Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen
11. Mai 2022
Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.
Unser Modell ist von hoher Relevanz für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere für Multiple Sklerose. Und es kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Es ist ein detailliertes Protokoll, das bei Mäusen durch einen chirurgischen Eingriff schnell und stabil eine schwere Demyelinisierung verursachen könnte.
Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, seien Sie geduldig und stellen Sie sicher, dass die Koordinaten genau sind. Beginnen Sie mit dem Anschließen einer 32-Gauge-Nadel an eine 5-Mikroliter-Spritze. Nehmen Sie 5 Mikroliter LPC-Lösung zur Vorbereitung der Injektion ab.
Als nächstes bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie der Maus durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes, während die Atmung glatt ist. Positionieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit der Rückenseite nach oben und sichern Sie den Kopf mit einem Nasenkegel und einer Zahnklemme. Befestigen Sie die Maus mit beidseitigen Ohrbügeln am stereotaktischen Gerät.
Stellen Sie sicher, dass die Ohrbügel eben sind und der Kopf horizontal und stabil ist. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch Abwischen mit Jodophor. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt auf etwa 1,5 Zentimeter entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.
Wischen Sie die Fertigkeit mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis Bregma, Lambda und hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf den stereotaktischen Apparat. Stellen Sie die horizontale Positionierung des Kopfes des Tieres sicher und lokalisieren Sie das Corpus callosum.
Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, notieren Sie die Koordinaten und markieren Sie sie mit einer Markierung auf dem Schädel. Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer ab. Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.
Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten. Um die Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, injizieren Sie 2 Mikroliter LPC-Lösung an jeder Injektionsstelle mit einer Rate von 0,4 Mikrolitern pro Minute. Halten Sie die Nadel nach der Injektion für weitere 10 Minuten in jeder Stelle.
Vernähen Sie schließlich die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Das repräsentative Bild zeigt den Nachweis der Legionen der weißen Substanz mittels Luxol schneller blauer Färbung. Aus den Ergebnissen ist eine stabile Demyelinisierung des Corpus callosum 10 und 28 Tage nach der Injektion zu sehen.
Die Quantifizierung des Demyelinisierungsbereichs zu verschiedenen Zeitpunkten ist hier dargestellt. Durch Immunfluoreszenzfärbung des abgebauten Myelin-Basisproteins wurde in der LPC-injizierten Gruppe 10 Tage nach der Injektion ein bemerkenswerter Anstieg des dMBP beobachtet, was einen Myelinverlust im Corpus callosum darstellt. Die Western-Blot-Analyse der Expression des Myelin-Basisproteins (MBP) zeigte einen signifikanten Verlust von MBP nach Injektion von LPC.
Beta-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet, um den Baseline-Ausdruck zu messen. Elektronenmikroskopische Bilder bestätigen die myelinisierte Ultrastruktur im Corpus callosum der Scheingruppe und der LPC-injizierten Gruppe. GST-pi ist der Marker der Oligodendrozyten-Vorläuferzelle oder OPC, Differenzierungsreifung.
Nach 10 Tagen LPC-Injektion nahm die GST-pi im Vergleich zur Scheingruppe ab. Gleichzeitig kann die Proliferationsfähigkeit von Oligodendrozyten durch das Verhältnis der Oligodendrozytenproliferation und der gesamten Oligodendrozyten-Linienzellen reflektiert werden. Das höhere Verhältnis stellt eine stärkere Proliferation von Oligodendrozyten nach 10 Tagen nach der Injektion dar.
Die repräsentativen Bilder zeigen den Schwimmweg der Mäuse in jeder Gruppe, in Anwesenheit der Plattform und nach dem Entfernen der Plattform. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das räumliche Gedächtnis von demyelinisierten Mäusen im Zweipunkt-LPC-Injektionsmodell signifikant beeinträchtigt ist. Stellen Sie bei diesem Verfahren sicher, dass die Injektionsrate genau ist, und halten Sie die Nadel für weitere 10 Minuten an jeder Stelle.
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Übersicht
Dieses Protokoll beschreibt eine zweipunktuelle Injektion von Lysophosphatidylcholin (LPC) unter Verwendung eines stereotaktischen Rahmens, um ein stabiles Demyelinisierungsmodell bei Mäusen zu erzeugen. Es stellt eine Methode bereit, die für die Erforschung von Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose, von Relevanz ist und die Untersuchung der Mechanismen und Folgen der Demyelinisierung ermöglicht.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Demyelinisierungsforschung
- Mausmodelle von Krankheiten
Hintergrund
- Das Verständnis der Demyelinisierung ist entscheidend für die Entwicklung von Therapien bei Erkrankungen wie Multipler Sklerose.
- Das beschriebene Verfahren dient dazu, in Laborumgebungen eine schnelle und reproduzierbare Demyelinisierung auszulösen.
- Eine präzise chirurgische Technik ist wichtig für den Erfolg des Verfahrens.
- Histologische Analysen wie die Luxol-Fast-Blue-Färbung werden zur Beurteilung des Modells verwendet.
Zweck der Studie
- Etablierung eines zuverlässigen Modells zur Untersuchung der Mechanismen der Demyelinisierung.
- Unterstützung der Forschung zu potenziellen therapeutischen Interventionen bei demyelinisierungsbedingten Erkrankungen.
- Bereitstellung detaillierter chirurgischer Protokolle, die quantifizierbare Ergebnisse liefern.
Verwendete Methoden
- Das Modell beinhaltet einen stereotaktischen chirurgischen Ansatz für LPC-Injektionen.
- Mäuse erhalten LPC-Lösung an präzisen anatomischen Stellen, gezielt im Bereich des Corpus callosum.
- Jede Injektion umfasst 2 Mikroliter LPC, die mit kontrollierter Rate verabreicht werden.
- Postoperative Untersuchungen nach 10 und 28 Tagen liefern wichtige Ergebnisparameter.
- Histologische Methoden wie Immunfluoreszenz und Western Blotting werden zur Analyse des Myelinverlusts eingesetzt.
Hauptergebnisse
- Eine stabile Demyelinisierung im Corpus callosum wurde erreicht, die durch histologische Färbung zu mehreren Zeitpunkten nachweisbar war.
- Ein Anstieg von Markern, die auf einen Myelinverlust hinweisen, wurde durch verschiedene Analysen bestätigt.
- Verhaltensuntersuchungen zeigten signifikante Beeinträchtigungen des räumlichen Gedächtnisses nach der Demyelinisierung.
- Die Ergebnisse deuten auf Veränderungen der Proliferation und Differenzierung von Oligodendrozyten als Reaktion auf die LPC-Behandlung hin.
Schlussfolgerungen
- Diese Studie etabliert erfolgreich ein Modell zur Erforschung der Dynamik der Demyelinisierung und potenzieller therapeutischer Strategien.
- Die Ergebnisse liefern Einblicke in die neuronalen Mechanismen, die der Demyelinisierung zugrunde liegen, sowie in die Rolle der Oligodendrozyten.
- Dieses Modell könnte das Verständnis von Multipler Sklerose und ähnlichen Erkrankungen voranbringen.
Häufig gestellte Fragen
Aussagekräftige Relevanz für die Industrie
Das stabil etablierte Zwei-Punkt-LPC-Injektionsmodell ermöglicht eine schnelle und reproduzierbare Induktion fokaler Demyelinisierung bei Mäusen und unterstützt damit direkt die entdeckungsorientierte Forschung zu demyelinisierenden Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose. Dieses Modell bietet eine robuste Plattform für die mechanistische Risikominderung, die Validierung von Zielstrukturen sowie die quantitative Beurteilung von Myelinverlust und -reparatur. Aufgrund seiner Reproduzierbarkeit und quantitativen Ergebnisse stellt es ein entscheidendes Werkzeug für die präklinische Evaluierung und die Priorisierung von Wirkstoffkandidaten in neuroinflammatorischen Krankheitsprogrammen dar.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Ermöglicht die Untersuchung von Entmarkungsmechanismen und der Beteiligung von Signalwegen in krankheitsrelevanten Systemen.
- Unterstützt die funktionelle Validierung von Zielstrukturen durch Quantifizierung des Myelinverlusts und der Reaktionen der Oligodendrozyten.
- Erleichtert die Vorhersagbarkeit bei der Überprüfung therapeutischer Hypothesen für neuroinflammatorische Erkrankungen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Bietet ein validiertes In-vivo-System für die anschließende Wirkstoffprüfung, das auf Remyelinisierung oder Neuroprotektion abzielt.
- Ermöglicht standardisierte und reproduzierbare Demyelinisierung, die für quantitative histologische und verhaltensbezogene Analysen geeignet ist.
- Ermöglicht eine zuverlässige Bewertung von Testinterventionen anhand messbarer Endpunkte.
Translationale und präklinische Forschung
- Entspricht der krankheitsrelevanten Pathologie, die bei multipler Sklerose beobachtet wird, und unterstützt die translationale Biomarkerentwicklung.
- Gewährleistet Kontinuität von der mechanistischen Entdeckung bis zur präklinischen Validierung therapeutischer Strategien.
- Verringert das biologische Risiko, indem akute Demyelinisierung und funktionelle Beeinträchtigung in vivo modelliert werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Dieses Modell ist in die Entdeckungs- bis präklinische Kontinuum integriert und verbindet frühe mechanistische Studien mit translationsmedizinischer Forschung bei demyelinisierenden Erkrankungen.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch quantifizierbare Analysen von Demyelinisierung und Oligodendrozyten.
- Screening: Bietet assaysichere, reproduzierbare Ergebnisse für die Bewertung von Substanzen und Dosis-Wirk-Studien.
- Analytik: Ermöglicht die quantitative Messung von Myelinverlust, Proteinausprägung und Verhaltensdefiziten zur vergleichenden Analyse.
- Translationale Forschung: Modelliert krankheitsrelevante Endpunkte zur Abstimmung von Biomarkern und präklinischer Validierung.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Bietet eine standardisierte, wiederverwendbare in-vivo-Plattform für mehrere Forschungsprogramme zu neuroinflammatorischen Erkrankungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit und verringert mechanistische Unschärfen in der Forschung zur Demyelinisierung.
- Operationaler Wert: Bietet standardisierte, reproduzierbare und skalierbare In-vivo-Modelle für den Einsatz über verschiedene Programmgebiete hinweg.
- Strategischer Wert: Verbessert die Entscheidungsfindung hinsichtlich Projektfortführung oder -einstellung und die Kapitalnutzungseffizienz durch robuste präklinische Daten.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht die risikoadjustierte Priorisierung und Weiterentwicklung von Wirkstoffen gegen neuroinflammatorische Erkrankungen.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in stereotaktischer Chirurgie und präziser anatomischer Zielgenauigkeit bei Mäusen.
- Setzt Zugang zu Infrastruktur für histologische, immunfluoreszenz- und verhaltensanalytische Untersuchungen voraus.
- Erfordert eine standardisierte Vorgehensweise zwischen Teams hinsichtlich Injektionskoordinaten und -geschwindigkeit zur Reproduzierbarkeit.
- Die Anpassung an andere Bereiche des Zentralnervensystems oder an andere Krankheitsmodelle kann eine Optimierung des Protokolls erfordern.
- Das Modell spiegelt hauptsächlich eine akute Demyelinisierung wider; für chronische Studien oder Untersuchungen zur Remyelinisierung können zusätzliche Validierungen notwendig sein.
