Name: Ein neuartiges Ex-vivo-Modell für Schafhaut mit hohem Durchsatz zum Testen neuer Antibiotika (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Erfahren Sie die Einrichtung eines ex-vivo-Schafhaut-Modells mit Staphylococcus aureus-Infektion zur Testung neuer Antibiotika. Diese Methode ermöglicht präklinische Wirksamkeitsstudien in einer physiologisch relevanten Wundumgebung.

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Die Autoren danken EPSRC (EP/R513313/1) für die Förderung. Die Autoren danken auch R.B. Elliot und Son Abattoir in Calow, Chesterfield, für die Bereitstellung von Lämmerköpfen und für ihr Entgegenkommen in den frühen Phasen des Projekts, Kasia Emery für ihre Unterstützung bei der Entwicklung dieses Protokolls und Fiona Wright von der Abteilung für Infektion, Immunität und Herz-Kreislauf-Erkrankungen an der Universität Sheffield für die Verarbeitung der histologischen Proben und ihre unglaubliche Hilfe während dieses Projekts.

Lämmerköpfe aus dem Schlachthof R.B. Elliott und Son wurden in diesem Projekt als Quelle für Hautproben verwendet. Alle Lämmer wurden für den Verzehr als Lebensmittel geschlachtet. Anstatt die Köpfe wegzuwerfen, wurden diese für die Forschung wiederverwendet. Eine ethische Genehmigung war nicht erforderlich, da das Gewebe aus Abfällen stammte, die von Schlachthöfen weggeworfen wurden.
1. Sterilisation
<ol><li>Desinfizieren Sie die Pinzette vor dem Sammeln der Köpfe, indem Sie eine saubere Pinzette nehmen und eine trockene Hitzesterilisation in einem Ofen bei 200 ° C für 1 h durchführen. Autoklavieren Sie alle Glaswaren bei 121 °C für 15 min vor Gebrauch.</li>
	<li>Führen Sie alle beschriebenen Arbeiten in einem Mikrobiologie-Schrank der Klasse 2 durch. Bereiten Sie alle Reagenzien gemäß den Anweisungen des Herstellers vor.</li>
</ol>2. Probenentnahme
<ol><li>Im Schlachthof wurden Swaledale-Lämmer durch Betäubung mit Strom oder einer Bolzenpistole geschlachtet und entblutet. Sammeln Sie Lammköpfe nicht später als 4 Stunden nach der Schlachtung.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Köpfe
<ol><li>Desinfizieren Sie den Stirnbereich des Lammes, indem Sie etwa 100 ml 200 ppm Chlordioxidlösung auf den Probenbereich gießen. Rasieren Sie den Stirnteil des Kopfes mit elektrischen Haarschneidern und waschen Sie den Bereich mit 200 ml 200 ppm Chlordioxidlösung.</li>
	<li>Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und blauer Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich 35 min lang mit einer Haarentfernungscreme. Kratzen Sie die Haarentfernungscreme vorsichtig mit einem Schabenwerkzeug ab und beurteilen Sie den Probenbereich. Wenn eine signifikante Menge an Haaren verbleibt, wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang.</li>
	<li>Verwenden Sie weitere 200 ml Chlordioxidlösung, um den Bereich zu spülen, und spülen Sie dann mit Ethanol ab und wischen Sie mit einer blauen Rolle.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einem sterilen 8-mm-Biopsiestempel 8 mm Hautproben aus dem vorbereiteten Bereich aus. Entfernen Sie die Proben mit einer sterilen Pinzette und einem 15-Klingen-Skalpell, um sicherzustellen, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.</li>
	<li>Die Proben werden in ein steriles 0,5-l-Glas gegeben, das mit steriler phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) gefüllt ist, und dann in sterile 50-ml-Röhrchen mit 50 ml 200 ppm Chlordioxidlösung überführt, zweimal umgedreht und 30 min sterilisieren lassen.</li>
	<li>Nehmen Sie die Proben aus der Chlordioxidlösung und waschen Sie sie, indem Sie sie in ein 50-ml-Röhrchen geben, das mit 40 ml sterilem PBS gefüllt ist. Nach dem Waschen legen Sie jede einzelne Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte.</li>
	<li>Fügen Sie 350 μL vorgewärmtes Medium hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten wird. Die Zusammensetzung der Medien ist wie folgt: MK-Medien (Medium 199 mit Hanks-Salzen, L-Glutamat und 1,75 mg / ml Natriumbicarbonat) und Hams F12 im Verhältnis 1: 1, mit Zusatz von FBS (10% v / v), EGF (10 ng / ml), Insulin (5 μg / ml), Penicillin-Streptomycin (100 U / ml) und Amphotericin B (2,5 μg / ml).</li>
	<li>Verschließen Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattendichtung und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5% CO2-Gewebeinkubator für bis zu 24 h.</li>
</ol>4. Pflege von Hautproben
<ol><li>Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 μL sterilem PBS ab. Fügen Sie jeder Probe antibiotikafreie Medien hinzu und inkubieren Sie bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Gewebeinkubator für 24 Stunden, um Restantibiotika in der Probe zu entfernen.</li>
	<li>Wenn sich nach 24 h Trübung oder Pilzinfektion in den antibiotikafreien Medien entwickelt, verwerfen Sie die Probe.</li>
</ol>5. Vorbereitung des Inokulums
<ol><li>Bereiten Sie eine 50-ml-Tube mit 10 ml steriler tryptischer Sojabrühe vor. Nehmen Sie eine frische Agarplatte von S. aureus und verwenden Sie einen Tupfer, um mehrere Kolonien in die Brühe zu übertragen. 18 h bei 37 °C bei 150 U/min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren bei 4.000 x g für 3 min. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml sterilem PBS. Wiederholen Sie dies zweimal, um eine ausreichende Reinigung der Zellen zu gewährleisten.</li>
	<li>Stellen Sie das Inokulum auf 0,6 OD600 in sterilem PBS ein. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung, indem Sie eine manuelle Keimzahl durchführen.</li>
</ol>6. Infektion von Hautproben
<ol><li>Bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 μL vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24-Well-Einsätze mit einer sterilen Pinzette hinzu.</li>
	<li>Entfernen Sie die Medien von den Hautproben, waschen Sie sie mit 500 μL sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche. Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Probe vorsichtig am Boden der Vertiefung zu halten.</li>
	<li>Verwenden Sie eine 4-mm-Stanzbiopsie, um eine zentrale Wundklappe herzustellen, die bis zu einer rauen Tiefe von 1-2 mm durchdringt. Verwenden Sie dann ein 15-Klingen-Skalpell und sterile gezahnte Allis-Gewebezangen, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen. Variabilität in den Wunddimensionen kann das Ergebnis der Infektion und die Endpunktkolonie bildenden Einheiten (CFU) beeinflussen.</li>
	<li>Sobald alle Proben verwundet sind, werden sie mit einer sterilen Pinzette in die 24-Well-Einsätze überführt. Pipettieren Sie 15 μL des bakteriellen Inokulums in das Wundbett. Anschließend 24 h bei 37 °C in einem befeuchteten 5%CO2-Gewebeinkubator inkubieren.</li>
	<li>Wenn längere Inkubationszeiten erforderlich sind, entfernen Sie die Medien und ersetzen Sie sie alle 24 Stunden durch frische Medien und inkubieren Sie unter den gleichen Bedingungen.</li>
</ol>7. Bestimmung der Keimbelastung
<ol><li>Entfernen Sie das Medium vom Boden der Vertiefungen. Mit einer sterilen Pinzette wird jede Probe in ein separates 50-ml-Röhrchen mit 1 ml sterilem PBS überführt.</li>
	<li>Verwenden Sie einen feinspitzen Homogenisator, um die Oberfläche der Probe zu homogenisieren. Achten Sie darauf, dass das Wundbett in direktem Kontakt mit der Spitze des Homogenisators steht.</li>
	<li>Homogenisieren Sie jede Probe für 35 s auf mittel/hoch. Der Homogenisator löst die Bakterien von der Oberfläche des Wundbettes, um eine Aufzählung der Bakterienbelastung zu ermöglichen.</li>
	<li>Sobald alle Proben verarbeitet sind, wirbeln Sie jede Probe der Reihe nach vor dem Pipettieren durch. Dadurch soll sichergestellt werden, dass das bakterielle Homogenat gemischt wird.</li>
	<li>20 μL vortexiertes Homogenat werden in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Platte pipettiert, die 180 μL steriles PBS enthält.</li>
	<li>Jedes Probenhomogenat wird nacheinander auf 1 x 10−7 verdünnt und 10 μL des verdünnten Homogenats auf eine tryptische Sojaagarplatte in dreifacher Ausfertigung pipettiert.</li>
	<li>Die Agarplatte 18 h bei 37 °C inkubieren. Zählen Sie dann die Anzahl der Kolonien, um die KBE für jede Probe zu bestimmen.</li>
</ol>

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<li>Olkowska, E., Gržinić, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skin+models+for+dermal+exposure+assessment+of+phthalates%5BTitle%5D)+AND+%22Chemosphere%22%5BJournal%5D)">Skin models for dermal exposure assessment of phthalates.</a> Chemosphere. 295, 133909(2022).</li>
<li>Couto, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+quantitative+proteomics+and+substrate-based+mass+spectrometry+imaging+of+xenobiotic+metabolizing+enzymes+in+ex+vivo+human+skin+and+a+human+living+skin+equivalent+model%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metabolism+and+Disposition%22%5BJournal%5D)">Label-free quantitative proteomics and substrate-based mass spectrometry imaging of xenobiotic metabolizing enzymes in ex vivo human skin and a human living skin equivalent model.</a> Drug Metabolism and Disposition. 49 (1), 39-52 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts zu verraten

Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein wichtiges, aber teures Unterfangen, das schätzungsweise rund 1 Milliarde US-Dollar kostet und etwa 15 Jahre in Anspruch nimmt. Über 90 % der antimikrobiellen Wirkstoffforschung und präklinischen Studien zur Wirksamkeit antimikrobieller Arzneimittel werden von akademischen Forschern und kleinen und mittleren Unternehmen mit typischerweise weniger als 50 Mitarbeitern durchgeführt22. Diese Teams sind finanziell sehr eingeschränkt, was das Versagen von L...

Hautinfektionen sind ein wichtiges globales Problem mit hohen wirtschaftlichen Kosten für Gesundheitsdienstleister auf der ganzen Welt. Die Entwicklung von Multidrug-Resistenzen und Biofilmbildung durch Krankheitserreger spielt eine Schlüsselrolle bei der Prävalenz nicht heilender Wunden 1,2,3,4. Infolgedessen sind Haut- und Weichteilinfektionen einer der häufigsten Gründe für einen längeren Krankenhausaufenthalt und eine anschließende Wiederaufnahme5. Verzögerungen bei der Wundheilung sind sowohl für den Patienten als auch für die Gesundheitsdienstleister kostspielig, wobei einige Schätzungen darauf hindeuten, dass in den USA jährlich rund 6,5 Millionen Patienten betroffen sind. In Großbritannien führen Hautinfektionen und damit verbundene Komplikationen jährlich zu etwa 75.000 Todesfällen 2,4,6.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist ein gewaltiger Wunderreger, der häufig aus Patientenwunden isoliertwird 2,7. Die Rate der Entstehung von Multidrug-Resistenzen stieg in den 2000er Jahren drastisch an. Während dieser Zeit waren etwa 60% der akuten bakteriellen Haut- und Hautstrukturinfektionen kulturpositiv für Methicillin-resistente S. aureus1. Die zunehmende Anzahl multiresistenter Stämme unter Staphylokokken und anderen Krankheitserregern in den letzten 2 Jahrzehnten weist auf einen dringenden Bedarf an der schnellen Entwicklung von Antibiotika mit neuen Wirkmechanismen hin, die Resistenzen überwinden können.
Seit Anfang der 2000er Jahre werden Antibiotika-Forschungsprogramme jedoch von längeren Entwicklungszeiten und niedrigen Erfolgsraten dominiert, wobei nur 17% der neuartigen Antibiotika in klinischen Studien in den USA dieMarktzulassung erhalten 8. Dies deutet auf eine Diskrepanz zwischen den Ergebnissen von In-vitro-Tests neuer Antibiotika und ihren klinischen Ergebnissen hin. Es kann argumentiert werden, dass diese Diskrepanz weitgehend auf Unterschiede in der bakteriellen Physiologie während Infektionen in vivo und während konventioneller mikrobiologischer Methoden bei der Prüfung der Wirksamkeit von Antibiotika in den präklinischen In-vitro-Stadien zurückzuführen ist. Daher sind neuartige Labormethoden erforderlich, die repräsentativer für die bakterielle Physiologie während der Infektion sind, um die Erfolgsraten in Antibiotika-Forschungsprogrammen zu verbessern.
Aktuelle Methoden zur Untersuchung von Hautinfektionen umfassen Studien an lebenden Tieren (z. B. Mäuse), Ex-vivo-Hautmodelle (z. B. Schweine) und 3D-Tissue-Engineering-Hautmodelle (z. B. Mensch)9,10,11,12. Studien an lebenden Tieren sind streng reguliert und haben einen relativ geringen Durchsatz. In Tiermodellen verursachen Verletzungen und Infektionen erhebliche Belastungen für die Tiere und werfen ethische Bedenken auf. Menschliche Hautmodelle, ex vivo oder Tissue-Engineering, erfordern eine ethische Genehmigung, die Einhaltung lokaler und globaler Gesetze (das Human Tissue Act, die Deklaration von Helsinki), und es gibt Schwierigkeiten beim Erwerb von Geweben, wobei einige Anfragen Jahre dauern, um13,14 zu erfüllen. Beide Modelltypen sind arbeitsintensiv und erfordern erhebliches Fachwissen, um den experimentellen Erfolg zu gewährleisten. Einige aktuelle Ex-vivo-Hautinfektionsmodelle erfordern vorgeimpfte Bandscheiben und Zusatzstoffe für das Wundbett, um eine Infektion zu ermöglichen. Obwohl diese Modelle unglaublich nützlich sind, gibt es Einschränkungen im Infektionsprozess, da Zusatzstoffe die Nutzung des Wundbettes als Nährstoffquelle einschränken10,15,16,17. Das in dieser Studie beschriebene Modell verwendet keine Zusatzstoffe für das Wundbett, was sicherstellt, dass die Pathologie der Infektion und die Anzahl der lebensfähigen Zellen das Ergebnis der direkten Nutzung des Wundbetts als einzige Nährstoffquelle sind.
Angesichts des Bedarfs an neuen Labormethoden wurde ein neuartiges Ex-vivo-Modell von Hautinfektionen mit hohem Durchsatz entwickelt, das zur Bewertung der Wirksamkeit neuer Antibiotika verwendet werden soll. Hautinfektionsstudien stehen vor vielen Herausforderungen - hohe Kosten, ethische Bedenken und Modelle, die kein vollständiges Bild zeigen20,21. Ex-vivo-Modelle und 3D-Explantatmodelle ermöglichen eine bessere Visualisierung des Krankheitsprozesses und der Auswirkungen, die Behandlungen von einem klinisch relevanteren Modell haben können. Hier wird der Aufbau eines neuartigen Schafhautmodells beschrieben, das einfach, reproduzierbar und klinisch relevant ist und einen hohen Durchsatz aufweist. Schafhaut wurde ausgewählt, da Schafe eines der großen Säugetiere sind, die üblicherweise verwendet werden, um Reaktionen auf Infektionen in vivo zu modellieren. Darüber hinaus sind sie in Schlachthöfen leicht erhältlich, um eine stetige Versorgung mit Haut für die Forschung zu gewährleisten, und ihre Kadaver werden nicht verbrüht, was eine gute Gewebequalität gewährleistet. Diese Studie verwendete S. aureus als exemplarischen Erreger; Das Modell funktioniert jedoch gut mit anderen Mikroorganismen.

<table><tbody><tr><td>24 Brunnen Begleitplatte</td><td>SLS&nbsp;</td><td></td><td></td>353504</tr><tr><td>4 mm Biopsie-Stanze</td><td>Williams Medical</td><td>D7484</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>10788561</tr><tr><td>8 mm Biopsie-Stanze</td><td>Williams Medical</td><td>D7488</td><td></td></tr><tr><td>Amphotericin B-Lösung, steril</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>Colour Pro Style Akku-Haarschneider</td><td>Wahl</td><td>9639-2117X</td><td>Haarschneider</td></tr><tr><td>Dual Oven Inkubator</td><td>SLS</td><td>OVe1020</td><td>Sterilisationsofen</td></tr><tr><td>Epidermaler Wachstumsfaktor&nbsp;</td><td>SLS</td><td>E5036-200UG</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Honeywell</td><td>458600-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>F12 HAM</td><td></td><td>Sigma N4888</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum&nbsp;</td><td>Labtech International</td><td>CA-115/500</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td>Fisher Scientific</td><td>15307805</td><td></td></tr><tr><td>Haarentfernungscreme</td><td>Veet</td><td>Nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Heracell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>15373212&nbsp;</td><td>Inkubator für Gewebekulturen</td></tr><tr><td>Heraeus Megafuge 16R</td><td>VWR</td><td>521-2242</td><td>Zentrifugen-Homogenisator</td></tr><tr><td>220, Handheld</td><td>Fisher Scientific</td><td>15575809</td><td></td></tr><tr><td>Homogenisator 220, Kunststoff-Mischkegel</td><td>Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>15585819</tr><tr><td>Einsetzen Individuelle 24-Well-Membran mit 0,4 μm</td><td>VWR</td><td>International 353095</td><td></td></tr><tr><td>Insulin, rekombinant Human</td><td>SLS</td><td>91077C-1G</td><td></td></tr><tr><td>Medium 199 (MK-Medien)</td><td>Sigma</td><td>M0393</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte, Zellkultur Costar 96 Well</td><td>Fisher</td><td>Scientific 10687551</td><td></td></tr><tr><td>Multitron</td><td>Infors</td><td>Nicht anwendbar</td><td>Inkubator für Bakterien</td></tr><tr><td>PBS Tabletten</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P4417-100TAB</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>SLS&nbsp;</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Plattendichtungen</td><td>Fisher Scientific</td><td>ESI-B-100</td><td></td></tr><tr><td>Safe 2020</td><td>Fisher Scientific</td><td>1284804</td><td>Klasse II Mikrobiologie Sicherheitswerkbank</td></tr><tr><td>Skalpellklingen Nummer 15</td><td>Fisher Scientific</td><td>O305</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell Swann Morton</td><td>Fisher Scientific</td><td>11849002</td><td></td></tr><tr><td>Natriumbicarbonat</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Gezahnte Allis-Gewebezange</td><td>Rocialle</td><td>RSPU500-322</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Soja-Agar</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>14432-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Tryptische Sojabrühe</td><td>Merck Life Science UK Limited</td><td>41298-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Vimoba Tabletten</td><td>Quip Labs</td><td>VMTAB75BX</td><td></td></tr></tbody></table>

ein neuartiges ex-vivo-modell für schafhaut mit hohem durchsatz zum testen neuer antibiotika

A Novel High-Throughput Ex Vivo Ovine Skin Wound Model for Testing Emerging Antibiotics

Die Entwicklung antimikrobieller Mittel ist ein teurer Prozess mit immer niedrigeren Erfolgsraten, was weitere Investitionen in die Erforschung antimikrobieller Wirkstoffe weniger attraktiv macht. Die Entdeckung antimikrobieller Wirkstoffe und die anschließende Kommerzialisierung können lukrativer gestaltet werden, wenn ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Ansatz innerhalb der Lead-Optimierungsphasen implementiert werden kann, in denen Forscher eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln haben. In diesem Artikel wird der Aufbau eines ex vivo mit Staphylococcus aureus infizierten Modells für verwundete Schafe beschrieben, das einfach, kostengünstig, durchsatzfähig und reproduzierbar ist. Die bakterielle Physiologie im Modell ahmt nach, dass während der Infektion die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Erregers abhängt, das Gewebe zu schädigen. Die Etablierung einer Wundinfektion wird durch eine Erhöhung der lebensfähigen Bakterienzahlen im Vergleich zum Inokulum verifiziert. Dieses Modell kann als Plattform verwendet werden, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel in der Phase der Leitoptimierung zu testen. Es kann behauptet werden, dass die Verfügbarkeit dieses Modells Forschern, die antimikrobielle Mittel entwickeln, ein Fail-Fast-and-Fail-Cheap-Modell bieten wird, das dazu beitragen wird, die Erfolgsraten in nachfolgenden Tierversuchen zu erhöhen. Das Modell wird auch die Reduzierung und Verfeinerung der Verwendung von Tieren für die Forschung erleichtern und letztendlich eine schnellere und kostengünstigere Übertragung neuartiger antimikrobieller Mittel für Haut- und Weichteilinfektionen in die Klinik ermöglichen.

Die Identifizierung eines Weges zur Sterilisation der Haut vor der Einrichtung des Wundinfektionsmodells war eine Herausforderung. Die Herausforderung bestand darin, die Haut zu sterilisieren, ohne die verschiedenen Hautschichten zu beschädigen, was dann unbeabsichtigte Folgen für den Ausgang einer Infektion haben kann. Um ein geeignetes Sterilisationsregime zu identifizieren, wurden verschiedene Behandlungen über unterschiedliche Zeiträume ausprobiert, wie in Tabelle 1 dargestellt. Die Kontamination wur...

Das Protokoll beschreibt eine Schritt-für-Schritt-Methode zum Aufbau eines Ex-vivo-Modells für verwundete Haut von Schafen, die mit Staphylococcus aureus infiziert sind. Dieses Hochdurchsatzmodell simuliert Infektionen in vivo im Vergleich zu herkömmlichen mikrobiologischen Techniken besser und bietet Forschern eine physiologisch relevante Plattform, um die Wirksamkeit neuer antimikrobieller Mittel zu testen.

Ein neuartiges Ex-vivo-Modell für Schafhaut mit hohem Durchsatz zum Testen neuer Antibiotika

The development of antimicrobials is an expensive process with increasingly low success rates, which makes further investment in antimicrobial discovery ...

Dieses Modell wird es den Forschern in den kritischen präklinischen Stadien ermöglichen, die antimikrobielle Wirksamkeit neuartiger Formulierungen genauer zu bestimmen, und gibt den Forschern eine größere Kontrolle über das Design und die Formulierung von Arzneimitteln. Dieses Modell ermöglicht schnell reproduzierbare Ergebnisse in einer repräsentativen Wundumgebung. Es reduziert den Bedarf an speziell gezüchteten Tieren und erleichtert die schnellere Translation von topischen antimikrobiellen Mitteln für Wundinfektionen in die Klinik.Die größten Herausforderungen sind Verunreinigung und Geschicklichkeit. Eine strenge aseptische Technik und Geduld bei der Gewebeaufbereitung sind unerlässlich; für den Erfolg dieser Methode ist eine präzise und zielgerichtete Lappenentfernung erforderlich. Beginnen Sie mit der Desinfektion der Pinzetten, indem Sie sie eine Stunde lang einer trockenen Hitzesterilisation bei 200 Grad Celsius aussetzen.Autoklavieren Sie alle Glaswaren vor Gebrauch 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius. Desinfizieren Sie den Stirnteil der Lampe, indem Sie ca. 100 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung auf die Probenfläche gießen. Rasieren Sie den Stirnteil mit elektrischen Haarschneidern, gefolgt von einer Wäsche mit 200 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung.Wischen Sie den Bereich mit Ethanol und einer blauen Rolle ab und bedecken Sie den Probenbereich mit einer Haarentfernungscreme. Nach 35 Minuten die Haarentfernungscreme mit einem Schabenwerkzeug vorsichtig abkratzen und den Probenbereich beurteilen. Wiederholen Sie den Haarentfernungsvorgang, wenn eine signifikante Menge an Haaren übrig bleibt.Spülen Sie den sauberen Probenbereich mit 200 Milliliter Chlordioxidlösung, gefolgt von Ethanol und einer blauen Rolle. Verwenden Sie einen sterilen Acht-Millimeter-Biopsiestempel, um eine acht Millimeter große Hautprobe aus dem vorbereiteten Bereich herauszuschneiden. Entfernen Sie dann die Probe mit einer sterilen Pinzette und dem Klingenskalpell Nr. 15, um sicherzustellen, dass das gesamte Hautfett entfernt wird.Legen Sie die Proben in ein steriles 0,5-Liter-Glas, das mit sterilem PBS gefüllt ist. Dann werden sie in sterile 50-Milliliter-Röhrchen überführt, die mit 50 Milliliter 200 PPM Chlordioxidlösung gefüllt sind. Drehen Sie das Röhrchen zweimal um und lassen Sie es 30 Minuten sterilisieren.Die Proben werden in ein 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das mit 40 Milliliter sterilem PBS gefüllt ist. Nach dem PBS-Waschen legen Sie jede Hautprobe in eine separate Vertiefung einer 24-Well-Platte. Fügen Sie 350 Mikroliter des vorgewärmten Mediums in eine Vertiefung hinzu, während die Probe an der Luft-Flüssigkeits-Grenzfläche gehalten wird.Versiegeln Sie die 24-Well-Platten mit einer gasdurchlässigen Plattendichtung, bevor Sie die Platte zur Inkubation in einen befeuchteten Gewebeinkubator bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius für 24 Stunden legen. Entfernen Sie nach der Inkubation das Kulturmedium und spülen Sie die Proben in 500 Mikrolitern sterilem PBS aus. Entfernen Sie die restlichen Antibiotika aus der Probe, indem Sie sie 24 Stunden lang mit antibiotikafreien Medien bei 5% Kohlendioxid und 37 Grad Celsius behandeln.Wenn sich Trübung oder Pilzinfektion im antibiotikafreien Medium entwickelt, verwerfen Sie die Probe. Als nächstes bereiten Sie ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 10 Milliliter steriler Tryptose-Sojabrühe vor. Dann mehrere Staphylococcus aureus-Kolonien von einer frischen Agarplatte S.aureus in die Brühe geben und das Röhrchen bei 37 Grad Celsius und 150 U/min für 18 Stunden inkubieren.Nach dem Zentrifugieren der Röhrchen bei 4.000 G für drei Minuten den Überstand entfernen und das Zellpellet in 10 Milliliter sterilem PBS resuspendieren. Wiederholen Sie die PBS-Wäsche zweimal, bevor Sie das Inokulum mit sterilem PBS auf 0,6 optische Dichte bei 600 Nanometerwellenlängen einstellen. Bestätigen Sie die Inokulumbelastung durch eine manuelle realisierbare Keimzahl.Um die Hautprobe zu infizieren, bereiten Sie eine frische 24-Well-Platte mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem antibiotikafreiem Medium vor und fügen Sie die 24 Well-Einsätze mit sterilen Pinzetten hinzu. Entfernen Sie die Medien von den Hautproben. Waschen Sie sie mit 500 Mikrolitern sterilem PBS und entfernen Sie die Wäsche.Verwenden Sie eine sterile Pinzette, um die Probe vorsichtig am Boden der Vertiefung zu halten. Verwenden Sie eine Vier-Millimeter-Stanzbiopsie, um die Hautprobe bis zu einer rauen Tiefe von ein bis zwei Millimetern zu durchdringen und einen zentralen Wundlappen zu machen. Verwenden Sie dann ein Klingenskalpell Nummer 15 und steril gezahnte Allis-Gewebezangen, um die oberste Schicht des Wundlappens zu entfernen.Sobald alle Proben verwundet sind, werden sie mit einer sterilen Pinzette in die 24 Brunneneinsätze überführt. Pipettieren Sie 15 Mikroliter des bakteriellen Inokulums in das Wundbett, bevor sie 24 Stunden bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Gewebeinkubator inkubiert werden. Für längere Inkubationszeiten entfernen Sie das Medium, ersetzen Sie es alle 24 Stunden durch frisches Medium und inkubieren Sie die Platten unter den gleichen Bedingungen.Um die Bakterienbelastung zu bestimmen, entfernen Sie das Medium vom Boden der Vertiefungen. Und mit sterilen Pinzetten wird jede Probe in ein separates 50-Milliliter-Röhrchen überführt, das mit einem Milliliter sterilem PBS gefüllt ist. Lösen Sie dann die Bakterien von der Oberfläche des Wundbettes, indem Sie die Probenoberfläche mit einem feinspitzen Homogenisator homogenisieren.Stellen Sie sicher, dass das Wundbett in direktem Kontakt mit der Spitze des Homogenisators steht. Sobald alle Proben verarbeitet sind, wird jede Probe durchgewirbelt, bevor 20 Mikroliter Homogenat in die entsprechende Vertiefung einer 96-Well-Platte mit 180 Mikrolitern sterilem PBS überführt werden. Jedes Probenhomogenat wird nacheinander auf 1 mal 10 bis negativ 7 verdünnt und 10 Mikroliter des verdünnten Homogenats auf eine Tryptose-Soja-Agar-Platte in dreifacher Ausfertigung pipettiert.Inkubieren Sie die Tryptose-Soja-Agar-Platte bei 37 Grad Celsius und zählen Sie nach 18 Stunden die Anzahl der Kolonien, um die koloniebildenden Einheiten oder KBE für jede Probe zu bestimmen. Ein geeignetes Hautsterilisationsregime wurde mit verschiedenen Behandlungen für unterschiedliche Zeiträume identifiziert. Die Gewebeintegrität wurde histologisch überwacht, gefolgt von einer Färbung mit Hämatoxylin und Eosin unmittelbar nach der Behandlung.Eine 30-minütige Behandlung mit Chlordioxid war die effektivste Behandlung, bei der das Hautgewebe reproduzierbar sterilisiert und gleichzeitig die Integrität des Gewebes erhalten bleibt. Ein weißer Film im Wundbett war 48 Stunden nach der Infektion auf dem Gewebe zu sehen. Obwohl das Kratzermodell nach 24 Stunden eine höhere durchschnittliche Anzahl von CFUs aufwies, führte die Klappenentfernungsverwundungstechnik zu konsistenteren Ergebnissen.Nach 48 Stunden wurden im Vergleich zum Inokulum etwa 100-mal mehr bakterielle KBE aus dem verwundeten Gewebe gewonnen, was auf eine erfolgreiche Infektion hindeutet. Gram-gefärbte histologische Schnitte des infizierten Gewebes zeigten das Vorhandensein von S.aureus-Zellen im Wundbett an, die in den Abschnitten des nicht infizierten Gewebes fehlten. Nach diesem Verfahren kann man Immunhistochemie durchführen, um die Gewebereaktion zu untersuchen, modifizierte Grammfärbung, um die bakterielle Lokalisation zu visualisieren, und lebensfähige Plattenzahlen nach antimikrobieller Exposition, um die antimikrobielle Wirksamkeit zu testen.Für die Forscher, die neuartige antimikrobielle Mittel entwickeln, wird dieses Modell eine bessere Kontrolle der Bleioptimierung ermöglichen, die Abhängigkeit von teuren und streng regulierten Tierversuchen verringern und die schnelle Übertragung antimikrobieller Mittel in die Klinik ermöglichen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: de Vries, C. R., et.al. Ein verzögertes Impfungsmodell der chronischen Wundinfektion von Pseudomonas aeruginosa . J. Vis. Exp. (2020)Dieses Video zeigt die verzögerte Impfung von leuchtender Pseudomonas aeruginosa in eine Maus, die zwei vollwertige Dorsalhautwunden trägt, die von einem transparenten Filmverband abgedeckt sind. Dies erleichtert die Bildung von Biofilmen und die Entstehung chronischer Infektionen. Regelmäßige Biolumineszenzüberwachung ermöglicht die Quantifizierung der...

Entwicklung eines Mausmodells der chronischen Pseudomonas aeruginosa-Hautwundinfektion 

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Einrichtung eines ex vivo-Modells für bakterielle Keratitis unter Verwendung eines Hornhautknopfes, der aus dem Schweineauge präpariert wurde. Geimpfte Bakterien durchlaufen die Einschnitte in das Hornhautepithel, um in das darunter liegende Stroma einzudringen und eine Infektion im Hornhautgewebe zu etablieren, die die In-vivo-Infektion nachahmt.

Schweine-Ex-vivo-Hornhautmodell der bakteriellen Keratitis: Eine Technik zur Etablierung einer bakteriellen Infektion in Hornhautepithelzellen

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Generierung eines Mausmodells für Hautwundinfektionen. Bei der Infektion von Mäusen – die so verändert wurden, dass sie ein fluoreszierendes Protein in Neutrophilen exprimieren – mit einem genetisch veränderten biolumineszierenden Staphylococcus aureus – einem pathogenen Bakterium. Die bakterielle Belastung an der Infektionsstelle und die Rekrutierungsdynamik von Neutrophilen können mit Hilfe von Ganztierbildgebung untersucht werden.

Ein Maus-Modell für Hautwundeninfektionen zur Untersuchung der Immunantwort gegen einen bakteriellen Krankheitserreger

Das Video zeigt die Generierung eines ex vivo Schafhautmodells, das mit Staphylococcus aureus infiziert ist. Dabei wird die Stirnhautbiopsie eines Lammes mit Antibiotika behandelt, ein Wundbett angelegt, auf einer durchlässigen Membran in einer Multiwell-Platte mit antibiotikafreiem Medium positioniert und eine bakterielle Infektion in der Hautwunde etabliert.

Generierung eines ex vivo Modells für verletzte Haut von Schafen, die mit einem bakteriellen Krankheitserreger infiziert sind

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Ein Protokoll für eine Ex Vivo Hornhaut Orgel Kulturmodells nützlich für Wundheilung Studien beschrieben wird. Dieses Modellsystem kann verwendet werden, um die Auswirkungen von Agenten, regenerative Heilung zu fördern oder Medikamententoxizität in einer organisierten mehrzelligen 3D-Umgebung.

Ex Vivo Wundheilung Hornhaut Orgel Kulturmodells für Studien

Hier werden zwei murine Wundheilungsmodelle beschrieben, eines zur Beurteilung der zellulären und zytokinen Wundheilungsreaktionen und das andere zur Quantifizierung der Rate des Wundverschlusses. Diese Methoden können mit komplexen Krankheitsmodellen wie Diabetes verwendet werden, um Mechanismen verschiedener Aspekte der schlechten Wundheilung zu bestimmen.

Bewertung der akuten Wundheilung mit den dorsalen subkutanen Polyvinylalkoholschwammimplantation und Exzisional Tail Skin Wound Models.

Dieser Artikel beschreibt ein Schritt-für-Schritt-Protokoll zur Einrichtung eines Ex-vivo-Schweinemodells der bakteriellen Keratitis. Pseudomonas aeruginosa wird als prototypischer Organismus verwendet. Dieses innovative Modell imitiert in vivo-Infektionen, da die bakterielle Proliferation von der Fähigkeit des Bakteriums abhängt, Hornhautgewebe zu schädigen.

Etablierung eines Porcine Ex Vivo Cornea Modells zur Untersuchung von medikamentösen Behandlungen gegen bakterielle Keratitis

Hier demonstrieren wir eine optimierte Technik zur Beurteilung der Wundreparatur mit ex vivo menschlicher Haut in Kombination mit einem Whole-Mount-Färbeansatz. Diese Methodik bietet eine präklinische Plattform für die Bewertung potenzieller Wundtherapien.

Humanes Ex-vivo-Wundmodell und Whole-Mount-Färbeansatz zur genauen Bewertung der Hautreparatur

Chronische Wunden, die gegen Antibiotika resistent sind, stellen eine große Bedrohung für das Gesundheitssystem dar. Biofilminfektionen sind hartnäckig und feindlich und können zu einem mangelhaften funktionellen Wundverschluss führen. Wir berichten über ein klinisch relevantes Schweinemodell von Biofilm-infizierten chronischen Wunden voller Dicke. Dieses Modell eignet sich sowohl für mechanistische Studien als auch für das Testen von Interventionen.

Schweinemodell für Biofilminfektion und unsichtbare Wunden

Ein 405-nm-Blaulicht-LED-Gerät zeigt eine antimikrobielle Wirksamkeit gegen eine Vielzahl von Wundkrankheitserregern, wenn es an einem kollagenbasierten synthetischen Hautmodell untersucht wird. Dieser vereinfachte In-vitro-Ansatz bietet eine reproduzierbare und ethisch praktikable Alternative für die Frühphasenbewertung lichtbasierter antimikrobieller Therapien.

Untersuchung eines Blaulicht-LED-Geräts zur Unterdrückung von Wundkrankheitserregern mittels eines kollagenbasierten synthetischen Hautmodells

Erfahren Sie die Einrichtung eines ex-vivo-Schafhaut-Modells mit Staphylococcus aureus-Infektion zur Testung neuer Antibiotika. Diese Methode ermöglicht präklinische Wirksamkeitsstudien in einer physiologisch relevanten Wundumgebung.

Ein neuartiges Ex-vivo-Modell für Schafhaut mit hohem Durchsatz zum Testen neuer Antibiotika

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