Name: Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 55 s
Description: Lernen Sie ein stereotaktisches Zwei-Punkt-Injektionsverfahren mit Lysophosphatidylcholin zur Erzeugung eines stabilen Demyelinisierungsmodells bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen multiplier Sklerose.

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Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (Grants: 82071380, 81873743) unterstützt.

Alle Tierverfahren wurden vom Institute of Animal Care Committee des Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China, genehmigt. Für die vorliegende Studie wurden erwachsene männliche und weibliche C57BL/6-Mäuse (Wildtyp, WT; 20-25 g; 8-10 Wochen alt) verwendet. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Die Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien (SPF) Tieranlage untergebracht, in der Wasser und Nahrung ad libitum geliefert wurden. Sie wurden in einer abwechselnden 12-stündigen Periode von Hell-Dunkel-Zyklus unter den Standardbedingungen von 22 ° C Temperatur und relativer Luftfeuchtigkeit von 55% -60% gehalten.
1. LPC-Lösungsvorbereitung
<ol><li>25 mg LPC-Pulver (siehe Materialtabelle) werden mit 250 μL Chloroform- und Methanolmischlösung (1:1) gelöst, um eine 10%ige LPC-Lösung herzustellen, und sie in ein 500-μL-Zentrifugenröhrchen überführen. HINWEIS: Wenn der LPC nicht vollständig gelöst ist, legen Sie das Zentrifugenröhrchen in einen Ultraschallreiniger und Ultraschall bei 40 kHz für ~ 1 h, um eine gleichmäßige Lösung zu erhalten.</li>
	<li>Teilen Sie die Lösung in 3 μL/Röhrchen und lagern Sie sie bei −80 °C. HINWEIS: Die Lösung kann für ~ 2 Jahre gelagert werden.</li>
	<li>Vor der Operation wird die Lösung (Schritt 1.2.) mit 27 μL 0,9%iger NaCl-Lösung verdünnt und in einem Wasserbad mit konstanter Temperatur bei 37 °C aufbewahrt. HINWEIS: Bereiten Sie die Lösung kurz vor Beginn der Injektion vor.</li>
</ol>2. Chirurgische Vorbereitung
<ol><li>Verwenden Sie eine 32 G, 2 in Nadel, um eine 5 μL Spritze anzuschließen (siehe Tabelle der Materialien). Stellen Sie sicher, dass die Mikroliterspritze ungehindert ist. Zur Vorbereitung der Injektion werden 5 μL LPC-Lösung entnommen.</li>
	<li>Betäuben Sie die Maus in einer Induktionskammer, die mit einem Isofluran-Verdampfer verbunden ist, mit 3% Isofluran, gemischt mit 100% Sauerstoff mit einer Rate von etwa 0,3 l / min.</li>
	<li>Bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie durch das Fehlen eines Zehenkneifreflexes, während die Atmung glatt ist.</li>
	<li>Rasieren Sie den Kopf der Maus mit einem elektrischen Rasierer zwischen den Ohren. Tragen Sie schmierende Augentropfen auf, um Hornhauttrockenheit während des Eingriffs zu verhindern.</li>
	<li>Positionieren Sie dann die Maus in einem stereotaktischen Rahmen (siehe Materialtabelle) mit der dorsalen Seite nach oben und sichern Sie den Kopf mit Nasenkonus und Zahnklemme. Halten Sie die Anästhesie mit 1,2% -1,6% Isofluran durch die Nase aufrecht. HINWEIS: Die Isoflurankonzentration kann entsprechend dem Atmungsstatus der Mäuse eingestellt werden.</li>
</ol>3. Chirurgischer Eingriff
HINWEIS: Die Tiere werden während aller Eingriffe auf ein Heizkissen gelegt.
<ol><li>Befestigen Sie die Maus mit bilateralen Ohrstangen am stereotaktischen Gerät. Stellen Sie sicher, dass die Ohrstangen eben und der Kopf horizontal und stabil ist.</li>
	<li>Desinfizieren Sie die Haut auf dem Kopf, indem Sie mehrmals mit Jodophor abwischen, gefolgt von Alkohol in kreisförmiger Bewegung. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt von etwa 1,5 cm entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.</li>
	<li>Wischen Sie den Schädel mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis die Bregma, Lambda und die hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf das stereotaktische Gerät. HINWEIS: Verwenden Sie Wasserstoffperoxid mit Vorsicht und vermeiden Sie es, das umgebende Gewebe zu berühren.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass der Kopf des Tieres horizontal positioniert wird (sowohl vorne als auch hinten und links und rechts).<ol><li>Stellen Sie den Z-Achsenknopf des stereotaktischen Rahmens so ein, dass sich die Nadelspitze und der Schädel einfach berühren, ohne sich zu biegen, und messen Sie dann die Z-Achsenkoordinate. Überprüfen Sie die Z-Koordinaten von bregma und posterior fontanelle.</li>
		<li>Stellen Sie die Ohrstange so ein, dass die Differenz zwischen den Z-Koordinaten von bregma und hinterer Fontanelle nicht mehr als 0,02 mm beträgt. Befolgen Sie dann die gleiche Methode, um die Z-Koordinaten der entsprechenden Positionen auf der linken und rechten Seite der Mittellinie zu messen. Passen Sie die Ohrstange an, um sicherzustellen, dass sich die linke und rechte Seite auf der gleichen Höhe befinden.</li>
	</ol></li>
	<li>Suchen Sie das Corpus callosum. Setzen Sie den XYZ-Ursprung auf bregma. HINWEIS: Die erste Injektionsstelle ist 1,0 mm lateral zum Bregma entfernt, 2,4 mm tief und 1,1 mm vorne. Die zweite Injektionsstelle ist 1,0 mm seitlich zum Bregma entfernt, 2,1 mm tief und 0,6 mm vorne. Zum Beispiel ist die Koordinate des Bregmas (0,0,0). Messen Sie die Z-Koordinate der entsprechenden Position, die als (-1, 1,1, X) und (-1, 0,6, Y) gekennzeichnet ist. Es kann bestimmt werden, dass die erste Injektionsstellenkoordinate des Corpus callosum (-1, 1,1, −[X + 2,4]) und die zweite Injektionsstelle (-1, 0,6, −[Y + 2,1]) ist.</li>
	<li>Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, machen Sie eine Markierung mit einem sterilen Marker auf dem Schädel und notieren Sie die Koordinaten.</li>
	<li>Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer (siehe Materialtabelle). Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.</li>
	<li>Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten und starten Sie die Injektion. Um eine Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, werden an jeder Injektionsstelle (Schritt 3.5.) 2 μL LPC-Lösung (Schritt 1.) mit einer Rate von 0,4 μL/min injiziert.</li>
	<li>Nach der Injektion die Nadel an jeder Stelle für weitere 10 Minuten aufbewahren. HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass das Intervall von zwei Injektionen nicht mehr als 20 Minuten beträgt.</li>
	<li>Nähen Sie die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Verabreichen Sie Analgetika postoperativ in Übereinstimmung mit den institutionellen Tierpflegevorschriften. HINWEIS: Die empfohlene Zeit für die Euthanasie kann entsprechend dem Zweck des Experiments bestimmt werden.</li>
</ol>4. Probenextraktion zur fokalen Demyelinisierung
HINWEIS: Einzelheiten zu diesem Schritt finden Sie im zuvor veröffentlichten Bericht14.
<ol><li>Neutraler roter Farbstoff (siehe Materialtabelle) in einer 1%igen Lösung in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS) auflösen.</li>
	<li>Stunden vor dem Opfern der Mäuse (Einzelheiten siehe vorherige Referenz10) injizieren Sie 500 μL 1% neutralen roten Farbstoff in PBS durch intraperitoneale Injektion für jede Maus.</li>
	<li>Führen Sie eine Herzperfusion12 mit 30 ml 0,1% PBS vorgekühlt bei 4 °C durch.</li>
	<li>Schneiden Sie das Gehirn mit einer Gehirnform in 1 mm (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Visualisieren Sie die mit neutralem Rot gefärbte Läsion unter dem Mikroskop und dissoziieren Sie die Läsion. HINWEIS: Entfernen Sie so viel umgebendes normales Gewebe wie möglich, um die Genauigkeit der nachfolgenden Analyse zu verbessern. Das Läsionsgewebe kann mit RT-PCR, Elektronenmikroskopie und Western-Blot-Analysen untersucht werden.</li>
</ol>5. Histologische Färbung und Immunfluoreszenz
<ol><li>Für histologische Färbung und Immunfluoreszenz 12 entfernen Sie nach der Herzperfusion (Schritt 4.3.) das Gehirn10, fixieren Sie 4% PFA über Nacht (bei 4 ° C) und dehydrieren Sie vollständig in30% Saccharose.</li>
	<li>Mit einemgefrorenen Slicer 10 bei konstanter Temperatur (−20 °C) in 20 mm koronale Hirnschnitte schneiden.</li>
	<li>Verwenden Sie die Scheiben für Luxol Fast Blue (LFB) Färbung, Immunfluoreszenz und Western Blot10.</li>
</ol>

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<li>Liu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+oligodendrocyte+differentiation+by+Olig2+and+Sox10%3A+evidence+for+reciprocal+interactions+and+dosage-dependent+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Induction of oligodendrocyte differentiation by Olig2 and Sox10: evidence for reciprocal interactions and dosage-dependent mechanisms.</a> Developmental Biology. 302 (2), 683-693 (2007).</li>
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<li>Kamma, E., Lasisi, W., Libner, C., Ng, H. S., Plemel, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+macrophages+in+progressive+multiple+sclerosis%3A+Relationship+to+neurodegeneration+and+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Central nervous system macrophages in progressive multiple sclerosis: Relationship to neurodegeneration and therapeutics.</a> Journal of Neuroinflammation. 19 (1), 45(2022).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

MS, eine chronisch demyelinisierende Erkrankung des ZNS, ist eine der häufigsten Ursachen für neurologische Funktionsstörungen bei jungen Erwachsenen20 Jahren. Klinisch erleben etwa 60%-80% der MS-Patienten den Zyklus von Rückfällen und Remissionen, bevor sie eine sekundär-progrediente MS 21,22 entwickeln, und es führt schließlich zu kumulativen Bewegungsstörungen und kognitiven Defiziten im Laufe der Zeit23. Derzei...

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung umfasst verschiedene physiologische Prozesse fast aller Organsysteme1. Im zentralen Nervensystem (ZNS) spielt diese Signalübertragung eine entscheidende Rolle bei den Erregern autoimmuner neurologischer Erkrankungen wie der Multiplen Sklerose (MS). Multiple Sklerose ist eine chronische immunvermittelte Erkrankung, die durch pathologische Demyelinisierung und Entzündungsreaktion gekennzeichnet ist und neurologische Dysfunktion und kognitive Beeinträchtigung verursacht 2,3. Nach kontinuierlichem Rezidiv und Remittieren während der frühen Erkrankung gelangen die meisten Patienten schließlich in das sekundär-progressive Stadium, das irreversible Schäden am Gehirn und eine daraus resultierende Behinderung verursachen kann4. Es wird angenommen, dass das pathologische Kennzeichen des sekundär-progressiven Verlaufs demyelinisierende Plaques sind, die durch entzündliche Läsionen verursacht werden5. Bestehende Behandlungen für MS können das Risiko eines Rückfalls signifikant reduzieren. Es gibt jedoch immer noch keine wirksame Therapie für langfristige demyelinisierende Schäden, die durch progressive MS6 verursacht werden. Daher ist ein stabil etabliertes und leicht reproduzierbares Modell erforderlich, um präklinische Therapeutika zu untersuchen, die sich auf die Degeneration der weißen Substanz konzentrieren.
Demyelinisierung und Remyelinisierung sind zwei wichtige pathologische Prozesse bei der Entwicklung von Multipler Sklerose. Demyelinisierung ist der Verlust von Myelinscheide um Axone, die durch Mikroglia mit proinflammatorischen Phänotypen7 induziert werden, und es führt zu einer langsamen Leitung von Nervenimpulsen und führt zum Verlust von Neuronen und neurologischen Störungen. Remyelinisierung ist eine endogene Reparaturreaktion, die durch Oligodendrozyten vermittelt wird, wo Störungen zu Neurodegeneration und kognitiven Beeinträchtigungen führen können8. Die Entzündungsreaktion ist entscheidend für den gesamten Prozess und beeinflusst sowohl den Grad der Myelinschädigung als auch die Reparatur.
Daher ist ein stabiles Tiermodell der persistierenden entzündlichen Demyelinisierung für die weitere Erforschung therapeutischer Strategien für MS von Bedeutung. Aufgrund der Komplexität von MS wurden verschiedene Arten von Tiermodellen etabliert, um demyelinisierende Läsionen in vivo nachzuahmen, einschließlich experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis (EAE), toxisch-demyelinisierender Modelle, Cuprizon (CPZ) und Lysophosphatidylcholin (LPC)9 . LPC ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte schnelle Schäden mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Basierend auf früheren Berichten und Forschungsergebnissen10,11 wird ein detailliertes Protokoll der Zweipunktinjektion mit einigen Modifikationen bereitgestellt. Im Allgemeinen erzeugt das klassische Einpunkt-LPC-Injektionsmodell nur eine lokale Demyelinisierung an der Injektionsstelle und wird oft von einer spontanen Remyelinisierungbegleitet 12,13. Das Zwei-Punkt-Injektions-LPC-Modell kann jedoch zeigen, dass der LPC eine Demyelinisierung im Mouse Corpus callosum direkt induzieren und eine dauerhaftere Demyelinisierung mit geringer Myelinregeneration verursachen kann.

<table><tbody><tr><td>L-&alpha;-Lysophosphatidylcholin aus Eigelb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4129-25MG</td><td></td></tr><tr><td>32 Gauge Nadel</td><td>HAMILTON</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; l Spritze</td><td>HAMILTON</td><td>80014</td><td></td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeits-Schädelbohrer</td><td>stark, Korea</td><td>Strong204</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer</td><td>Hager & Meisinger, Deutschland&nbsp;</td><td>REF 500 104 001 001 005</td><td></td></tr><tr><td>Matrx Aneathesia-Beatmungsgerät für Tiere</td><td>MIDMARK</td><td>VMR</td><td></td></tr><tr><td>Tragbares stereotaktisches Instrument für Maus</td><td>Reward</td><td>68507</td><td></td></tr><tr><td>Mikrospritze</td><td>Reward</td><td>KDS LEGATO 130</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran&nbsp;</td><td>VETEASY</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Servicebio</td><td>G1101</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer</td><td>BOSTER</td><td>PYG0021</td><td></td></tr><tr><td>LuxoL fast bLue</td><td>Servicebio</td><td>G1030-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Naht</td><td>FUSUNPHARMA</td><td>20152021225</td><td></td></tr><tr><td>Brain Mold</td><td>Reward</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Fixiermittel</td> <td>für ElektronenmikroskopServicebio</td><td>G1102-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neutralrot (C.I. 50040), für Mikroskopie Certistain</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.01376</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Myelin Basic Protein Antikörper&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>#AB5864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-GST-P pAb</td><td>MBL</td><td>#311</td><td></td></tr><tr><td>Ki-67 Monoklonaler Antikörper (SolA15)</td><td>Thermo Fisher&nbsp; </td><td>Wissenschaftlich 14-5698-95</td><td></td></tr><tr><td>monoklonaler Beta-Aktin-Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>66009-1-Ig&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Myelin Basic Protein Polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>10458-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>OLIG2 Polyklonaler Antikörper</td><td>Proteintech</td><td>13999-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488&nbsp; AffiniPure&nbsp; Esel Anti-Kaninchen&nbsp; IgG (H+L)</td><td>YEASEN</td><td>34206ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 AffiniPure Donkey Anti-Ratte IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34412ES60</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594&nbsp; AffiniPure Donkey Anti-Kaninchen IgG (H+L)&nbsp;</td><td>YEASEN</td><td>34212ES60</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Kaninchen IgG (H+L)</td><td>abklonal</td><td>AS014</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziege Anti-Maus IgG (H+L)&nbsp;</td><td>abklonale</td><td>AS003</td><td></td></tr><tr><td>adulte C57BL/6 männliche und weibliche Mäuse</td><td>Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

ein stabil etabliertes zwei-punkt-injektionsmodell für lysophosphatidylcholin-induziertes fokales demyelin-modell bei mäusen

A Stably Established Two-Point Injection of Lysophosphatidylcholine-Induced Focal Demyelination Model in Mice

Die rezeptorvermittelte Lysophospholipid-Signalgebung trägt zur Pathophysiologie verschiedener neurologischer Erkrankungen, insbesondere der Multiplen Sklerose (MS), bei. Lysophosphatidylcholin (LPC) ist ein endogenes Lysophospholipid, das mit Entzündungen assoziiert ist, und es könnte eine schnelle Schädigung mit Toxizität für Myelinlipide induzieren, was zu einer fokalen Demyelinisierung führt. Hier wird ein detailliertes Protokoll für die stereotaktische Zwei-Punkt-LPC-Injektion vorgestellt, die eine schwere Demyelinisierung direkt verursachen und die experimentelle Demyelinisierungsverletzung bei Mäusen durch chirurgische Eingriffe schnell und stabil replizieren könnte. Somit ist dieses Modell für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere MS, von hoher Relevanz und kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Auch Immunfluoreszenz- und Luxol-Schnellblaufärbungsmethoden wurden verwendet, um den zeitlichen Verlauf der Demyelinisierung im Corpus callosum von Mäusen, denen LPC injiziert wurde, darzustellen. Darüber hinaus wurde die Verhaltensmethode verwendet, um die kognitive Funktion von Mäusen nach der Modellierung zu bewerten. Insgesamt ist die Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen eine stabile und reproduzierbare Methode, um ein Demyelinisierungsmodell in Mäusen für weitere Studien zu generieren.

Die Zwei-Punkt-Injektion des LPC führte zu einer dauerhafteren Demyelinisierung LPC führt hauptsächlich zu schnellen Schäden mit Toxizität für Myelin und Spaltung der Axonintegrität15. Der Tag der Injektion wurde als Tag 0 angesehen. Die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 10-28 Tagen (10 dpi und 28 dpi) gehalten. Luxol Fast Blue (LFB) Färbung10 wurde verwendet, um den Bereich der Demyelinisierung bei Mäusen zu diesen Zeitpunkten zu bewerten. Im Zwei-Pu...

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin über einen stereotaktischen Rahmen, um ein stabiles und reproduzierbares Demyelinmodell in Mäusen zu erzeugen.

Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

Receptor-mediated lysophospholipid signaling contributes to the pathophysiology of diverse neurological diseases, especially multiple sclerosis (MS). ...

Unser Modell ist von hoher Relevanz für Demyelinisierungserkrankungen, insbesondere für Multiple Sklerose. Und es kann dazu beitragen, die damit verbundene klinisch relevante Forschung voranzutreiben. Es ist ein detailliertes Protokoll, das bei Mäusen durch einen chirurgischen Eingriff schnell und stabil eine schwere Demyelinisierung verursachen könnte.Wenn Sie diese Technik zum ersten Mal ausprobieren, seien Sie geduldig und stellen Sie sicher, dass die Koordinaten genau sind. Beginnen Sie mit dem Anschließen einer 32-Gauge-Nadel an eine 5-Mikroliter-Spritze. Nehmen Sie 5 Mikroliter LPC-Lösung zur Vorbereitung der Injektion ab.Als nächstes bestätigen Sie die Tiefe der Anästhesie der Maus durch das Fehlen eines Zehenklemmreflexes, während die Atmung glatt ist. Positionieren Sie die Maus im stereotaktischen Rahmen mit der Rückenseite nach oben und sichern Sie den Kopf mit einem Nasenkegel und einer Zahnklemme. Befestigen Sie die Maus mit beidseitigen Ohrbügeln am stereotaktischen Gerät.Stellen Sie sicher, dass die Ohrbügel eben sind und der Kopf horizontal und stabil ist. Desinfizieren Sie die Kopfhaut durch Abwischen mit Jodophor. Verwenden Sie dann ein Skalpell, um einen kleinen Schnitt auf etwa 1,5 Zentimeter entlang der Mittellinie der Kopfhaut zu schneiden, um den Schädel freizulegen.Wischen Sie die Fertigkeit mit einem Wattestäbchen ab, das in 1% Wasserstoffperoxid getaucht ist, bis Bregma, Lambda und hintere Fontanelle freigelegt sind. Legen Sie die Spritze auf den stereotaktischen Apparat. Stellen Sie die horizontale Positionierung des Kopfes des Tieres sicher und lokalisieren Sie das Corpus callosum.Sobald die Injektionsstelle bestimmt ist, notieren Sie die Koordinaten und markieren Sie sie mit einer Markierung auf dem Schädel. Bohren Sie die markierte Stelle vorsichtig mit einem Schädelbohrer ab. Achten Sie darauf, Blutungen zu vermeiden.Bewegen Sie die Nadel langsam zu den angegebenen Koordinaten. Um die Demyelinisierung des Corpus callosum zu induzieren, injizieren Sie 2 Mikroliter LPC-Lösung an jeder Injektionsstelle mit einer Rate von 0,4 Mikrolitern pro Minute. Halten Sie die Nadel nach der Injektion für weitere 10 Minuten in jeder Stelle.Vernähen Sie schließlich die Haut mit einer 4-0-Naht und warten Sie, bis das Tier innerhalb von 10 Minuten aufwacht. Das repräsentative Bild zeigt den Nachweis der Legionen der weißen Substanz mittels Luxol schneller blauer Färbung. Aus den Ergebnissen ist eine stabile Demyelinisierung des Corpus callosum 10 und 28 Tage nach der Injektion zu sehen.Die Quantifizierung des Demyelinisierungsbereichs zu verschiedenen Zeitpunkten ist hier dargestellt. Durch Immunfluoreszenzfärbung des abgebauten Myelin-Basisproteins wurde in der LPC-injizierten Gruppe 10 Tage nach der Injektion ein bemerkenswerter Anstieg des dMBP beobachtet, was einen Myelinverlust im Corpus callosum darstellt. Die Western-Blot-Analyse der Expression des Myelin-Basisproteins (MBP) zeigte einen signifikanten Verlust von MBP nach Injektion von LPC.Beta-Aktin wurde als Ladekontrolle verwendet, um den Baseline-Ausdruck zu messen. Elektronenmikroskopische Bilder bestätigen die myelinisierte Ultrastruktur im Corpus callosum der Scheingruppe und der LPC-injizierten Gruppe. GST-pi ist der Marker der Oligodendrozyten-Vorläuferzelle oder OPC, Differenzierungsreifung.Nach 10 Tagen LPC-Injektion nahm die GST-pi im Vergleich zur Scheingruppe ab. Gleichzeitig kann die Proliferationsfähigkeit von Oligodendrozyten durch das Verhältnis der Oligodendrozytenproliferation und der gesamten Oligodendrozyten-Linienzellen reflektiert werden. Das höhere Verhältnis stellt eine stärkere Proliferation von Oligodendrozyten nach 10 Tagen nach der Injektion dar.Die repräsentativen Bilder zeigen den Schwimmweg der Mäuse in jeder Gruppe, in Anwesenheit der Plattform und nach dem Entfernen der Plattform. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass das räumliche Gedächtnis von demyelinisierten Mäusen im Zweipunkt-LPC-Injektionsmodell signifikant beeinträchtigt ist. Stellen Sie bei diesem Verfahren sicher, dass die Injektionsrate genau ist, und halten Sie die Nadel für weitere 10 Minuten an jeder Stelle.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Neurowissenschaften

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Prozedur des chirurgischen Zugangs zum Sehnerv bei einem anästhesierten Tier und die präzise Abgabe von Lysolecithin, um eine fokale Demyelinisierung zu induzieren und neuropathologische Zustände für weitere Studien zu schaffen.

Induktion der lokalen Demyelinisierung im Sehnerv mit Lysolecithin

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Dieses Video zeigt die Generierung eines fokalen Demyelinisierungs-Mausmodells unter Verwendung einer Zweipunkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin (LPC). Der Schädel einer betäubten Maus wird freigelegt. Die Injektionskoordinaten werden bestimmt und ein Loch gebohrt, um LPC-Injektionen an den Zielstellen zu ermöglichen. LPC induziert die fokale Demyelinisierung von Neuronen über Entzündungen, während eine Zweipunktinjektion ihre Nachhaltigkeit gewährleistet.

Etablierung eines fokalen Demyelinisierungs-Mausmodells durch eine Zwei-Punkt-Injektion von Lysophosphatidylcholin

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion der Demyelinisierung in Rückenmarksneuronen der Maus durch Lysolecithin-Injektionen, gefolgt von einer Remyelinisierung durch Migration und Differenzierung von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen. Der Prozess beeinträchtigt die neuronale Signalübertragung und stellt sie dann allmählich wieder her.

Demyelinisierung und Remyelinisierung von Rückenmarksneuronen der Maus

Quelle: Wang, X. et. al., Osmotic Pump-based Drug-delivery for In Vivo Remyelination Research on the Central Nervous System. J. Vis. Exp. (2021)Dieses Video zeigt die Methode zur Verabreichung von Neurotherapeutika mit einer osmotischen Pumpe in einem demyelinisierten Mausmodell. Die kontrollierte Wirkstofffreisetzung fördert die Remyelinisierung, indem sie myelinproduzierende Zellen im Corpus callosum aktiviert.

 Osmotische Pump-basierte neurotherapeutische Wirkstoffabgabe in einem demyelinisierten Mausmodell

Eine neue ex vivo Herstellung zum Abbilden der Rückenmark der Maus. Dieses Protokoll ermöglicht die Zwei-Photonen-Bildgebung von lebenden zellulären Interaktionen ganzen Rückenmark.

Zwei-Photonen-Imaging von Zelluläre Dynamik in der Maus Spinal Cord

Demyelinisierende Krankheiten können bei Tieren durch fokale Anwendung von Lysolecithin in das ZNS modelliert werden. Eine einzige Injektion von Lysolecithin in das Rückenmark der Maus führt zu einer Läsion, die sich im Laufe der Zeit spontan repariert. Ziel ist es, Faktoren zu untersuchen, die an der De- und Remyelinisierung beteiligt sind, und Wirkstoffe zur Verbesserung der Reparatur zu testen.

Experimentelle Demyelinisierung und Remyelinisierung von Murine Rückenmark von Focal Injektion von Lysolecithin

Das hier vorgestellte Protokoll ermöglicht die Reproduktion einer weit verbreiteten Demyelinisierung der grauen Substanz beider kortikaler Hemisphären bei erwachsenen männlichen Dunklen Agouti-Ratten. Die Methode umfasst die intrazerebrale Implantation eines Katheters, die subklinische Immunisierung gegen Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die intrazerebrale Injektion einer entzündungsfördernden Zytokinmischung durch den implantierten Katheter.

Rattenmodell der weit verbreiteten zerebralen kortikalen Demyelinisierung, induziert durch eine intrazerebrale Injektion von entzündungsfördernden Zytokinen

Die Demyelinisierung findet bei multiplen Erkrankungen des zentralen Nervensystems statt. Eine zuverlässige In-vivo-Arzneimittelabgabetechnik ist für remyelinisierende Arzneimitteltests erforderlich. Dieses Protokoll beschreibt eine osmotische pumpbasierte Methode, die eine langfristige Arzneimittelabgabe direkt in das Gehirnparenchym ermöglicht und die Bioverfügbarkeit des Arzneimittels verbessert, mit breiter Anwendung in der Remyelinisierungsforschung.

Osmotische pumpbasierte Wirkstoffabgabe für die In-vivo-Remyelinisierungsforschung am zentralen Nervensystem

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Lernen Sie ein stereotaktisches Zwei-Punkt-Injektionsverfahren mit Lysophosphatidylcholin zur Erzeugung eines stabilen Demyelinisierungsmodells bei Mäusen. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Mechanismen multiplier Sklerose.

Ein stabil etabliertes Zwei-Punkt-Injektionsmodell für Lysophosphatidylcholin-induziertes fokales Demyelin-Modell bei Mäusen

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