Name: Isolierung von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen aus Rattenknochen mittels sekundärer Adhärenzmethode (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-13T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 19 s
Description: Lernen Sie die sekundäre Adhärenzmethode zur Isolierung von Knochenmark-Monozyten-Makrophagen aus Ratten. Diese Technik ermöglicht die effiziente Differenzierung zu Osteoklasten für Osteoporose-Forschung.

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Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation der Provinz Zhejiang (Förderkennzeichen) unterstützt. LY19H060001) und das Zhejiang Traditional Chinese Medicine Science and Technology Plan Project (Nr. 2022ZB093).

Alle Experimente in dieser Studie wurden in Übereinstimmung mit den Tierversuchsrichtlinien des Zhejiang Chinese Medical University Laboratory Animal Research Center (Zulassungsnummer: IACUC-20181029-11) durchgeführt.
1. Zellextraktion
<ol><li>Legen Sie die Sprague-Dawley-Ratten (SD-Ratten, 1-10 Tage alt, männlich oder weiblich) mit einer ausgewogenen Rate von 30% -70% Behältervolumen / Minute in die mit CO2 gefüllten Euthanasiekäfige. Nachdem die Ratten das Bewusstsein verloren haben (20-60 min), euthanasieren Sie die Ratte durch Zervixdislokation, um einen schmerzlosen Tod zu gewährleisten.</li>
	<li>Tauchen Sie die Ratten 10 Minuten lang zur Desinfektion in 75% Alkohol.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig alle Gliedmaßen der Ratte mit Schere und Pinzette, aspirieren Sie mit PBS mit einer Pipette und spülen Sie das Blut, das an den Gliedmaßen haftet.</li>
	<li>5 ml Penicillin/Streptomycin-Lösung in 500 ml DMEM geben und gut mischen. Nehmen Sie ein steriles 50-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 5 ml FBS und 45 ml DMEM-Medium hinzu und mischen Sie gründlich, um ein 10% iges FBS-DMEM mit 1% Penicillin / Streptomycin-Lösung zu erhalten. Fügen Sie 2 ml des oben genannten Kulturmediums in ein 5-ml-Röhrchen hinzu.</li>
	<li>Übertragen Sie die Gliedmaßenknochen in die 5-ml-Röhre. Verwenden Sie eine Schere, um die Gliedmaßenknochen im Schlauch in kleine Stücke (1-3 mm) zu schneiden und das Homogenat zu mischen, um die Knochenmarkzellen wieder in das Kulturmedium zu suspendieren. Stehen Sie 5 Minuten, bis sich die Gewebefragmente am Boden der Röhre abgesetzt haben.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml 10% FBS DMEM in eine 100-mm-Kulturschale hinzu und übertragen Sie dann den Überstand in die Kulturschale. Wenn Sie den Überstand absaugen, vermeiden Sie es, die Gewebeablagerungen in die Kulturschale zu übertragen.</li>
	<li>Inkubieren bei 37 °C und 5%CO2 für ca. 24 h. Nach dieser Inkubationszeit haftet die Mehrheit der mesenchymalen Stammzellen an der Kulturschalenwand und wächst langsam, während die meisten BMMs noch im Kulturmedium suspendiert sind.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspension in der 100-mm-Kulturschale in einen neuen 25-cm-2-Kolben und kultivieren Sie die Zellen bei 37 °C und 5% CO2 für weitere 24 h. BMMs haften bei24-48 h Kultur an der Kolbenwand. Entfernen Sie das alte Medium vorsichtig und ersetzen Sie es durch frisches Medium, nachdem BMMs an der Kolbenwand haften.</li>
	<li>Subkultur, wenn die Zellen im Kolben 80% -90% Konfluenz erreichten. HINWEIS: Alle Zellen wurden bei 37 °C und 5% CO2 kultiviert. Während der Kultur wurde die Zellmorphologie allmählich vereinheitlicht. Die Zellen waren groß, unregelmäßig geformt, radial wachsend und in Form einer Bandscheibe am Kolben befestigt, wo multiple Kerne beobachtet werden konnten.</li>
</ol>2. FACS-Färbung der Zelle
<ol><li>Trypsin mit 1-2 ml kommerziellem Trypsin bei 37 °C und 5% CO 2 für 5 min verdauen und sekundäre adhärente Zellen zählen, um eine endgültige Zellzahl von 100.000/ Probe zu gewährleisten (Zellen zählen mit Neubauer Hämozytometer).</li>
	<li>Teilen Sie die Zellen in drei Gruppen ein (500 μL PBS enthalten 100.000 Zellen): (1) die leere Kontrollgruppe, die ungefärbte Zellen enthält; (2) die Isotyp-Kontrollgruppe; und (3) die experimentelle Gruppe (CD11b/c-Färbung).</li>
	<li>Inkubation primärer Antikörper (kein Antikörper für die Blindkontrollgruppe; Anti-CD11-Isotypkontrolle für die Isotyp-Kontrollgruppe, 0,6 μL Antikörper/Probe, 1 μg/Probe; Anti-CD11b/c für die Versuchsgruppe, 1 μL Antikörper/Probe, 1 μg/Probe) auf Eis für 30 min.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 300-350 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 μL PBS. Wiederholen Sie den obigen Vorgang einmal, um sicherzustellen, dass die ungebundenen primären Antikörper weggespült werden.</li>
	<li>Den entsprechenden Sekundärantikörper (kein Antikörper für die Blankkontrollgruppe; Ziegen-Antikaninchen-IgG für die Isotypkontrolle und die Versuchsgruppen, 0,25 μL Antikörper/Probe, 1:2.000) auf Eis im Dunkeln für 30 min inkubieren.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 300-350 x g für 5 min, entsorgen Sie den Überstand und suspendieren Sie die Zellen mit 500 μL PBS. Wiederholen Sie den obigen Vorgang einmal, um sicherzustellen, dass die ungebundenen zweiten Antikörper weggespült werden.</li>
	<li>Detektieren Sie die CD11b/c-positiven Zellen mittels Durchflusszytometrie (10.000 Zellen/Probe) und analysieren Sie die Daten per Software (z.B. FlowJo 7.5). HINWEIS: Um den endgültigen Prozentsatz der CD11b / c + -Zellen zu erhalten, wurde die folgende Formel verwendet: Prozentsatz der CD11b / c + -Zellen in der experimentellen Gruppe - der Prozentsatz der CD11 + -Zellen in der Isotyp-Kontrollgruppe.</li>
</ol>3. Wright-Giemsa-Färbung
<ol><li>Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm 2 Zellkletterblätter (1 × 106 Zellen/Well) gelangt sind, und kultivieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Kulturmedium und waschen Sie es dreimal mit PBS.</li>
	<li>Wright-Giemsa-Farbstofflösung (0,5 ml-0,8 ml) für 1 min in das Zellkletterblatt geben.</li>
	<li>Mischen Sie den Farbstoff mit destilliertem Wasser (0,5 ml-0,8 ml) mit einem Wattestäbchen und stehen Sie für 10 min.</li>
	<li>Waschen Sie die Farbstofflösung mit destilliertem Wasser und trocknen Sie sie dann für 1-3 min. Beobachten Sie unter einem Mikroskop.</li>
</ol>4. TRAP-Färbung
<ol><li>Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm 2 Zellkletterblätter (1 × 106 Zellen/Well) gelangt sind, und kultivieren Sie bei 37 °C und 5% CO2 für 24 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie das alte Medium durch das 10%ige FBS-DMEM- oder Osteoklasten-Induktionsmedium, ergänzt durch einen 50 ng/ml-Rezeptoraktivator des Kernfaktor-κB-Liganden (RANKL) und 30 ng/ml Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktors (M-CSF) und eine Kultur bei 37 °C und 5% CO2 für weitere 7 Tage.</li>
	<li>Färben Sie die Zellen mit dem TRAP-Färbeset nach Herstellerprotokoll und beobachten Sie sie unter dem Mikroskop. HINWEIS: TRAP-positive Zellen wurden als Osteoklasten definiert, die unter einem Lichtmikroskop violett waren. Die Anzahl der TRAP-positiven Zellen wurde mit der ImageJ-Software gemessen.</li>
</ol>5. Westlicher Schandfleck
<ol><li>Samen Sie die adhärenten Sekundärzellen, die dreimal auf 35 mm2 Zellkletterblättern (1 × 106 Zellen/Well) durchgangen wurden, und kultivieren Sie für 24 h.</li>
	<li>Ersetzen Sie das alte Medium durch frisches 10% FBS DMEM- oder Osteoklasteninduktionsmedium (50 ng/ml RANKL und 30 ng/ml M-CSF) und Kultur für weitere 7 Tage bei 37 °C und 5% CO2.</li>
	<li>Extrahieren Sie die gesamten zellulären Proteine mit RIPA-Puffer, trennen Sie sie durch 10% SDS-PAGE und übertragen Sie sie auf Polyvinylidenfluorid-Membranen18,19.</li>
	<li>Mit 5% Magermilchpulver (25 ml) für 2 h blocken und dreimal waschen, jeweils 10 min, mit TBS-Tween 20 (TBST).</li>
	<li>Inkubieren Sie primäre Antikörper bei 4 °C über Nacht (Anti-β-Actin, Anti-TRAP und Anti-Cathepsin K; alle primären Antikörper wurden um 1:1.000, 10 ml verdünnte Antikörper/Bande) verdünnt und dreimal mit TBST gewaschen.</li>
	<li>Inkubieren Sie den sekundären Antikörper (Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG, 1:2.000 Verdünnung, 10 ml verdünnter Antikörper/Band) bei Raumtemperatur für 2 h und waschen Sie ihn dreimal mit TBST. Visualisieren Sie die Proteinbänder mit einer sich entwickelnden Lösung. HINWEIS: Die Expressionsniveaus der oben genannten Proteine wurden auf β-Aktin normalisiert.</li>
</ol>

<ol><li>Jakubzick, C. V., Randolph, G. J., Henson, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocyte+differentiation+and+antigen-presenting+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Immunology%22%5BJournal%5D)">Monocyte differentiation and antigen-presenting functions.</a> Nature Reviews. Immunology. 17 (6), 349-362 (2017).</li>
<li>Locati, M., Curtale, G., Mantovani, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity%2C+mechanisms%2C+and+significance+of+macrophage+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Diversity, mechanisms, and significance of macrophage plasticity.</a> Annual Review of Pathology. 15 (1), 123-147 (2020).</li>
<li>Boyle, W. J., Simonet, W. S., Lacey, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+differentiation+and+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Osteoclast differentiation and activation.</a> Nature. 423 (6937), 337-342 (2003).</li>
<li>Ono, T., Nakashima, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+osteoclast+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Recent advances in osteoclast biology.</a> Histochemistry and Cell Biology. 149 (4), 325-341 (2018).</li>
<li>Zhou, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wnt%2F%C3%9F-catenin-mediated+p53+suppression+is+indispensable+for+osteogenesis+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Disease%22%5BJournal%5D)">Wnt/ß-catenin-mediated p53 suppression is indispensable for osteogenesis of mesenchymal progenitor cells.</a> Cell Death & Disease. 12 (6), 521-534 (2021).</li>
<li>Yu, Q., Zhao, B., He, Q., Zhang, Y., Peng, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((microRNA-206+is+required+for+osteoarthritis+development+through+its+effect+on+apoptosis+and+autophagy+of+articular+chondrocytes+via+modulating+the+phosphoinositide+3-kinase%2Fprotein+kinase+B-mTOR+pathway+by+targeting+insulin-like+growth+factor-1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">microRNA-206 is required for osteoarthritis development through its effect on apoptosis and autophagy of articular chondrocytes via modulating the phosphoinositide 3-kinase/protein kinase B-mTOR pathway by targeting insulin-like growth factor-1.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 120 (4), 5287-5303 (2019).</li>
<li>Li, Z., MacDougald, O. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preclinical+models+for+investigating+how+bone+marrow+adipocytes+influence+bone+and+hematopoietic+cellularity%5BTitle%5D)+AND+%22Best+Practice+%26+Research.+Clinical+Endocrinology+%26+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Preclinical models for investigating how bone marrow adipocytes influence bone and hematopoietic cellularity.</a> Best Practice & Research. Clinical Endocrinology & Metabolism. 35 (4), 101547-101560 (2021).</li>
<li>Horowitz, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((marrow+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Adipocyte%22%5BJournal%5D)">marrow adipocytes.</a> Adipocyte. 6 (3), 193-204 (2017).</li>
<li>Maridas, D. E., Rendina-Ruedy, E., Le, P. T., Rosen, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+differentiation+of+bone+marrow+stromal+cells+and+osteoclast+progenitors+frommice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and differentiation of bone marrow stromal cells and osteoclast progenitors frommice.</a> Journal of Visualized Experiments. (131), e56750(2018).</li>
<li>Schyns, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-classical+tissue+monocytes+and+two+functionally+distinct+populations+of+interstitial+macrophages+populate+the+mouse+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Non-classical tissue monocytes and two functionally distinct populations of interstitial macrophages populate the mouse lung.</a> Nature Communications. 10 (1), 3964-3980 (2019).</li>
<li>Atif, S. M., Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+identification+of+interstitial+macrophages+from+the+lungs+using+different+digestion+enzymes+and+staining+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Isolation and identification of interstitial macrophages from the lungs using different digestion enzymes and staining strategies.</a> Methods in Molecular Biology. 1784, 69-76 (2018).</li>
<li>Scheven, B. A., Milne, J. S., Robins, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sequential+culture+approach+to+study+osteoclast+differentiation+from+nonadherent+porcine+bone+marrow+cells%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cellular+%26+Developmental+Biology.+Animal%22%5BJournal%5D)">A sequential culture approach to study osteoclast differentiation from nonadherent porcine bone marrow cells.</a> In Vitro Cellular & Developmental Biology. Animal. 34 (7), 568-577 (1998).</li>
<li>Bradley, E. W., Oursler, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoclast+culture+and+resorption+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Osteoclast culture and resorption assays.</a> Methods in Molecular Biology. , 19-35 (2008).</li>
<li>Yu, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometric+analysis+of+myeloid+cells+in+human+blood%2C+bronchoalveolar+lavage%2C+and+lung+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Flow cytometric analysis of myeloid cells in human blood, bronchoalveolar lavage, and lung tissues.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 54 (1), 13-24 (2016).</li>
<li>Gibbings, S. L., Jakubzick, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+consistent+method+to+identify+and+isolate+mononuclear+phagocytes+from+human+lung+and+lymph+nodes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A consistent method to identify and isolate mononuclear phagocytes from human lung and lymph nodes.</a> Methods in Molecular Biology. 1799, 381-395 (2018).</li>
<li>Jacquin, C., Gran, D. E., Lee, S. K., Lorenzo, J. A., Aguila, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+multiple+osteoclast+precursor+populations+in+murine+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Identification of multiple osteoclast precursor populations in murine bone marrow.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 21 (1), 67-77 (2006).</li>
<li>Gibbings, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three+unique+interstitial+macrophages+in+the+murine+lung+at+steady+state%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Respiratory+Cell+and+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Three unique interstitial macrophages in the murine lung at steady state.</a> American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 57 (1), 66-76 (2017).</li>
<li>Higashi, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high-speed+western+blot+using+immunoreaction+enhancing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Ultra-high-speed western blot using immunoreaction enhancing technology.</a> Journal of Visualized Experiments. (163), e61657(2020).</li>
<li>Gallagher, S., Chakavarti, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoblot+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunoblot analysis.</a> Journal of Visualized Experiments. 20 (16), 759(2008).</li>
<li>Yin, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glycyrrhizic+acid+suppresses+osteoclast+differentiation+and+postmenopausal+osteoporosis+by+modulating+the+NF-%CE%BAB%2C+ERK%2C+and+JNK+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Pharmocology%22%5BJournal%5D)">Glycyrrhizic acid suppresses osteoclast differentiation and postmenopausal osteoporosis by modulating the NF-κB, ERK, and JNK signaling pathways.</a> European Journal of Pharmocology. 859, 172550(2019).</li>
<li>Liu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LRRc17+controls+BMSC+senescence+via+mitophagy+and+inhibits+the+therapeutic+effect+of+BMSCs+on+ovariectomy-induced+bone+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">LRRc17 controls BMSC senescence via mitophagy and inhibits the therapeutic effect of BMSCs on ovariectomy-induced bone loss.</a> Redox Biology. , (2021).</li>
<li>Jin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thioacetamide+promotes+osteoclast+transformation+of+bone+marrow+macrophages+by+influencing+PI3K%2FAKT+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Orthopedic+Surgery+and+Research%22%5BJournal%5D)">Thioacetamide promotes osteoclast transformation of bone marrow macrophages by influencing PI3K/AKT pathways.</a> Journal of Orthopedic Surgery and Research. 17 (1), 53-63 (2022).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden Interessen haben.

Osteoklasten sind einer der bedeutendsten Zelltypen, die am Auftreten und der Entwicklung von Knochenerkrankungen beteiligt sind, sowie eines der Hauptobjekte der Knochenkrankheitsforschung20. Monozyten/Makrophagen können sich in Osteoklasten differenzieren. Da mononukleäre Makrophagen (RAW264.7-Zellen) zu teuer in der Anschaffung sind und während der Kultur leicht aktiviert werden können, ist es schwierig, In-vitro-Differenzierungsexperimente mit dieser Zelllinie durchzuführen. Obwohl me...

Es wurde berichtet, dass Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, die im Knochenmark existieren, sich in Blutmonozyten und Gewebemakrophagendifferenzieren können 1,2. Die oben genannten Zellen, die sich in Osteoklasten differenzieren können, um das Knochenwachstum und die Knochenentwicklung auszugleichen, werden häufig als Zellmodell verwendet, um Osteoklasten in vivo 3,4 zu induzieren. Knochenmark ist ein spezielles Gewebe, das verschiedene Arten von Zellen enthält, zu denen unter anderem mesenchymale Stammzellen des Knochenmarks, Monozyten-Makrophagenzellen (BMMs), hämatopoetische Stammzellen, Endothelzellen und Immunzellen gehören. Tatsächlich deuteten mehrere frühere Studien darauf hin, dass sich adhärente Zellen, die aus der Knochenmarkhöhle des langen Knochens strömten, in Osteoblasten, Osteoklasten, Chondrozyten oder Adipozyten 5,6,7,8 differenzieren konnten. Obwohl verschiedene Isolations- und Kulturmethoden verwendet wurden, um verschiedene homogene Zellpopulationen herzustellen, gibt es immer noch große Herausforderungen bei der Isolierung und Kultivierung von BMMs aus einer Vielzahl verschiedener Zelltypen.
Es wurden mehrere Methoden entwickelt, um mononukleäre Makrophagen (BMSCs) des Knochenmarks zu extrahieren. Die meisten dieser Methoden sind jedoch komplex 9,10,11. Zum Beispiel erfordert die Dichtegradientenzentrifugation ein spezielles Kit und der Betrieb ist zeitaufwendig und umständlich. Diese Methode eignet sich zur Isolierung von BMMs aus hochvolumigen Blutproben, jedoch nicht aus Knochenmarkproben 9,12,13. Darüber hinaus ist die Extraktion von Gewebeproben mittels Kollagenase-Verdauung ein komplexes und zeitaufwendiges Verfahren; Diese Methode wird nicht für die Isolierung von BMMs aus Knochenmarkproben14,15 empfohlen. Obwohl die Flusstrennung zu hochreinen Monozyten-/Makrophagenpopulationen führen kann, erfordert sie sehr große Stichprobengrößen und hohe Anforderungen an Instrumente und Ausrüstung10,16. Darüber hinaus ist die Mikroperlenanreicherungsmethode extrem teuer und in einem allgemeinen Labor nicht durchführbar17.
Daher wurde in der aktuellen Studie eine bequeme, schnelle und kostengünstige Methode zur Isolierung mononukleärer Makrophagen aus dem Knochenmark vorgeschlagen. Knochenmarkzellen, die für verschiedene Zeitpunkte hafteten, wurden verwendet, um BMMs mit einer sekundären Adhärenzmethode zu isolieren. BMMs, die mit der oben genannten Methode extrahiert wurden, könnten die Bildung von Osteoklasten in vitro induzieren und so ein einfaches und bequemes Zellmodell für die zukünftige Untersuchung von Osteoporose in vitro liefern.

<table><tbody><tr><td>35 mm2 Zellkletterscheiben</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Cathepsin K</td><td>Abcam</td><td>ab19027</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-CD11-Isotypkontrolle</td><td>Abcam</td><td>ab172730</td><td>1 &mu; g/Test, 1,675 mg/ml</td></tr><tr><td>Anti-CD11b/c</td><td>Absin</td><td>abs124232</td><td>&nbsp; 1&mu; g/test, 1 mg/mL</td></tr><tr><td>Anti-TRAP</td><td>Abcam</td><td>ab191406</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Anti-&beta;-Aktin</td><td>Beyotime</td><td>&nbsp; AF5003</td><td>1:1.000</td></tr><tr><td>Zellkletterscheiben</td><td>NEST Biotechnology</td><td>80102</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Corning</td><td>430167</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturflasche</td><td>Corning</td><td>430168</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's modifiziertes Adlermedium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>C11995500BT</td><td></td></tr><tr><td>fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Abcam</td><td>ab150077</td><td>für IF, 1:2.000</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Kaninchen IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721</td><td>für WB, 1:2.000</td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>Pepro tech</td><td>400-28</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Biosharp</td><td>BL302A</td><td></td></tr><tr><td>RANKL</td><td>Pepro tech</td><td>400-30</td><td></td></tr><tr><td>SD Ratte</td><td>Shanghai SLAC Laboratory Animal Co, Ltd</td><td></td><td>1-10 Tage alt</td></tr><tr><td>SDS-PAGE Gel-Vorbereitungsset</td><td>Solarbio</td><td>P1200</td><td></td></tr><tr><td>TRAP/ALP Färbeset</td><td>Wako</td><td>294-67001</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA-Lösung</td><td>Biosharp</td><td>BL512A</td><td></td></tr><tr><td>Wright-Giemsa-Lösung</td><td>Keygen Biotech</td><td>KGA225-1</td><td></td></tr></tbody></table>

isolierung von monozyten-makrophagen-linienzellen aus rattenknochen mittels sekundärer adhärenzmethode

Isolation of Monocyte-Macrophage Lineage Cells from Rat Bones by Secondary Adherence Method

Mit einer Abnahme der Knochenmineraldichte brechen Knochen eher, was sich negativ auf die Lebensqualität eines Patienten auswirkt. Das Wachstum und die Entwicklung von Knochen werden hauptsächlich durch Osteoblasten und Osteoklasten reguliert. Es ist allgemein anerkannt, dass Osteoklasten aus Monozyten-Makrophagen-Zellen (BMMs) des Knochenmarks gewonnen werden. BMMs und andere hämatopoetische Stammzellen befinden sich in der Knochenmarkhöhle. Daher ist die Isolierung einzelner stabiler BMMs aus verschiedenen und heterogenen Zellpopulationen eine große Herausforderung. Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird. Adhärent Zellen, die für 24-48 h in Primärkultur kultiviert wurden, wurden gesammelt. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass etwa 37,94% der Zellen CD11b / c + (Monozyten-Makrophagen-Oberflächenantigen) waren. Tartratresistente Säurephosphatase (TRAP)-Färbung und Western-Blot-Analyse zeigten, dass BMMs in vitro in Osteoklasten differenzieren konnten. Die oben genannten Ergebnisse deuteten darauf hin, dass die sekundären Adhärenzzellen als geeignetes zelluläres Modell für die Osteoklastendifferenzierungsforschung angesehen werden könnten.

Die sekundäre adhärente Zellpopulation war stabil und einheitlich. Mit der kontinuierlichen Zellproliferation wurde die Mehrheit der Zellen größer, mit unregelmäßiger Form und wuchs zu einer radialen adhärenten Scheibe (Abbildung 2C, D). Die Durchflusszytometrie zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen, die CD11b/c, einen molekularen Marker auf der Oberfläche von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, exprimieren, etwa 37,94% betrug (<strong clas...

Hier stellen wir ein Protokoll zur Isolierung von BMMs aus SD-Ratten vor, das als sekundäre Adhärenzmethode bezeichnet wird.

Isolierung von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen aus Rattenknochen mittels sekundärer Adhärenzmethode

With a decrease of bone mineral density, bones are more likely to fracture, thus negatively affecting a patient's quality of life. The growth and ...

In diesem Protokoll werden Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks durch sekundäre Adhärenzmethode extrahiert. Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen können sich erfolgreich zu Osteoklasten differenzieren, was ein stabiles Zellmodell für die Untersuchung von Osteoklasten in vitro liefert. Diese Methode eignet sich für kleine Knochenmarkproben und kann Knochenmark-Monozyten-Makrophagenzellen einfach und schnell aus dem Knochenmark extrahieren, ohne dass High-Tech-Laborgeräte benötigt werden.Die Zunahme von Osteoklasten kann die potenzielle Pathogenese der Osteoporose sein. Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen haben einen gewissen Forschungswert als Osteoklasten-Vorläuferzellen. Um zu beginnen, tauchen Sie die eingeschläferten Ratten in 75% Alkohol für 10 Minuten zur Desinfektion.Nachdem Sie vorsichtig alle Gliedmaßen der Ratte mit einer Schere und einer Pinzette entfernt haben, aspirieren Sie mit PBS mit einer Pipette und spülen Sie das Blut, das an den Gliedmaßen haftet. Dann bei zwei Millilitern des 10%FBS DMEM in eine fünf Milliliter Röhre. Nachdem Sie die Gliedmaßenknochen in das Fünf-Milliliter-Rohr übertragen haben, schneiden Sie mit einer Schere die Gliedmaßenknochen im Röhrchen in kleine Stücke und mischen Sie das Homogenat, um die Knochenmarkzellen in das Kulturmedium zu resuspendieren.Stehen Sie fünf Minuten lang, bis sich die Gewebefragmente am Boden der Röhre abgesetzt haben. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter 10% FBS DMEM in eine 100-Millimeter-Kulturschale hinzu und übertragen dann den Überstand in die Kulturschale. Bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für ca. 24 Stunden inkubieren.Nach dieser Inkubationszeit haftet die Mehrheit der mesenchymalen Stammzellen an der Kulturschalenwand und wächst langsam, während die meisten Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks noch im Kulturmedium suspendiert sind. Übertragen Sie die Zellsuspension in der 100-Millimeter-Kulturschale in einen neuen 25-Zentimeter-Quadratkolben und kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius in 5% Kohlendioxid für weitere 24 Stunden. Nachdem Sie das alte Medium vorsichtig entfernt haben, ersetzen Sie es durch frisches Medium, nachdem die Monozyten-Makrophagenzellen des Knochenmarks an der Kolbenwand haftet haben.Die Durchflusszytometrie zeigte, dass der Prozentsatz der Zellen, die CD11b und c, einen molekularen Marker auf der Oberfläche von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen, exprimieren, etwa 37,94% betrug. Mit der kontinuierlichen Zellproliferation wurde die Mehrheit der Zellen in unregelmäßiger Form größer und wuchs zu einer radialen adhärenten Bandscheibe heran. Die TRAP-Färbungsergebnisse zeigten, dass im Vergleich zur Kontrollgruppe die Anzahl der intrazellulären violettroten Granula in den Zellen, die mit dem Rezeptoraktivator des Kernfaktors kappa B-Ligand und dem Makrophagenkolonie-stimulierenden Faktor induziert wurden, signifikant erhöht war. Die Western-Blot-Analyse zeigte, dass die Expressionsniveaus der osteoklastenspezifischen Proteine TRAP und Cathepsin K in den behandelten Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe signifikant erhöht waren.Das Wichtigste bei diesem Verfahren ist die Zeit, um sekundäre adhärente Zellen in 24 bis 48 Stunden Primärkultur zu sammeln, Knochenmarkmonozyten-Makrophagenzellen beginnen vollständig zu haften. Mit dieser Methode isolierte Monozyten-Makrophagen-Zellen des Knochenmarks können in vitro zu Osteoklasten induziert werden, was ein stabiles Zellmodell für die Untersuchung von Osteoporose darstellt.

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Eine einfache und effiziente Methode, um Makrophagen aus Mixed primären Kulturen von adulten Leber Zellen zu isolieren

Wir stellen ein einfaches und effizientes Protokoll für die Herstellung von menschlichen Makrophagen. Buffy Coats werden durch Doppel Dichtegradientenzentrifugation isoliert verarbeitet und Monozyten werden dann an Makrophagen in Teflon-beschichtete Zellkulturbeutel differenziert. Dies maximiert Makrophagen-Renditen und erleichtert die Zellernte für nachfolgende Experimente.

Isolierung humaner Monozyten durch Doppel-Zentrifugation und ihre Differenzierung zu Makrophagen in Teflon-beschichteten Zellkultur-Taschen

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das große Mengen an murinen Monozyten aus heterogenem Knochenmark für translationale Anwendungen erzeugt. Im Vergleich zu anderen trägt diese neue Methode dazu bei, die Anzahl der getöteten Tiere zu reduzieren und die Kosten zu senken, indem teure Methoden wie die magnetische Zelltrennung mit hohem Gradienten (MACS) vermieden werden.

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Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Osteoklasten sind gewebespezifische Makrophage-Polykaryonen, die aus der monozytenmakrophären Linie hämatopoietischer Stammzellen abgeleitet werden. In diesem Protokoll wird beschrieben, wie Knochenmarkzellen isoliert werden können, so dass große Mengen an Osteoklasten gewonnen werden, während gleichzeitig das Unfallrisiko in traditionellen Methoden reduziert wird.

Isolierung, Reinigung und Differenzierung von Osteoclast-Laufläufern aus der Rattenmarkierung

Dieser Artikel stellt eine Methode vor, die die vollständige Knochenmarkhaftung und die Durchflusszytometrie-Sortierung für die Isolierung, Kultivierung, Sortierung und Identifizierung von mesenchymalen Knochenmarkstammzellen aus Rattenunterkiefern kombiniert.

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Mitigation of Blood Borne Cell Attachment to Metal Implants through CD47-Derived Peptide Immobilization

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Isolierung und Kultivierung von aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen aus Mäusen.

Isolierung und Kultivierung von Makrophagen aus dem Knochenmark aus Mäusen

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Lernen Sie die sekundäre Adhärenzmethode zur Isolierung von Knochenmark-Monozyten-Makrophagen aus Ratten. Diese Technik ermöglicht die effiziente Differenzierung zu Osteoklasten für Osteoporose-Forschung.

Isolierung von Monozyten-Makrophagen-Linienzellen aus Rattenknochen mittels sekundärer Adhärenzmethode

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