Analyse der kardialen kontraktilen Dysfunktion und Ca²⁺ Transienten in Nagetiermyozyten

Dieser Ansatz erkennt Veränderungen der kontraktilen Funktion während der Entwicklung von Herzinsuffizienz. Die funktionelle Reaktion in Myozyten auf Neurohormone und potenzielle Therapeutika kann ebenfalls gescreent werden. Die Positionierung der Myozyten kann Übung erfordern, ist aber unerlässlich, um eine konsistente Sarkomerlängenbildgebung zu erhalten.

Margaret Westfall, außerordentliche Professorin und Hauptforscherin des Labors, demonstriert das Verfahren. Bevor Sie mit dem Experiment beginnen, heizen Sie eine Gelpackung und Medien in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten vor. Schalten Sie die im Manuskript erwähnten Komponenten der kontraktilen Funktionsplattform ein und montieren Sie die Schläuche in die Schlauchpumpe.

Anschließend die vorgewärmte Gelpackung in den Tubenhalter geben und das Vakuum in der Stromversorgung des Zellstimulators einschalten. Legen Sie einen 50-Milliliter-Schlauch mit Medien in den isolierten Schlauchhalter, um die Durchblutung mit 0,5 Milliliter pro Minute durch den Schlauch der Schlauchpumpe zu beginnen. Als nächstes fügen Sie zwei Milliliter vorgewärmtes Medium zu einem kleinen Wiegeboot hinzu und übertragen einen Deckschein mit Myozyten aus der Stimulationskammer in das Wiegeboot.

Bringen Sie die Stimulationskammer bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid in den Inkubator zurück. Entfernen Sie den Abdeckschein vom Wiegeboot und wischen Sie die Unterseite vorsichtig ab, bevor Sie ihn in eine frisch gefettete Abdeckkammer geben und einen Tropfen Medien auf den Abdeckschein geben. Legen Sie eine Platinelektrodenhalterung über den Abdeckschlicker, legen Sie dann einen neuen Abdeckschlicker mit einer Pinzette über die Oberseite und legen Sie eine obere Halterung über das Deckschlittensandwich.

Installieren Sie zwei oder vier Nummer-Null-Neigekopfschrauben, um die Montage der Kammer abzuschließen. Wenn in der Schlauchpumpe das Medium im gesamten Schlauch vorhanden ist, befestigen Sie den Schlauch am Vorwärmer und den Vorwärmer an der Deckelrutschkammer. Dann beginnen Sie mit der Perfusion bei 0,5 Milliliter pro Minute und legen Sie ein Taschentuch unter die Kammer, um sicherzustellen, dass keine Lecks auftreten.

Nachdem Sie die Abdeckungsschlickerkammer in den Tischadapter des Mikroskops eingesetzt haben, schalten Sie das Heizsystem ein und gleichen Sie die Baugruppe für fünf bis 10 Minuten aus, um eine konstante Medientemperatur von 37 Grad Celsius in der Mitte der Kammer zu erreichen. Beobachten Sie, wie die perfundierten Medien am gegenüberliegenden Ende der Kammer mit Schläuchen gesammelt werden, die mit einem Vakuumsystem verbunden sind. Während der Gleichgewichtszeit visualisieren Sie Myozyten mit dem 40-fachen Wasserimmersionsobjektiv am Mikroskop.

Um den Schrittmacher zu aktivieren, stellen Sie die Spannung auf 35 bis 40 Volt ein und stellen Sie die Stimulationsfrequenz auf 0,2 Hertz ein, um die kontraktile Funktion und das Überleben der Myozyten zu optimieren. Um Sarkomer-Verkürzungsspuren zu sammeln, öffnen Sie die Software auf dem Computer und wählen Sie OK, Datei und neue Registerkarten. Bereiten Sie eine Bildschirmvorlage vor, indem Sie Ablaufverfolgungen auswählen, Benutzerlimits und Sarkomerlänge bearbeiten.

Zeichnen Sie Sarkomerlängenspuren mit der Datei und neuen Registerkarten auf, identifizieren Sie einen kontrahierenden Myozyten und positionieren Sie den Myozyten entlang der Längsachse der Kamera, so dass das Streifenmuster vertikal ist. Verwenden Sie die Computermaus, um die Region von Interesse oder die ROI-Box über dem Myozyten zu platzieren. Wählen Sie sammeln und starten Sie die Aufzeichnung der kontraktilen Funktion.

Aufzeichnung der Verkürzung für 60 Sekunden von jedem Myozyten bei niedrigen Stimulationsfrequenzen von 0,5 Hertz. Aufzeichnung der Sarkomerverkürzung von fünf auf 10 Zellen pro Deckbeleg. Um die Verkürzung über einen Frequenzbereich zu messen, platzieren Sie die Myozyten auf jeder Frequenz, um vor der Aufnahme eine Steady-State-Verkürzung zu erhalten.

Verdoppeln Sie die Perfusionsrate und beginnen Sie 15 bis 20 Sekunden nach der Stimulation mit der Aufnahme bei einer neuen Frequenz im Bereich von 0,2 bis zwei Hertz und zeichnen Sie nicht mehr als zwei Myozyten pro Deckschlupf auf, um über den angegebenen Bereich der Stimulationsfrequenzen zu verkürzen. Zeichnen Sie mindestens sieben Kontraktionen pro Zelle auf, um zuverlässige signalgemittelte Daten zu erhalten. Wählen Sie die Datei aus, wählen Sie eine aufgezeichnete Ablaufverfolgung aus, und wählen Sie dann Öffnen aus.

Wählen Sie die erste Registerkarte der Basisablaufverfolgung aus, und legen Sie dann das gelbe Feld oben in der Ablaufverfolgung fest, um die Sarc-Länge zu erhalten. Bereiten Sie eine Analysevorlage mit monotonen transienten Analyseoptionen und TTL-Ereignismarkierung im Feld Definition von T Null in den erforderlichen Optionen aus dem Menü vor. Speichern Sie diese Analyseoptionen, indem Sie Vorlagen auswählen und die Analysevorlage mit einem Bezeichner speichern.

Laden Sie die Analysevorlage, bevor Sie die einzelnen Ablaufverfolgungen analysieren. Um die Daten zu analysieren, wählen Sie Markierungen, Gate, Transienten hinzufügen und dann aus Ereignismarkierung und Analysebereich konvertieren. Stellen Sie den Zeitbereich von minus 0,01 bis 1,20 Sekunden für Myozyten mit einem Tempo von 0,2 Hertz ein.

Wählen Sie einen kürzeren Zeitraum für Myozyten, die bei höheren Frequenzen stimuliert werden. Wählen Sie Operationen und Durchschnittsereignisse aus, um eine signalgemittelte Aufzeichnung unterhalb der ursprünglichen Basisspur zu erzeugen. Als nächstes wählen Sie Registerkarte eins der signalgemittelten Spur und gehen Sie dann zu Markierungen im oberen Menü, gefolgt von transient hinzufügen, wählen Sie Operationen und monotone transiente Analyse, um die signalgemittelten Werte für Baseline-Sarkomer-Parameter im Signalmittelanzeigefeld anzuzeigen.

Wählen Sie Monotone transiente Analyse und Zwischenablagestrom exportieren und übertragen Sie die transiente Sarkomeranalyse in eine Tabelle für die zusammengesetzte Analyse mehrerer Myozyten. Um die signalgemittelte Spur zu kopieren, wählen Sie Export, aktuelle Spur, dann Zwischenablage und Optionen Registerkarten in der Reihenfolge und setzen Sie die Dezimalstellen auf fünf. Wählen Sie Tabstopprennzeichen und klicken Sie auf OK.

Zeichnen Sie die signalgemittelten Spuren für jede Myozytenaufzeichnung in eine zweite Tabelle ein. Die Studie zeigte, dass die Drucküberlastung oder PO die kontraktile Funktion der Myozyten im Vergleich zur Scheingruppe reduzierte. Vier Tage nach dem Gentransfer von kardialem Troponin IT 144D oder cTnIT144D kehrte die kontraktile Fähigkeit in den PO-Myozyten jedoch zu Scheinwerten zurück, was darauf hindeutet, dass die Myozytenfunktion wiederhergestellt werden konnte.

In den ersten Studien verstärkte der Gentransfer von cTnIT144D die Peak-Verkürzung und erhöhte die diastolischen Kalziumspiegel im Vergleich zu CTnI. Oft sind Feinjustierungen in der Positionierung der kardialen Myozyten erforderlich, um klare Verkürzungsspuren zu erhalten. Dieses Protokoll kann auch an kardialen Myozyten durchgeführt werden, die mit kalziumempfindlichen Fluoreszenzfarbstoffen wie Fura-2 AM beladen sind, um zusätzlich zur Verkürzung Kalziumtransienten zu erkennen.