Name: Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 27 s
Description: Erfahren Sie eine Pipeline zur Strukturanalyse von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren mittels Proteinreinigung und Kryo-Elektronenmikroskopie. Diese Methode liefert wichtige Erkenntnisse für die gezielte Arzneimittelentwicklung.

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Die Daten des S1PRs-Gi-Komplexes wurden im West China Cryo-EM Center der Sichuan University und im Cryo-EM Center an der Southern University of Science and Technology (SUSTech) gesammelt und im Duyu High-Performance Computing Center der Sichuan University verarbeitet. Diese Arbeit wurde von der Natural Science Foundation of China (32100965 an L.C., 32100988 an W.Y., 31972916 an Z.S.) und dem Vollzeit-Postdoctoral Research Fund der Universität Sichuan (2021SCU12003 bis L.C.)

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<li>Kihara, Y., Maceyka, M., Spiegel, S., Chun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysophospholipid+receptor+nomenclature+review%3A+IUPHAR+Review+8%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Lysophospholipid receptor nomenclature review: IUPHAR Review 8.</a> British Journal of Pharmacology. 171 (15), 3575-3594 (2014).</li>
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<li>Cao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Siponimod+for+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cochrane+Database+of+Systematic+Reviews%22%5BJournal%5D)">Siponimod for multiple sclerosis.</a> Cochrane Database of Systematic Reviews. 11, (2021).</li>
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<li>Scott, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ozanimod+%28RPC1063%29+is+a+potent+sphingosine-1-phosphate+receptor-1+%28S1P1%29+and+receptor-5+%28S1P5%29+agonist+with+autoimmune+disease-modifying+activity%5BTitle%5D)+AND+%22British+Journal+of+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Ozanimod (RPC1063) is a potent sphingosine-1-phosphate receptor-1 (S1P1) and receptor-5 (S1P5) agonist with autoimmune disease-modifying activity.</a> British Journal of Pharmacology. 173 (11), 1778-1792 (2016).</li>
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<li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+activation+mechanisms+of+lipid+GPCRs+by+lysophosphatidic+acid+and+sphingosine+1-phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Differential activation mechanisms of lipid GPCRs by lysophosphatidic acid and sphingosine 1-phosphate.</a> Nature Communications. 13 (1), 731(2022).</li>
<li>Duan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-EM+structure+of+an+activated+VIP1+receptor-G+protein+complex+revealed+by+a+NanoBiT+tethering+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cryo-EM structure of an activated VIP1 receptor-G protein complex revealed by a NanoBiT tethering strategy.</a> Nature Communications. 11 (1), 4121(2020).</li>
<li>DiIorio, M. C., Kulczyk, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+robust+single-particle+cryo-electron+microscopy+%28cryo-EM%29+processing+workflow+with+cryoSPARC%2C+RELION%2C+and+Scipion%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">A robust single-particle cryo-electron microscopy (cryo-EM) processing workflow with cryoSPARC, RELION, and Scipion.</a> Journal of Visualized Experiments. (179), e63387(2022).</li>
<li>Pradelles, P., Grassi, J., Chabardes, D., Guiso, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+immunoassays+of+adenosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+and+guanosine+cyclic+3%27%2C5%27-monophosphate+using+acetylcholinesterase%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme immunoassays of adenosine cyclic 3',5'-monophosphate and guanosine cyclic 3',5'-monophosphate using acetylcholinesterase.</a> Analytical Chemistry. 61 (5), 447-453 (1989).</li>
<li>Jiang, L. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+cAMP+BRET+sensor+to+characterize+a+novel+regulation+of+cAMP+by+the+sphingosine+1-phosphate%2FG13+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Use of a cAMP BRET sensor to characterize a novel regulation of cAMP by the sphingosine 1-phosphate/G13 pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 282 (14), 10576-10584 (2007).</li>
</ol>

Autoren haben keine Interessenkonflikte.

Dieses Protokoll beschreibt eine primäre Pipeline zur Bestimmung der Strukturen von S1PRs durch Kryo-EM und zur Messung der Aktivierungspotenz von S1PRs durch Gi-vermittelten cAMP-Inhibitionsassay. Einige Schritte sind entscheidend für den Erfolg des Experiments.
Um den S1PRs-Gi-Komplex zu reinigen, sollte der Qualität des Virus und der Gesundheit der sf9-Zellen mehr Aufmerksamkeit geschenkt werden. Die Expression des Rezeptors ist in armen sf9-Zellen dramatisch reduziert. Di...

Sphingosin-1-phosphat (S1P), ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist ein ubiquitäres lysophosphatidisches Signalmolekül, das verschiedene biologische Aktivitäten umfasst, einschließlich Lymphozytentransport, vaskuläre Entwicklung, endotheliale Integrität und Herzfrequenz 1,2,3. S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen durch fünf S1P-Rezeptor-Subtypen (S1PRs 1-5); S1PRs kommen in einer Vielzahl von Geweben vor und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die cAMP-Produktion hemmt; S1PR2 und S1PR3 sind mit Gi, Gq und G12/13 gekoppelt, und S1PR4 und S1PR5 übertragen Signale über Gi und G12/136.
Die S1P-S1PR-Signalübertragung ist ein kritisches therapeutisches Ziel für mehrere Krankheiten, darunter Autoimmunerkrankungen7, Entzündungen8, Krebs9 und sogar COVID-1910. Im Jahr 2010 wurde Fingolimod (FTY720) als First-in-Class-Medikament gegen S1PRs zur Behandlung von Multipler Sklerose (MS)11 zugelassen. Es ist jedoch in der Lage, an alle S1PRs außer S1PR2 zu binden, während eine unspezifische Bindung an S1PR3 zu Ödemen der Großhirnrinde, Gefäß- und Bronchialverengung und Lungenepithelleckage führt12. Als alternative Strategie zur Erhöhung der therapeutischen Selektivität wurden subtypspezifische Liganden für den Rezeptor hergestellt. Siponimod (BAF312) wurde 2019 für die rezidivierende MS-Behandlung zugelassen13; Es zielt effektiv auf S1PR1 und S1PR5 ab, während es keine Affinität zu S1PR3 hat und in der klinischen Praxis weniger Nebenwirkungen aufweist14. Im Jahr 2020 genehmigte die US-amerikanische Food and Drug Administration Ozanimod für die MS-Therapie15. Es wurde berichtet, dass Ozanimod eine 25-fach höhere Selektivität für S1PR1 als für S1PR516 aufweist. Insbesondere wurde im Zusammenhang mit der aktuellen COVID-19-Pandemie entdeckt, dass agonistische Medikamente, die auf S1PRs abzielen, zur Behandlung von COVID-19 unter Verwendung immunmodulatorischer Therapietechniken eingesetzt werden können17. Im Vergleich zu Fingolimod hat Ozanimod eine Überlegenheit bei der Senkung der Symptome bei COVID-19-Patienten gezeigt und befindet sich nun in klinischen Studien10. Das Verständnis der strukturellen Basis und Funktion von S1PRs legt eine wichtige Grundlage für die Entwicklung eines Medikaments, das selektiv auf S1PRs18 abzielt.
Viele Techniken werden verwendet, um die Strukturinformationen von Biomakromolekülen zu untersuchen, einschließlich Röntgenkristallographie, Kernspinresonanz (NMR) und Elektronenmikroskopie (EM). Mit Stand März 2022 sind mehr als 180.000 Strukturen in der Protein Databank (PDB) hinterlegt, von denen die meisten durch Röntgenkristallographie aufgelöst wurden. Mit der ersten nahezu atomaren Auflösungsstruktur von TPRV1 (3,4 Å Auflösung), die Yifan Cheng und David Julius 201319 berichteten, ist die Kryo-Elektronenmikroskopie (Kryo-EM) zu einer Mainstream-Technik für Proteinstrukturen geworden, und die Gesamtzahl der EM-PDB-Strukturen betrug mehr als 10.000. Die entscheidenden Durchbruchsbereiche sind die Entwicklung neuer Kameras für die Bildgebung, die als direkte Elektronendetektionskameras bekannt sind, und neue Bildverarbeitungsalgorithmen. Kryo-EM hat die Strukturbiologie und die strukturbasierte Wirkstoffforschung in den letzten zehn Jahren revolutioniert20. Da das Verständnis, wie makromolekulare Komplexe ihre komplizierten Rollen in der lebenden Zelle erfüllen, ein zentrales Thema in den biologischen Wissenschaften ist, hat Kryo-EM das Potenzial, Konformationen dynamischer Molekülkomplexe aufzudecken, insbesondere für Transmembranproteine21. G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCRs) sind die größte Superfamilie von Transmembranproteinen und die Ziele von mehr als 30% der derzeit vermarkteten Arzneimittel22. Die Entwicklung von Kryo-EM hat zu einem Ausbruch hochauflösender Strukturen von GPCR-G-Proteinkomplexen beigetragen, was die Strukturbestimmung für "hartnäckige" Ziele ermöglicht, die für die röntgenkristallographische Analyse im Arzneimitteldesign noch nicht zugänglich sind23. Daher bietet die Kryo-EM-Anwendung die Möglichkeit, die dreidimensionale Struktur von GPCRs unter nahezu nativen Bedingungen mit nahezu atomarer Auflösung zu bestimmen24. Fortschritte in der Kryo-EM ermöglichen es, mechanistische Grundlagen der GPCR-Stimulation oder -Hemmung zu visualisieren und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der neuartigen Bindungsstellen für die GPCR-zielgerichtete Arzneimittelherstellungzu erzielen 25.
Gestützt auf die enormen Fortschritte der Kryo-EM-Technologie haben wir kürzlich Strukturen von gequälten S1PR1-, S1PR3- und S1PR5-Gi-Signalkomplexen identifiziert26,27. Beim Menschen werden S1PRs in verschiedenen Geweben gefunden und zeigen einzigartige Präferenzen für nachgeschaltete G-Proteine 4,5. S1PR1 ist primär mit dem Gi-Protein gekoppelt, das anschließend die Produktion von 3′,5′-zyklischem Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmt. S1PR3 und S1PR5 können auch mit Gi 6,28 gekoppelt werden. Da die Gi-gekoppelte Rezeptoraktivierung die Produktion von cAMP29 verringert, wurde ein Gi-Inhibition cAMP-Assay eingeführt, um cAMP-Hemmungseffekte zur Erfassung funktioneller Veränderungen zu messen26,27. Unter Verwendung einer mutierten Version von Photinus pyralis luciferase, in die ein cAMP-bindendes Proteinteil eingefügt wurde, bietet dieser cAMP-Assay eine einfache und zuverlässige Methode zur Überwachung der GPCR-Aktivität durch Änderungen der intrazellulären cAMP-Konzentration30. Es handelt sich um einen empfindlichen und nicht radioaktiven funktionellen Assay, der zur Überwachung der nachgeschalteten Echtzeitsignalisierung einer Vielzahl von GPCRs für die Wirkstoffforschung eingesetzt werdenkann 31.
Hier wird eine Zusammenfassung der kritischen Methoden zur Auflösung der Aktivierungs- und Arzneimittelerkennungsmodi von S1PRs gegeben, hauptsächlich einschließlich Kryo-EM-Manipulationen und eines Gi-Inhibition cAMP-Assays. Dieser Artikel zielt darauf ab, umfassende experimentelle Leitlinien für weitere Untersuchungen der Strukturen und Funktionen von GPCRs bereitzustellen.

<table><tbody><tr><td>0,05 % Trypsin-EDTA</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 25300054</td><td></td></tr><tr><td>0,22 & Mikro; M Filter</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 42213-PS</td><td></td></tr><tr><td>100 kDa Trennkonzentrator</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88533</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>Cat# 43016</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>Cat# 3917</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# 9087-70-1</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>NEB</td><td>Cat# M0398S</td><td></td></tr><tr><td>Baculovirus-Transfektionsreagenz</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 10362100</td><td>Zur Herstellung von P0-Baculovirus</td></tr><tr><td>Benzamidin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# B6506</td><td></td></tr><tr><td>CHO-K1</td><td>ATCC</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>CHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C6512</td><td></td></tr><tr><td>CryoSPARC</td><td>Punjani, A., et al., 2017</td><td>https://cryosparc.com/</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; kompetente E.coli</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kat# EC0112</td><td></td></tr><tr><td>D-Luciferin-Kaliumsalz</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Kat# 50227</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Kat# D2438</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Kat# S311-500</td><td></td></tr><tr><td>ESF921 Zellkulturmedium</td><td>Expression Systems</td><td>Kat#&nbsp; 96-001</td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>F12 Medium</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 11765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Box</td><td>Cat# SAG-01U-02</td><td></td></tr><tr><td>Flag resin</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# A4596</td><td></td></tr><tr><td>Forskolin</td><td>APExBIO</td><td>Cat# B1421</td><td></td></tr><tr><td>Gctf</td><td>Zhang, 2016</td><td>&nbsp; https://www.mrc-lmb.cam.ac.uk/kzhang/Gctf/</td><td></td></tr> <tr><td>GDN</td><td>Anatrace</td><td>Cat# GDN101</td><td></td></tr><tr><td>Gel-Filtrationssäule</td><td>GE Gesundheitswesen</td><td>Cat# 28990944</td><td></td></tr><tr><td>Gen5 3.11</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# L1312</td><td></td></tr><tr><td>GloSensor cAMP Assay Kit</td><td>Promega</td><td>Cat# E1291</td><td>Gi-Inhibition cAMP Assay Kit</td></tr><tr><td>GloSensor Plasmid</td><td>Promega</td><td>Cat# E2301</td><td>Sensor Plasmid</td></tr><tr><td>Grace' s medium</td><td>GIBCO</td><td>Cat# 11595030</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 8</td><td>Graphpad</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 88284</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma- Aldrich</td><td>Cat# H4034</td><td></td></tr><tr><td>jetPRIME Reagenz</td><td>Polyplus Transfektion</td><td>Cat# 114-15</td><td>Transfektionsreagenz</td></tr><tr><td>Janamycin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# K1030</td><td></td></tr><tr><td>LB medium</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 12780052</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# L2884</td><td></td></tr><tr><td>LMNG</td><td>Anatrace</td><td>Cat# NG310</td><td></td></tr><tr><td>MotionCor2</td> <td>(Zheng et al., 2017)</td><td>https://emcore.ucsf.edu/ucsf-software</td><td></td></tr><tr><td>NanoCab</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 1121822</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 14190-144</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-HA-FLAG-S1PRs</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-G&alpha; i</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBac1-HA-FLAG-T4L-S1PRs-His10</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>pFastBacdual-G&beta; 1&Gamma; 2</td><td>GenScript</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Miniprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# K210003</td><td>Für die Herstellung von Plasmiden und P0 Baculovirus</td></tr><tr><td>Q5 Site-Directed Mutagenesis Kit</td><td>NEB</td><td>Cat# E0554S</td><td>Für die Herstellung von Plasmiden</td></tr><tr><td>Quantifoil</td><td>Quantifoil</td><td>Cat# 251448</td><td></td></tr><tr><td>RELION-3.1</td> <td>(Zivanov et al., 2018)</td><td></td><td></td>https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/relion</tr><tr><td>S1PRs cDNA-Addgen</td><td></td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>scFv16</td><td>Invitrogen</td><td>Cat# 703976</td><td></td></tr><tr><td>Sf9</td><td>Expression Systems</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Siponimod</td><td>Selleck</td><td>Cat# S7179</td><td></td></tr><tr><td>Natriumcholat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat# C1254</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Mikroplatten-Reader</td><td>BIO-TEK</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synthetische T4L-DNA (Sequenz)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Aacatcttcgagatgctgcgcatcgacgaagg cctggcgtctcaagatttacaagaataccgaagg ttattacacgattggcatcggccacctcctgaca aagagcccatcactcaacgctgccgccgagtctga actggacaaagccattggtcgcaacaccaac ggtgtgtcattacaaaggagaggcggcggagaaac tcttcaaccaagatgagatgcggctccgtgg catcctgcgtaatgccaagttgaagcccgtgt<br/& Gt; atgactcccttgatgctgttcgccgtgcagcctt gatcaacatggttttccaaatgggggagaccgg agtggctggttttacgaactccctgcgcatgctcccc agcagaagcgctgggacgaggccgcagtga atttggctaaatctcgctggtacaatcagacacc taaccgtgccaagcgtcatcactaccccg tactggaacttgggacgcttac</td></tr><tr><td>TCEP</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 77720</td><td></td></tr><tr><td>Tetracyclin</td><td>Solarbio</td><td>Cat# T8180</td><td></td></tr><tr><td>Vitrobot Mark IV</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

eine pipeline zur untersuchung der strukturen und signalwege von sphingosin-1-phosphat-rezeptoren

A Pipeline to Investigate the Structures and Signaling Pathways of Sphingosine 1-Phosphate Receptors

Lysophospholipide (LPLs) sind bioaktive Lipide, die Sphingosin-1-phosphat (S1P), Lysophosphatidsäure usw. enthalten. S1P, ein Stoffwechselprodukt von Sphingolipiden in der Zellmembran, ist eines der am besten charakterisierten LPLs, das eine Vielzahl von zellulären physiologischen Reaktionen über Signalwege reguliert, die durch Sphingosin-1-Phosphat-Rezeptoren (S1PRs) vermittelt werden. Dies implizierte, dass das S1P-S1PRs-Signalsystem ein bemerkenswertes potenzielles therapeutisches Ziel für Erkrankungen wie Multiple Sklerose (MS), Autoimmunerkrankungen, Krebs, Entzündungen und sogar COVID-19 ist. S1PRs, eine kleine Untergruppe der GPCR-Familie (G-Protein-gekoppelte Rezeptoren) der Klasse A, bestehen aus fünf Subtypen: S1PR1, S1PR2, S1PR3, S1PR4 und S1PR5. Der Mangel an detaillierten Strukturinformationen behindert jedoch die Wirkstoffentdeckung, die auf S1PRs abzielt. Hier haben wir die Kryo-Elektronenmikroskopie-Methode angewendet, um die Struktur des S1P-S1PRs-Komplexes aufzuklären, und den Mechanismus der Aktivierung, selektiven Wirkstofferkennung und G-Protein-Kopplung mithilfe zellbasierter funktioneller Assays aufgeklärt. Andere Lysophospholipidrezeptoren (LPLRs) und GPCRs können ebenfalls mit dieser Strategie untersucht werden.

Vor dem Einfrieren der Probe des S1PRs-Gi-Komplexes muss die gereinigte Probe durch Größenausschlusschromatographie (SEC) getrennt und mit Gelfiltrationschromatographie analysiert werden. Abbildung 2 zeigt den S1PR3-Gi-Komplex als Beispiel. Der Spitzenanteil des homogenen GPCR-G-Proteinkomplexes lag üblicherweise bei ~10,5 ml der Größenausschlusschromatographie (Abbildung 2A). Die SDS-Seitenanalyse des S1PR3-Gi-Komplexes (Abbildung 2B</stron...

S1P entfaltet seine vielfältigen physiologischen Wirkungen über die Unterfamilie der S1P-Rezeptoren (S1PRs). Hier wird eine Pipeline beschrieben, um die Strukturen und Funktionen von S1PRs zu erläutern.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

Lysophospholipids (LPLs) are bioactive lipids that include sphingosine 1-phosphate (S1P), lysophosphatidic acid, etc. S1P, a metabolic product of ...

Wir befassten uns mit den Aktivierungs- und Neuberechnungsstimmungen von S1PRS durch Besatzung, EM-Manipulationen und GI-Inhab-Zustand A M P A und weniger signifikanten Grundlagen für die Entwicklung eines Medikaments, das solide auf S1PRS abzielt. Fortschritte in ermöglichen es, magnistische Untermalungen der GP ZR-Stimulation oder -Besiedlung zu virulisieren, und weitere Vorteile bei der Aufdeckung der normalen Bindungsstellen für die gezielte Wirkstoffherstellung von T BCR. Die Qualität der Probe ist die Grundlage für alles im richtigen EM-Experiment. Die wesentlichen Faktoren für eine einfache Zubereitung sind verschiedene Produktzustände des SF-Linienverkaufs und eine Ng-Konzentration Demonstration des Verfahrens wird Heli Wang, ein Doktorand von meinem Niveau, sein.Zur Proteinreinigung laden diese Fingerszene einen Phosphatrezeptor oder eine S P R S G Proteinkomplexlösung auf eine Größenausschlusschromatographie oder S E C Gelfiltrationssäule voräquilibriert mit S E C Puffer bei einer Flussrate von 0,5 Milliliter pro Minute bei vier Grad Celsius. Um die gesammelten Fraktionen für die Kryoelektronenmikroskopie zu verwenden, konzentrieren Sie sie mit einem 100 Kilodalton Cutoff-Konzentrator bei 1,300 XG bei vier Grad Celsius. Während der Datenverarbeitung für die 2D-Klassifizierung in der vorläufigen Klassifizierung von Partikeln wählen Sie die 2D-Klassifizierungsfunktion in der Rely On-Software und klicken Sie rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option auf Durchsuchen.Wählen Sie dann den particles.star. Legen Sie anschließend in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf 100 und den Maskendurchmesser A auf 140 fest. Legen Sie in der Berechnungsoption die Anzahl der gepoolten Partikel auf 10 fest und geben Sie das Verzeichnis von einem schnellen, schnellen lokalen Laufwerk in das Feld Partikel in Scratch-Verzeichnis kopieren ein.Für eine schnellere Verarbeitung wählen Sie Ja für die verwendete GPU-Beschleunigung. Für die Teilmenge Auswahl von guten 2D-Ergebnissen als Vorlagen, gehen Sie zur IO-Option der Teilmengenauswahlfunktion und klicken Sie auf Navigieren rechts neben wählen Sie Klassen von model.star. Wählen Sie als Nächstes run_it025_model.Als Eingabe markieren und im Popup-Fenster auf Ausführen klicken, Bilder sortieren auf und umgekehrt sortieren. Klicken Sie dann auf Display. Nachdem Sie gute repräsentative 2D-Ergebnisse als Referenz für die Auto-Picking-Funktion ausgewählt haben, klicken Sie mit der rechten Maustaste und wählen Sie ausgewählte Klassen speichern.Um die Vorlage für die zweite Runde der automatischen Kommissionierung zu verwenden, gehen Sie zur IO-Option der automatischen Kommissionierfunktion. Klicken Sie rechts neben Mikroaufnahmen für die automatische Auswahl auf Durchsuchen und wählen Sie micrographs.star aus. Klicken Sie dann rechts neben 2D-Referenzen auf Durchsuchen und wählen Sie class_averages.star.Wählen Sie außerdem Nein für oder verwenden Sie Leplossian in von Gauß. Führen Sie als Nächstes die Partikelextraktion mit dem Schnurunterstrich-Suffix Unterstrich auto pick.star durch. Führen Sie eine 2D-Klassifizierung mit Partikeln durch.Stern, gefolgt von Teilmengenauswahl mit Run Underscore It Zero 20 five_optimizer. Stern Wählen Sie für die Partikelextraktion rechts neben der Sterndatei des Mikrographen in der Option IO die Option Mikroskopische Aufnahmen aus. Stern und wählen Sie Ja für oder reextrahieren Sie raffinierte Partikel.Nachdem Sie rechts neben der Sterndatei für raffinierte Partikel auf Navigieren geklickt haben, wählen Sie Partikel aus. Stern zum Generieren eines ersten 3D-Modells und einer Referenzkarte, klicken Sie auf Durchsuchen des 3D-Ausgangsmodells rechts neben der Sterndatei der Eingabebilder in der IO-Option und wählen Sie die vorherige particles.star. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf eine und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.Zur 3D-Klassifizierung und Erstellung einer vorläufigen 3D-Karte nach Auswahl der Partikel. Stern Wie zuvor gezeigt, klicken Sie rechts neben der Referenzkarte auf Durchsuchen und wählen Sie Initial Underscore Model Dot MRC. Stellen Sie dann in der Optimierungsoption die Anzahl der Klassen auf vier bis sechs und den Maskendurchmesser A auf 140 ein.Setzen Sie für die Maskengenerierung nach Auswahl einer guten 3D-Karte als Eingabe in der IO-Option den anfänglichen Binarisierungsschwellenwert auf 0,05 und die binäre Karte auf so viele Pixel auf drei erweitern. Als nächstes gehen Sie zur Maskenoption und legen Sie fest. Fügen Sie dieser Anzahl von Pixeln bis acht eine weiche Kante hinzu.Öffnen Sie für die nächste Bearbeitung die Trino Spark-Software, erstellen Sie einen neuen Arbeitsbereich und klicken Sie für den ersten Auftrag auf Job Builder. Um den Partikelstapel zu importieren, geben Sie den Partikelpfad in das Feld Partikelmetapfad und den Filmpfad in das Feld Partikeldatenpfad ein. Importieren Sie als Nächstes 3D-Volumes, indem Sie den Pfad des besten zuvor generierten 3D-Volumes in den Volume-Datenpfad eingeben und die Maske für den Typ des zu importierenden Volumes auswählen.Für eine ungleichmäßige Verfeinerung ziehen Sie die zuvor generierten importierten Unterstrichpartikel als Eingabe von Partikelpartikeln mit ungleichmäßigen Verfeinerungen. Importiertes Unterstrichvolumen, Unterstrich eins als Eingabe des Volumenvolumens für ungleichmäßige Verfeinerungen und importierte Unterstrichmaske Unterstrich eins als Eingabe einer nicht gleichmäßigen Verfeinerungsmaske. Maske. Klicken Sie anschließend auf Q, um die Verarbeitung zu starten, und wiederholen Sie den Vorgang, um eine gute Auflösung zu erhalten.S1PRGI 3D-Karte. Nach dem Plasmidaufbau und der Vorbereitung für die transiente Transfektion fügen Sie zwei Mikrogramm präparierte DNA in 200 Mikroliter Transfektionsreagenzpuffer hinzu. Mischen Sie durch Wirbeln für 10 Sekunden und drehen Sie die Mischung kurz vor Gebrauch.Fügen Sie vier Mikroliter Transfektionsreagenz hinzu und mischen Sie es durch Vortexen und Spinnen, wie zuvor gezeigt. Nachdem Sie das Röhrchen 15 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert haben, lassen Sie langsam 200 Mikroliter der Transfektionsmischung in jede Vertiefung einer Sechs-Well-Platte fallen, die CHOK-One-Zellen enthält, und schütteln Sie die Platte vorsichtig oder mischen Sie sie gründlich. Nach vier bis sechs Stunden Inkubation ersetzen Sie das Transfektionsmedium durch das Zellwachstumsmedium, das aus F 12 Medium und 10% fbs besteht, bevor Sie die Platte in den Inkubator zurückbringen.24 bis 48 Stunden nach der Transsektionsernte der Zellen suspendieren Sie die Zellen in drei Milliliter eines SA-Puffers mit D-luziferischem Kaliumsalz. Dann mit einer Mehrkanalpipette 90 Mikroliter der Zellsuspension in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte geben, die vorsichtig gemischt wird, und 40 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Für die Bestimmung des Fluoreszenzsignals bereiten Sie zunächst 10 Millimolar-Stammlösungen von Siponimod in D M S O vor.Dann machen Sie eine serielle Verdünnung in H B S S-Puffer, der 25 Mikromolare Forskalin enthält, und stimulieren Sie die Zellen mit 10 Mikrolitern verschiedener Konzentrationen dieser Agonistenlösung für 30 Minuten.Als nächstes zählen Sie das Lumineszenzsignal in einem Mikrotiterplattenleser, indem Sie Lumineszenz für die Detektionsmethode auswählen. Endpunkt für Lesetyp und Lumineszenzfaser für Optiktyp in der zugehörigen Software. Stellen Sie außerdem die Optikverstärkung auf 255 ein.Importieren Sie dann die erhaltenen Fluoreszenzsignalwerte in ein Tabellenkalkulationsprogramm und verarbeiten Sie die Daten mit der nichtlinearen Regressionskurve passen Dosis-Wirkungs-Funktion. Der S1PRS-GI-Komplex konnte erfolgreich durch Größenausschlusschromatographie gereinigt werden, die von der SDS-Seite verifiziert wurde. Darüber hinaus war das Elektronenmikroskopieprotokoll, das in dieser Studie befolgt wurde, wirksam bei der Unterscheidung zwischen S1PRSGI-Partikeln mit klaren und gut definierten 2D-Klassen und Partikeln schlechter Qualität.Darüber hinaus konnte eine elektronenmikroskopische Karte von S1PR3 GI mit einer guten Auflösung durch kürzere Schalenkorrelation durch ungleichmäßige Verfeinerung erzeugt werden. Nach der Strukturanalyse wurden funktionelle Assays für S one P R three durch Transfektion von C H O K one Zellen mit Rezeptor- und Sensorplasmiden durchgeführt, die zeigten, dass das Rezeptorplasmid-Sensor-Plasmid-Verhältnis von eins zu drei optimale Ergebnisse liefert. Die Ergebnisse waren jedoch bei insgesamt 2 93 Zellen weniger realistisch Bei dieser Verarbeitung ist die Wahl der Algorithmen im Partikelschnitt und im Abschnitt der 2D- und 3D-Klassifizierung wichtig für die Lösung der so MPS G-Proteinkomplexe, insbesondere für die Modellierung der Lecks und ECFS.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Echtzeit-Bildgebung von Zellen mit dem lipophilen Farbstoff FM1-43 ausgesetzt ermöglicht eine präzise Bestimmung der Kinetik durch die porenbildende Toxine sind von der Plasmamembran entfernt. Dies ist ein empfindlicher Test, der verwendet werden kann, um Anforderungen für die Ca 2 +, Sphingomyelinase und anderen Faktoren auf die Plasmamembran Reparatur zu beurteilen.

Live-Imaging-Assay für die Bewertung der Rollen von Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sphingomyelinase und in der Reparatur von Pore Toxin-bildenden Wunden

Phosphoinositiden signalisieren Lipide, deren relative Häufigkeit schnell ändert als Reaktion auf verschiedene Reize. Dieser Artikel beschreibt eine Methode, um die Fülle der Phosphoinositiden Messung durch metabolisch Markierung von Zellen mit 3 H-myo-Inositol, gefolgt von Extraktion und Deacylierung. Extrahiert glycero-inositides werden dann durch Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie getrennt und durch Strömungs Szintillations quantifiziert.

Radiomarkierung und Quantifizierung von Cellular Ebenen Phosphoinositide von High Performance Liquid Chromatography-gekoppelten Durchflussscintilla

PI (4,5) P 2 regelt verschiedene Zellfunktionen, aber die nanoskaligen Organisation in der Zellplasmamembran ist wenig bekannt. Durch Markierung PI (4,5) P 2 mit einer zweifarbige Fluoreszenzsonde zur Domäne Pleckstrin Homology fusioniert beschreiben wir einen neuen Ansatz der PI (4,5) P 2 in der räumlichen Verteilung der Plasmamembran im Nanometerbereich zu studieren .

Einzelmolekül-Super-Resolution Imaging von Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphat in der Plasmamembran mit neuartigen Fluoreszenzsonden

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zu quantifizieren und zu einzelnen Sphingomyelin Arten mit mehreren Reaktionskontrolle zu qualifizieren und MS/MS/MS-Modus, beziehungsweise.

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Hier beschreiben wir Protokolle mit fluoreszierenden Lipidsensoren und Liposomen, um festzustellen, ob ein Protein Phosphatidylserin oder Phosphatidylinositol-4-phosphat in vitroextrahiert und transportiert.

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Sphingolipide sind bioaktive Metaboliten mit einer gut etablierten Rolle bei menschlichen Erkrankungen. Die Charakterisierung von Veränderungen in Geweben mit Massenspektrometrie kann Rollen in der Krankheitsätiologie aufdecken oder therapeutische Ziele identifizieren. Die OCT-Verbindung, die für die Kryokonservierung in Biorepositorien verwendet wird, stört jedoch die Massenspektrometrie. Wir skizzieren Methoden zur Analyse von Sphingolipiden in menschlichen Geweben, die in OCT mit...

Vorbereitung von menschlichem Gewebe, eingebettet in die optimale Schnitttemperaturmischung für die massenspektrometrische Analyse

Dieses Protokoll nutzt die Agaroseschwellung als eine leistungsfähige und generalisierbare Technik zum Einbau von integralen Membranproteinen (IMPs) in riesige unilamellare Lipidvesikel (GUVs), wie hier für die Rekonstitution des menschlichen 1A-Serotoninrezeptorproteins (5-HT1AR), einer der Klassen pharmakologisch wichtiger G-Protein-gekoppelter Rezeptoren, beschrieben.

Konstruktion von Modelllipidmembranen mit G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCRs)

Wir stellen eine kostengünstige Methode zur Beurteilung der liposomalen Membranpermeabilität vor, die im Vergleich zu herkömmlichen Techniken eine überlegene Sensitivität und Auflösung aufweist. Unter Verwendung einer neuartigen verkapselten Ligandensubstitutionsreaktion werden mit dieser Technik Phospholipase A2-induzierte Veränderungen in Modellmembranen nachgewiesen. Dieser leicht in Standardanalysen integrierbare Ansatz verbessert die Auflösung für die Untersuchung der Membranbiophysik und...

Ein Liposomenmembran-Permeabilitätsassay zur Untersuchung der Auswirkungen von Phosphatidylinositolphosphatgruppen auf die membranotrope Wirkung des Giftes PLA2

Wir stellen Richtlinien für die Entwicklung synthetischer 'chemischer Wandler' vor, die die Kommunikation zwischen natürlich nicht verwandten Proteinen induzieren können. Darüber hinaus werden detaillierte Protokolle für die Synthese und Prüfung eines spezifischen "Schallkopfs" vorgestellt, der es einem Wachstumsfaktor ermöglicht, ein entgiftendes Enzym zu aktivieren und folglich die Spaltung eines Krebsprodrugs zu regulieren.

Imitieren die Funktion von Signalproteinen: Gegen künstliches Signal Transduction Therapie

Guanosintriphosphat (GTP) -Bindung ist eine der frühesten Ereignisse in der G-Protein-Coupled Receptor (GPCR) -Aktivierung. Dieses Protokoll beschreibt die pharmakologisch charakterisierende spezifische GPCR-Ligand-Wechselwirkungen durch die Überwachung der Bindung des radioaktiv markierten GTP-Analogs [ 35 S] Guanosin-5'-O- (3-thio) triphosphats ([ 35 S] GTPγS) in Antwort auf einen Liganden von Interesse.

Messung der G-Protein-gekoppelten Rezeptorsignalisierung über radioaktiv markierte GTP-Bindung

Erfahren Sie eine Pipeline zur Strukturanalyse von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren mittels Proteinreinigung und Kryo-Elektronenmikroskopie. Diese Methode liefert wichtige Erkenntnisse für die gezielte Arzneimittelentwicklung.

Eine Pipeline zur Untersuchung der Strukturen und Signalwege von Sphingosin-1-phosphat-Rezeptoren

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