pinzetten</td><td>Fine Science Tools</td><td>&nbsp; 11008-13</td><td>Maus-/Gewebedissektion</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7528</td><td>NYCIII Medien für das Wachstum von G. vaginalis</td></tr><tr><td>Handhomogenisator</td><td>ISC Bio</td><td>3305500</td><td>Gewebehomogenisierung</td></tr><tr><td>Hemin</td><td>Sigma</td><td>51280</td><td>CDC anaerobe Medien für das Wachstum von P. bivia, Columbia Medien für das Wachstum von F. nucleatum</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Cellgro</td><td>25-060-Cl</td><td>NYCIII Medien für G. vaginalis Wachstum</td></tr><tr><td>Pferdeserum</td><td>Hämostat</td><td>SHS500</td><td>NYCIII Medium für G. vaginalis Wachstum</td></tr><tr><td>Wasserstoffgasgemisch (5% Wasserstoff, 10% CO2, 85% Stickstoff)</td><td>Matheson</td><td></td><td>Gas für die anaerobe</td></tr><tr><td>Kammer Isofluoran</td><td>VetOne</td><td>502017</td><td>Mausanästhesie bei Opferung</td></tr><tr><td>L-Cystein</td><td>Sigma</td><td>C1276</td><td>CDC anaerobes Medium für das Wachstum von P. bivia</td></tr><tr><td>L-Glutamat</td><td>Sigma</td><td>G1626</td><td>CDC anaerobe Medien für P. bivia Wachstum</td></tr><tr><td>Milli-Q Wasserreiniger</td><td>Millipore</td><td>IQ-7000</td><td>für die Herstellung von Medien und Homogenisierung</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>NYCIII Medien für G. vaginalis Wachstum</td></tr><tr><td>NaOH Tabletten</td><td>Sigma</td><td>S5881</td><td>CDC anaerobe Medien für P. bivia Wachstum</td></tr><tr><td>Stickstoffgas</td><td>&nbsp; Fluggas</td><td></td><td>&nbsp; Gas für anaerobe Kammer</td></tr><tr><td>p-200 Filterspitzen</td><td>ISC Bio</td><td>&nbsp; P-1237-200</td><td>Vaginalspülungen und bakterielle Inokulationen</td></tr>, <tr><td>Pankreasverdau von Casein</td><td>Sigma</td><td>70169</td><td>CDC anaerobe Medien für P. bivia-Wachstum</td></tr><tr><td>Proteose Pepton #3</td><td>Fisher</td><td>DF-122-17-4</td><td>NYCIII Medien für G. vaginalis-Wachstum</td></tr><tr><td>Schere</td><td>Fine Science Tools</td><td>&nbsp; 14084-08</td><td>Maus-/Gewebedissektion</td></tr><tr><td>Sesamöl</td><td>Fisher</td><td>&nbsp; ICN15662191</td> die <td>Östrogenisierung von Mäusen</td></tr><tr><td>Einschneidige chirurgische Rasierklingen aus Kohlenstoffstahl</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td>Gewebedissektion</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma</td><td>S3014</td><td>CDC anaerobe Medien für das Wachstum von P. bivia</td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>BioChrom</td><td>80-3000-45</td><td>Messung von Bakterien OD600</td></tr><tr><td>Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>11860038</td><td>zu Agarmedien hinzufügen, um selektive Platten</td></tr><tr><td>Tuberkulin Slip Tip 1ml Spritze</td><td>BD</td><td>309659</td><td>Östrogenisierung von Mäusen</td></tr><tr><td>Vitaim K3</td><td>Sigma</td><td>M5625</td><td>Columbia Medien für das Wachstum von F. nucleatum</td></tr><tr><td>Vitamin K1</td><td>Sigma</td><td>95271</td><td>CDC anaerobe Medien für das Wachstum von P. bivia</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Fisher</td><td>DF0127-17-9</td><td>NYCIII Medien für das Wachstum von G. vaginalis</td></tr></tbody></table>

modelle der murinen vaginalen besiedlung durch anaerob gezüchtete bakterien

Models of Murine Vaginal Colonization by Anaerobically Grown Bacteria

Die Vagina von Säugetieren kann von vielen bakteriellen Taxa besiedelt werden. Das menschliche vaginale Mikrobiom wird oft von Lactobacillus-Arten dominiert, aber jede vierte Frau erlebt eine bakterielle Vaginose, bei der ein niedriger Laktobazillenspiegel mit einem übermäßigen Wachstum verschiedener anaeroben Bakterien einhergeht. Dieser Zustand wurde mit vielen gesundheitlichen Komplikationen in Verbindung gebracht, einschließlich Risiken für die reproduktive und sexuelle Gesundheit. Während es immer mehr Beweise für die komplexe Natur mikrobieller Interaktionen in der menschlichen vaginalen Gesundheit gibt, sind die individuellen Rollen dieser verschiedenen anaeroben Bakterien nicht vollständig verstanden. Dies wird durch das Fehlen geeigneter Modelle zur Untersuchung anaerob gezüchteter Vaginalbakterien erschwert. Mausmodelle erlauben es uns, die Biologie und Virulenz dieser Organismen in vivo zu untersuchen. Andere Mausmodelle der vaginalen bakteriellen Impfung wurden bereits beschrieben. Hier beschreiben wir Methoden zur Inokulation von anaerob gezüchteten Bakterien und deren lebensfähige Erholung in konventionell gezüchteten C57Bl/6-Mäusen. Eine neue, weniger belastende Verfahrensmethode zur vaginalen Impfung und zum Waschen wird ebenfalls beschrieben. Die Impfung und lebensfähige Wiederherstellung von Gardnerella wird detailliert beschrieben, und Strategien für zusätzliche Anaerobier wie Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum werden diskutiert.

Eine schematische Darstellung eines Beispielexperiments zeigt einige der Möglichkeiten, wie man das beschriebene Protokoll ausführen kann (Abbildung 1).
Einige Tiere tragen endogene Mikroben in ihren vaginalen Mikrobiomen, die auf nicht-selektiven Medien wachsen. Die hier beschriebenen Methoden beruhen auf Streptomycin-resistenten Isolaten der untersuchten Bakterienstämme zusammen mit selektiven Medien, die Streptomycin enthalten, um gegen körpereigene Bakterien zu selektieren (Abbildung 2A, B). Es ist möglich, dass sich eine Streptomycin-Resistenz spontan entwickelt, so dass die Überprüfung von Mäusen vor der Infektion (Tag 0 Waschungen) helfen kann, festzustellen, ob dies ein Problem sein könnte.
Die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien aus vaginalen Waschungen erfolgt durch serielle Verdünnung und Beschichtung auf Agarmedien. Eine Standard-Petrischale kann bis zu 6 x 6 Arrays von 5-μL-Spots aufnehmen, was die Zählung von Bakterientitern aus sechs Replikationsspots über sechs Größenordnungen für jede Probe ermöglicht, wenn 10-fache serielle Verdünnungen verwendet werden (Abbildung 3A). Diese Methode kann verwendet werden, um Titer von Bakterien zu zählen, die von Gardnerella über Prevotella bis hin zu Fusobacterium reichen (Abbildung 3B-D).
Zusammen erlauben diese Methoden, Hypothesen zu testen und Interpretationen über die bakterielle Besiedlung / Infektion des weiblichen Fortpflanzungstraktes zu machen. Zum Beispiel zeigte ein Vergleich von Gardnerella-Titern in vaginalen Waschungen und vaginalen Gewebehomogenaten eine Übereinstimmung zwischen diesen Methoden (Abbildung 4A). Ebenso waren in einem vaginalen Koinokulationsmodell die Titer von Prevotella im Gebärmuttergewebe während der Gardnerella-Koinfektion signifikant höher (etwa 20-fach) als bei einer Prevotella-Monoinfektion (Abbildung 4B). Schließlich können Wildtyp- und mutierte Bakterienstämme in diesen Modellen verglichen werden, um die Rolle bestimmter Gene und ihrer Produkte bei der Besiedlung / Infektion des Fortpflanzungstrakts zu ermitteln. Zum Beispiel führte ein mutierter Stamm von Fusobacterium, der nicht in der Lage war, das Kohlenhydrat Sialinsäure zu transportieren und zu konsumieren, 3 Tage nach der Impfung zu einer geringeren Kolonisierung (Abbildung 4C).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig01.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung eines Beispielexperiments33. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig02.jpg"> Abbildung 2: Wachstum endogener muriner vaginaler Mikroben auf selektivem versus nicht-selektivem Agar. Vaginale Spülungen von fünf weiblichen C57Bl/6-Mäusen (1-5) wurden auf zwei verschiedene NYC III-Agarplatten gestreift und anaerob inkubiert. (A) Die linke Platte enthält keine Antibiotika und ermöglicht das Wachstum von endogenen anaeroben Bakterien aus dem murinen Vaginaltrakt. (B) Die Platte auf der rechten Seite enthält 1 mg/ml Streptomycin und selektiert gegen das Wachstum endogener Bakterien. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig03.jpg"> Abbildung 3: Rückgewinnung lebensfähiger G. vaginalis, P. bivia und F. nucleatum CFUs aus vaginalen Waschungen. (A) KFUs von G. vaginalis JCP8151B-SmR-Inokulum, repliziert als Verdünnungsreihe auf NYC III-Agar. (B-D) Wiederherstellung lebensfähiger (B) G. vaginalis24, (C) P. bivia25 und (D) F. nucleatum26 aus den vaginalen Spülungen von einfach infizierten Tieren. Für jede Grafik (B-D) werden die Daten aus zwei unabhängigen Experimenten kombiniert, mit 10-15 Mäusen pro Experiment24,25,26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64032/64032fig04v2.jpg"> Abbildung 4: Weitere Analyse der anaeroben bakteriellen Besiedlung in einem murinen vaginalen Impfmodell. (A) G. vaginalis-Titer in vaginalen Waschungen korrelieren mit G. vaginalis-Titern, die 24 h und 72 h nach der Inokulation aus vaginalen Gewebehomogenaten gewonnen wurden (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten, jeweils n = 10). Signifikanz bestimmt durch Spearmans Rangkorrelationstest)24. (B) Eine Koinfektion mit G. vaginalis führt 48 Stunden nach der Impfung zu erhöhten P. bivia-Titern im Horngewebe der Gebärmutter im Vergleich zu monoinfizierten Tieren mit P. bivia (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 6-10 Mäusen pro Gruppe). Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-U-Test, **p = 0,0017)25. (C) Die F. nucleatum-Mutante mit gestörtem Sialinsäuretransporter (Ω SiaT) hat 72 Stunden nach der Inokulation (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 10 Mäusen pro Gruppe) im Vergleich zum Wildtyp von F. nucleatum 72 Stunden nach der Inokulation (Kombination von zwei unabhängigen Experimenten mit jeweils 10 Mäusen pro Gruppe) verringerte Titer. Signifikanz bestimmt durch Mann-Whitney-U-Test, **p &lt; 0,01)26. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032fig04largev2.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzungsdossier 1: Beispiele für Methoden, die für verschiedene Vaginalbakterien verwendet werden, die unter anaeroben Bedingungen gezüchtet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64032/64032_SupplementalFile.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Das Protokoll stellt ein Mausmodell der vaginalen Besiedlung mit anaerob kultivierten menschlichen Vaginalbakterien vor. Wir konzentrieren uns auf Gardnerella vaginalis, während wir Vorschläge für Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum enthalten. Dieses Protokoll kann auch als Leitfaden für vaginale Impfungen und eine lebensfähige Wiederherstellung anderer anaerob gezüchteter Bakterien verwendet werden.

Modelle der murinen vaginalen Besiedlung durch anaerob gezüchtete Bakterien

The mammalian vagina can be colonized by many bacterial taxa. The human vaginal microbiome is often dominated by Lactobacillus species, but one-in-four ...

Diese Methode wird den Forschern helfen, die Biologie und Pathophysiologie von anaeroben Bakterien zu untersuchen, die im weiblichen Fortpflanzungstrakt leben und Infektionen verursachen. Frühere Modelle der murinen vaginalen Impfung konzentrierten sich auf Bakterien, die unter aeroben Bedingungen gezüchtet und sich erholt haben. Unsere Methode befasst sich mit der Impfung und Rückgewinnung von obligat anaeroben Bakterien, die zusätzliche Strategien zur Minimierung der Sauerstoffbelastung erfordern.Je nachdem, wie anspruchsvoll sie sind, können neue Bakterienstämme, die in diesem Modell verwendet werden, Änderungen an bestimmten Schritten erfordern. In Tabelle eins des Manuskripts haben wir Vorschläge für mögliche Änderungen gemacht. Geben Sie zunächst 200 Mikroliter einer 16 Stunden alten Bakterienkultur in eine 1,5-Milliliter-Küvette mit 800 Mikrolitern frischem Medium in einer anaeroben Kammer.Dann wurde die optische Dichte (OD) der verdünnten Kultur bei 600 Nanometern in einem Spektralphotometer gemessen, wobei eine separate Küvette mit nur Medium als Leerwert verwendet wurde. Um den tatsächlichen OD-Wert der Kultur zu erhalten, multiplizieren Sie den Spektralphotometerwert mit fünf, bestimmen Sie dann das für das Experiment erforderliche Inokulumvolumen und berechnen Sie das Volumen der Bakterienkultur, das benötigt wird, um die erforderliche Inokulumdichte zu erreichen. Als nächstes pipettieren Sie das erforderliche Volumen der Bakterienkultur in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen und zentrifugieren bei 16.000 mal G für ein bis drei Minuten.Nach dem Entfernen des Überstands wird das Pellet in anaerobem PBS resuspendiert, um das zuvor berechnete erforderliche Inokulumvolumen zu erreichen. Um die Anzahl der bakterienkoloniebildenden Einheiten im vorbereiteten Inokulum zu bestimmen, werden zunächst 10 Mikroliter der Bakteriensuspension verwendet, um mehrere serielle Verdünnungen in PBS vorzunehmen, und eine Mehrkanalpipette verwendet, um Platteninokulumverdünnungen auf Agarplatten zu erkennen. Bereiten Sie gleichzeitig die vaginalen Lavageschläuche in der anaeroben Kammer vor, indem Sie 70 Mikroliter steriles anaerobes PBS in 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pipettieren, die mit Mausnummern gekennzeichnet sind.Verschließen Sie die Röhrchen fest und nehmen Sie sie aus der Kammer. Um eine vaginale Spülung durchzuführen, legen Sie zuerst eine Maus auf einen Käfig, den sie mit ihren Vorderpfoten greifen kann. Fassen Sie dann vorsichtig den mittleren Teil des Schwanzes und heben Sie ihn an, so dass die Hinterviertel leicht erhöht sind und die Vaginalöffnung freiliegt.Nachdem Sie 50 Mikroliter PBS aus dem etikettierten Waschschlauch entnommen haben, führen Sie die Pipettenspitze vorsichtig zwei bis drei Millimeter in das Vaginallumen ein, um sie mit PBS zu waschen, indem Sie drei- bis viermal ein- und auspipettieren. Anschließend wird das Waschmaterial mit den restlichen 20 Mikrolitern ungenutztem PBS wieder in den ursprünglichen Waschschlauch überführt. Unmittelbar nach dieser vaginalen Spülung impfen Sie jede Maus, indem Sie 20 Mikroliter der Bakteriensuspension oder Vehikelkontrolle vaginal übertragen.Bei Co-Inco-Inokulationsexperimenten mit zwei verschiedenen Bakterienstämmen sollten Sie separat mit 10 Mikrolitern jeder Bakteriensuspension impfen, anstatt die Stämme vorher zu mischen. Um zu verhindern, dass sich das verabreichte Volumen sofort am vaginalen Introitus ansammelt, halten Sie den Hinterteil der Maus 10 bis 20 Sekunden lang hoch. Setzen Sie die beimpfte Maus in einen neuen Käfig oder mit bereits beimpften Käfigkameraden und wiederholen Sie den Vorgang mit den anderen Mäusen.Nachdem Sie alle Mäuse geimpft haben, erhalten Sie die koloniebildenden Einheiten nach dem Inokulum, indem Sie serielle Verdünnungen des Inokulums in der anaeroben Kammer plattieren. Um Mausorgane zu sammeln, bereiten Sie fünf Milliliter Organentnahmeröhrchen in der anaeroben Kammer vor, indem Sie jedem Röhrchen einen Milliliter steriles anaerobes PBS für Vaginas und Gebärmutterhals hinzufügen. Fügen Sie 750 Milliliter PBS zu den für Gebärmutterhörner markierten Röhrchen hinzu.Um die letzte Lavage beim Opfer zu sammeln, bereiten Sie einen weiteren Satz vaginaler Lavageschläuche vor, wie zuvor gezeigt. Bereiten Sie zum Spülen und Sterilisieren von Sezierinstrumenten auch ein 50-Milliliter-Becherglas mit entionisiertem Wasser und ein 50-Milliliter-Becherglas mit 70 bis 90% Ethanol vor. Unmittelbar vor oder nach dem Opfern der Mäuse führen Sie die letzte Spülung durch, wie zuvor gezeigt.Besprühen Sie nach der Tötung den Bauch und den Rücken einer Maus mit 70% Ethanol. Verwenden Sie dann eine mit Ethanol sterilisierte und getrocknete Schere, um die Bauchhöhle der Maus mit vertikalen Schnitten zu öffnen. Als nächstes verwenden Sie die Pinzette, um die Haut zurückzuziehen.Um den Fortpflanzungstrakt freizulegen, schieben Sie den Darm vorsichtig aus der Körperhöhle an die Seite des offenen Feldes und entfernen Sie die Blase von der Maus, um in den unteren Teil des Fortpflanzungstraktes zu gelangen. Danach schneiden Sie die Mitte des Schambeins mit einer Schere ab, ohne die Vagina zu schneiden. Verwenden Sie dann zwei Pinzetten, um jede Seite des Beckens zu greifen, und ziehen Sie das Becken seitlich auf, um den unteren Teil der darunter liegenden Vagina freizulegen.Fassen Sie den Gebärmutterhals vorsichtig mit einer Pinzette und ziehen Sie ihn hoch, um den Dickdarm freizulegen. Danach verwenden Sie eine kleine Schere, um die Vagina vom äußeren Bindegewebe zu befreien. Lösen Sie die Vagina vorsichtig aus dem Dickdarm, ohne den Darmtrakt zu punktieren.Wenn die Vagina vollständig aus dem Dickdarm befreit ist, verwenden Sie eine Schere, um die Vagina am Introitus zu flankieren, und schneiden Sie sie dann ab, um sie aus dem Mauskörper zu entfernen. Halten Sie den Gebärmutterhals sanft fest, ziehen Sie ihn nach oben, um die Gebärmutterhörner besser sichtbar zu machen, und schneiden Sie direkt unter den Eierstöcken auf der rechten und linken Seite, um die Gebärmutterhörner freizugeben. Als nächstes entfernen Sie den Fortpflanzungstrakt aus dem Mauskörper und legen Sie ihn in eine sterile Petrischale.Trennen Sie dann mit einer Rasierklinge die Gebärmutterhörner, den Gebärmutterhals und die Vagina. Legen Sie jedes Gewebe in das entsprechend gekennzeichnete Entnahmeröhrchen. Um die Organe zu homogenisieren, bereiten Sie einen tragbaren Homogenisator in einer Biosicherheitswerkbank vor.Bereiten Sie zunächst einen Satz von drei 50-Milliliter-Röhrchen mit entionisiertem Wasser, 70% Ethanol bzw. PBS vor, um die Homogenisatorschaufeln nach der Homogenisierung jedes Organs zu waschen. Um den Homogenisator zu reinigen, tauchen Sie die Klinge in den Wasserschlauch und schalten Sie die Maschine etwa drei Sekunden lang mit voller Geschwindigkeit ein. Schütteln Sie dann die Klinge auf einem Papiertuch, um überschüssiges Wasser zu entfernen.Spülen Sie die Klinge nacheinander in 70% Ethanol und PBS. Nach dem ersten Spülen senken Sie die Homogenisatorsonde auf den Boden eines Röhrchens mit Organen, um das darunter liegende Gewebe einzufangen. Schalten Sie dann den Homogenisator ein, um das Gewebe zu mahlen, und bewegen Sie die Sonde etwa fünfmal vorsichtig auf und ab, wobei Sie sie unter Wasser halten.Schalten Sie den Homogenisator aus und entfernen Sie ihn und stellen Sie visuell sicher, dass das Gewebe vollständig zerstört wird. Nach der Homogenisierung wird die Probe wieder in die anaerobe Kammer geleitet und eine serielle Verdünnung zur Gewinnung von KBE durchgeführt. Nach diesem Protokoll konnte die Rückgewinnung lebensfähiger Bakterien und die Zählung von koloniebildenden Einheiten aus den vaginalen Waschungen für die Bakterienstämme Gardnerella vaginalis, Prevotella bivia und Fusobacterium nucleatum erfolgreich durchgeführt werden.Darüber hinaus korrelierte die Anzahl der koloniebildenden Einheiten von Gardnerella vaginalis, die aus vaginalen Waschungen gewonnen wurden, mit denen, die aus den Vaginalgewebehomogenaten gewonnen wurden. Diese Methode zeigte auch, dass die Prevotella bivia-Titer und das Uterusgewebe der Maus während der Koinfektion mit Gardnerella vaginalis signifikant höher waren als die Prevotella-Monoinfektion. Darüber hinaus konnte diese Methode erfolgreich eingesetzt werden, um die vaginale Persistenz eines mutierten Fusobacterium nucleatum-Stammes mit der des Wildtyps 24 und 72 Stunden nach der Beimpfung zu vergleichen.Um die Immunantwort auf vaginale bakterielle Impfungen zu untersuchen, können Zytokin-Assays an den Gewebehomogenaten durchgeführt werden. Alternativ könnten Gewebe für die histologische Untersuchung aufbewahrt werden, um Entzündungszeichen zu beurteilen.

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Forschung

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