Name: Großangelegter Gravitaxis-Assay von Caenorhabditis dauer-Larven (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-31T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 53 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie einen hochdurchsatzfähigen Gravitaxis-Assay mit Caenorhabditis-Dauerlarven durchführen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse von Schwerkraftreaktionen im Vergleich zu herkömmlichen Plattenassays.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Forschung wurde durch Forschungsstipendien der National Institutes of Health an JHR unterstützt (#R01 5R01HD081266 und #R01GM141493). Einige Stämme wurden vom CGC bereitgestellt, das vom NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) finanziert wird. Wir danken Pradeep Joshi (UCSB) für seinen redaktionellen Beitrag. Statistische Konsultation durch das UCSB DATALAB.

Die in der vorliegenden Studie verwendeten Stämme sind C. elegans (N2) und C. briggsae (AF16) (siehe Materialtabelle). Für jeden Assay wurde eine gemischtgeschlechtliche Population von Dauers verwendet.
1. Vorbereitung der Kammer
<ol><li>Arbeiten Sie in einem Abzug. Richten Sie den Arbeitsbereich mit einem Bunsenbrenner, 1-2 Rasierklingen, einer Zange, einer Pinzette und einer Kunststoffschneidefläche ein (siehe Materialtabelle).</li>
	<li>Sammeln Sie für jede Kammer zwei 5-ml-serologische Pipetten. Entfernen Sie den Baumwollpfropfen von einer Pipette mit einer Pinzette. Halten Sie eine Rasierklinge mit einer Zange über den Bunsenbrenner, bis sie heiß ist. Verwenden Sie die beheizte Klinge, um das konische Ende der zweiten Pipette abzuschneiden, so dass die gesamte Pipette einen einheitlichen Durchmesser hat (Abbildung 1A).</li>
	<li>Schnell arbeiten, die beiden modifizierten Pipettenenden in die Nähe der Flamme bringen und leicht schmelzen. Verbinden Sie diese Enden, indem Sie sie fest zusammendrücken, um sicherzustellen, dass die Wände beider Pipetten durchgehend sind. Wenn nach dem Fügen Lücken sichtbar sind, brechen Sie diese auseinander und wiederholen Sie diesen Schritt (Abbildung 1A,B).</li>
</ol>2. Füllen der Kammern mit Agar
<ol><li>Bereiten Sie NGM mit 4% Agar nach Standard-Wurmverfahren21 vor. Während der Agar noch geschmolzen ist, füllen Sie jede Kammer, indem Sie sie an einen serologischen Pipettierer legen und langsam die Lösung aufziehen. Verschließen Sie die Spitze mit Paraffinfolie, bevor Sie die Kammer vom Pipettor entfernen. Legen Sie die Kammer flach (parallel zur Tischplatte) zum Abkühlen. HINWEIS: Das Abdecken des Kolbens mit Frischhaltefolie (siehe Materialtabelle) nach dem Autoklavieren verhindert, dass sich Blasen in der Lösungbilden 18.<ol><li>Um Abweichungen in der Konsistenz des Agars aufgrund ungleichmäßiger Abkühlung zu minimieren, halten Sie den Pipettierer (siehe Materialtabelle) parallel zur Tischplatte, während Sie den Agar aufziehen. Legen Sie die Kammern flach auf die Tischplatte und lassen Sie den Agar aushärten, bevor Sie sich bewegen. HINWEIS: Der Agaranteil und der Medieninhalt können auf das Experiment zugeschnitten werden. 4% Agar ist steifer als die etwa 2% Konzentration, die für das Tellergießen verwendet wird, und verhindert, dass sich Würmer durch das Medium in unseren Händen wühlen. Andere Experimentatoren haben jedoch ein Grabverhalten von erwachsenen Würmern in bis zu 9% Agar18,19 beobachtet.</li>
	</ol></li>
	<li>Nach dem Abkühlen einen 3-mm-Sechskantschlüssel (oder ein anderes Metallwerkzeug gleicher Größe, siehe Materialtabelle) über einem Bunsenbrenner erhitzen. Drücken Sie es fest in die Wand jeder Kammer etwa 5 mm zu einer Seite der Mittellinie, wodurch eine kleine Öffnung im Kunststoff entsteht (Abbildung 1C). Verwenden Sie eine beheizte Klinge, um die Baumwolle und die konischen Enden der Kammer zu entfernen und diese Enden mit Paraffinfolie zu versiegeln. HINWEIS: Nach der Zubereitung muss jede Kammer innerhalb von 1 Tag verwendet oder mehrere Tage bei 4 °C aufbewahrt werden. Belichtete Öffnungen mit Paraffinfolie abdecken, um ein Austrocknen des Agars zu verhindern.</li>
</ol>3. Isolierung von Dauerlarven
<ol><li>10-15 Tage vor dem Experiment jeden Stamm auf 2-3 große NGM-Platten mit OP50-Bakterien aufteilen und mit Paraffinfolie umwickeln. Nach 10-15 Tagen muss jeder Teller mit Tausenden von Dauerlarven auf Agar, Wänden und Deckeln vollständig ausgehungert sein. HINWEIS: Stellen Sie Teller im Voraus mit einem dicken OP50-Rezept für maximale Überfüllung her (siehe Materialtabelle). Die Dauerbildung kann auch durch andere Methoden induziert werden, einschließlich der Zugabe von Pheromonen oder durch Wachstum bei höheren Temperaturen22.</li>
	<li>Sammeln Sie Würmer, indem Sie die Deckel und Platten mit M9-Puffer spülen und die Lösung in 15-ml-Zentrifugenröhrchen pipettieren. Drehen Sie bei 1.600 x g für 30-60 s bei Raumtemperatur und saugen Sie den größten Teil des M9-Puffers mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger ab.</li>
	<li>Isolieren Sie Dauers durch Behandlung mit 1% SDS, gefolgt von einem Flotationsgradienten von 30% Saccharose gemäß dem zuvor veröffentlichten Bericht20.<ol><li>Fügen Sie 7 ml 1% ige SDS-Lösung zu jedem Schneckenpellet hinzu. Lassen Sie die Würmer für 30 Minuten in SDS; Drehen Sie die Rohre während dieser Zeit kontinuierlich, um eine Belüftung zu ermöglichen. Spülen Sie 3-5x mit M9 ab, um das Reinigungsmittel zu entfernen.</li>
		<li>Als nächstes fügen Sie 5 ml M9 hinzu, gefolgt von 5 ml kalter, gefilterter 60% iger Saccharoselösung. Gründlich mischen und dann bei 1.600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugieren, um einen Trenngradienten zu erzeugen.</li>
	</ol></li>
	<li>Füllen Sie neue 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit 2 mL M9-Puffer. Zerkleinern Sie die Enden von Glaspasteur-Pipetten, um die Bohrung zu erweitern, und verwenden Sie diese Pipetten, um die oberste Schicht der Lösung (die isolierte Daumen enthält) vom Saccharosegradienten in die neuen Röhrchen zu übertragen. Spülen Sie die Dauern 3-5x mit M9 ab. HINWEIS: Es wird zu diesem Zeitpunkt Tausende von isolierten Dauern in Lösung geben. Sie können sofort verwendet oder durch Drehen in 5-7 ml M9 über Nacht belüftet werden.</li>
</ol>4. Hinzufügen von Dauern zur Kammer
<ol><li>Die Zentrifuge wird bei 1.600 x g für 5 min bei Raumtemperatur zentrifugiert und den größten Teil der M9-Lösung mit einer Pipette oder einem Vakuumsauger abgesaugt. Um die Wurmdichte zu schätzen, zählen Sie manuell die Anzahl der Würmer in drei separaten 1-μL-Tröpfchen unter einem Seziermikroskop. Verwenden Sie den Durchschnitt dieser Zählungen, um die Anzahl der Würmer pro μL zu schätzen. HINWEIS: Einige Pipettiergeräte mit kleinem Volumen können möglicherweise nicht den Boden eines 15-ml-Zentrifugenröhrchens erreichen. In diesem Fall kann ein konzentriertes Tröpfchen von Würmern zuerst auf ein Stück Paraffinfolie übertragen werden.</li>
	<li>Schneiden Sie das Ende einer 10-, 20- oder 200-μL-Pipettenspitze ab, um die Bohrung zu erweitern. Stellen Sie die Mikropipette auf ein etwas größeres Volumen als das vorgesehene Aspirationsvolumen ein. Saugen Sie ca. 1-2 μL der konzentrierten Schneckenlösung (idealerweise zwischen 100-300 Würmer) ab und lassen Sie eine kleine Menge Luft in die Spitze eindringen. HINWEIS: Eine große Anzahl von Würmern (1.000+) in einer Kammer kann die Reichweite der zurückgelegten Entfernungen aufgrund von Überfüllung erhöhen9.</li>
	<li>Drücken Sie die Pipettenspitze vorsichtig in den Agar, während Sie die Mikropipette drücken. Dadurch entsteht eine Injektionsstelle im Agar, ohne die Spitze zu verstopfen. Lassen Sie die Würmer in den Agar frei. Verwenden Sie Paraffinfolie, um die Öffnung zu versiegeln.</li>
</ol>5. Durchführung und Bewertung des Assays
HINWEIS: Gravitaxis kann unter verschiedenen Bedingungen getestet werden, die das Verhalten beeinflussen können9.
<ol><li>Um so viele Variablen wie möglich zu eliminieren, platzieren Sie die Kammern in einem dunklen Faradayschen Käfig (siehe Materialtabelle) bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Beschriften Sie jede Kammer und hängen Sie sie senkrecht in den Faradayschen Käfig (führen Sie dies mit Beschriftungsband durch). Testen Sie horizontale Steuerungen gleichzeitig, indem Sie einige Kammern flach unter den gleichen Umgebungsbedingungen verlegen. Testen Sie die experimentellen Stämme gegen vertikal orientierte N2-Würmer als Positivkontrolle. Verwenden Sie horizontal ausgerichtete Kammern mit N2-Dauern als zusätzliche Negativkontrolle. HINWEIS: Horizontale und vertikale Assays müssen in derselben Umgebung innerhalb des Labors durchgeführt werden, um die Umgebungsvariabilität zwischen den beiden Bedingungen zu minimieren. Ein großer Inkubator kann verwendet werden, um beide Faradayschen Käfige unterzubringen.</li>
	<li>Dauers beginnen sich nach einigen Stunden vom Startort aus zu zerstreuen und brauchen mehrere Stunden, um beide Enden der Kammer zu erreichen. Lassen Sie die Kammern während dieser Zeit ungestört und erzielen Sie innerhalb von 12-24 Stunden nach der Injektion. HINWEIS: Verwenden Sie kein Paralytikum (wie Natriumazid), um Würmer zu immobilisieren, die die Enden der Kammern erreicht haben. Da die Gesamtverteilung der Würmer anstelle eines Präferenzindex (wie in einem Zwei-Auswahl-Assay) gemessen wird, ist Natriumazid unnötig und kann die Ergebnisse verändern.</li>
	<li>Entfernen und ritzen Sie die Gravitaxiskammern nacheinander. Suchen Sie unter einem Seziermikroskop nach lebenden Dauern und markieren Sie ihre Positionen mit Tinte (Abbildung 1C,D). Schneiden Sie keine Würmer innerhalb von 2,5 cm zu beiden Seiten der Injektionsstelle, da diese Würmer wahrscheinlich keine Richtungspräferenz zeigen.<ol><li>Vermeiden Sie auch das Sammeln von Würmern, die tot erscheinen oder in der Flüssigkeit gefangen sind. Entsorgen Sie alle Kammern, die >50% tote oder schwimmende Würmer enthalten. HINWEIS: Sobald die Kammer aus dem Testbereich entfernt wurde, muss sie umgehend auf Genauigkeit überprüft werden. Dauers dürfen nur zwischen der Oberfläche des Agars und der Wand der Pipette sichtbar sein. Wenn ein Grabverhalten beobachtet wird, sollten Sie in zukünftigen Assays eine Erhöhung der Agarkonzentration in Betracht ziehen.</li>
	</ol></li>
	<li>Um die Ergebnisse zu quantifizieren, teilen Sie jede Hälfte der Kammer mit einem Marker in sieben 3,5 cm Abschnitte auf, beginnend 2,5 cm von der Injektionsstelle entfernt (bei einigen Pipetten 3,5 cm = 1 ml Volumen). Verwenden Sie einen manuellen Zähler (siehe Materialtabelle), um die Anzahl der in jedem Abschnitt beobachteten Würmer zu zählen. HINWEIS: Auf jeder Seite des Ursprungs sollten sieben Abschnitte vorhanden sein, die von -7 (unten) bis +7 (oben) nummeriert werden können. Diese Zahlen müssen den gleichen relativen Orten entsprechen, je nachdem, wie die Kammern gebaut wurden; Agar wird in Schritt 2 vom Ende -7 zum Ende +7 gezeichnet.</li>
</ol>

<ol><li>Peterka, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensory+integration+for+human+balance+control%5BTitle%5D)+AND+%22Handbook+of+Clinical+Neurology%22%5BJournal%5D)">Sensory integration for human balance control.</a> Handbook of Clinical Neurology. 159, 27-42 (2018).</li>
<li>Lacquaniti, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multisensory+Integration+and+Internal+Models+for+Sensing+Gravity+Effects+in+Primates%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Multisensory Integration and Internal Models for Sensing Gravity Effects in Primates.</a> BioMed Research International. 2014, 61584(2014).</li>
<li>Bostwick, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antagonistic+inhibitory+circuits+integrate+visual+and+gravitactic+behaviors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Antagonistic inhibitory circuits integrate visual and gravitactic behaviors.</a> Current Biology. 30 (4), 600-609 (2020).</li>
<li>Ntefidou, M., Richter, P., Streb, C., Lebert, M., Hader, D. -P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+light+exposure+leads+to+a+sign+change+in+gravitaxis+of+the+flagellate+Euglena+gracilis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Gravitational+Physiology%22%5BJournal%5D)">High light exposure leads to a sign change in gravitaxis of the flagellate Euglena gracilis.</a> Journal of Gravitational Physiology. 9 (1), 277-278 (2002).</li>
<li>Fedele, G., Green, E. W., Rosato, E., Kyriacou, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+electromagnetic+field+disrupts+negative+geotaxis+in+Drosophila+via+a+CRY-dependent+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">An electromagnetic field disrupts negative geotaxis in Drosophila via a CRY-dependent pathway.</a> Nature Communications. 5, 4391(2014).</li>
<li>Frézal, L., Félix, M. -A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans+outside+the+Petri+dish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">C. elegans outside the Petri dish.</a> eLife. 4, 05849(2015).</li>
<li>Lee, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+dispersal+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%2C+is+regulated+by+IL2+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">a dispersal behavior of the nematode Caenorhabditis elegans, is regulated by IL2 neurons.</a> Nature Neuroscience. 15 (1), 107-112 (2012).</li>
<li>Okumura, E., Tanaka, R., Yoshiga, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+gravitactic+behavior+of+Caenorhabditis+japonica+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Experimental+Biology%22%5BJournal%5D)">Negative gravitactic behavior of Caenorhabditis japonica dauer larvae.</a> The Journal of Experimental Biology. 216, 1470-1474 (2013).</li>
<li>Ackley, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+mechanosensory+systems+are+required+for+negative+gravitaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Parallel mechanosensory systems are required for negative gravitaxis in C. elegans.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Häder, D. -P., Hemmersbach, R. Gravitaxis in Euglena. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aH%C3%A4der%2C+D-P+%22Euglena%3A+Biochemistry%2C+Cell+and+Molecular+Biology%22">Euglena: Biochemistry, Cell and Molecular Biology</a>. Schwartzbach, S. D., Shigeoka, S. , Springer International Publishing. 237-266 (2017).</li>
<li>Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRPA+channels+distinguish+gravity+sensing+from+hearing+in+Johnston%27s+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">TRPA channels distinguish gravity sensing from hearing in Johnston's organ.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (32), 13606-13611 (2009).</li>
<li>Chen, W. -L., Ko, H., Chuang, H. -S., Raizen, D. M., Bau, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+exhibits+positive+gravitaxis%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans exhibits positive gravitaxis.</a> BMC Biology. 19 (1), 186(2021).</li>
<li>Ward, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemotaxis+by+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+Identification+of+attractants+and+analysis+of+the+response+by+use+of+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Chemotaxis by the nematode Caenorhabditis elegans: Identification of attractants and analysis of the response by use of mutants.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 70 (3), 817-821 (1973).</li>
<li>Bargmann, C. I., Hartwieg, E., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Odorant-selective+genes+and+neurons+mediate+olfaction+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Odorant-selective genes and neurons mediate olfaction in C. elegans.</a> Cell. 74 (3), 515-527 (1993).</li>
<li>Margie, O., Palmer, C., Chin-Sang, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+chemotaxis+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">elegans chemotaxis assay.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), e50069(2013).</li>
<li>Ward, A., Liu, J., Feng, Z., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sensitive+neurons+and+channels+mediate+phototaxis+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Light-sensitive neurons and channels mediate phototaxis in C. elegans.</a> Nature Neuroscience. 11 (8), 916-922 (2008).</li>
<li>Vidal-Gadea, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetosensitive+neurons+mediate+geomagnetic+orientation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Magnetosensitive neurons mediate geomagnetic orientation in Caenorhabditis elegans.</a> eLife. 4, 07493(2015).</li>
<li>Bainbridge, C., Schuler, A., Vidal-Gadea, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Method+for+the+assessment+of+neuromuscular+integrity+and+burrowing+choice+in+vermiform+animals%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Methods%22%5BJournal%5D)">Method for the assessment of neuromuscular integrity and burrowing choice in vermiform animals.</a> Journal of Neuroscience Methods. 264, 40-46 (2016).</li>
<li>Beron, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+burrowing+behavior+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans%3A+a+new+assay+for+the+study+of+neuromuscular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%2C+Brain+and+Behavior%22%5BJournal%5D)">The burrowing behavior of the nematode Caenorhabditis elegans: a new assay for the study of neuromuscular disorders.</a> Genes, Brain and Behavior. 14 (4), 357-368 (2015).</li>
<li>Ow, M. C., Hall, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+for+obtaining+large+populations+of+synchronized+Caenorhabditis+elegans+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">A Method for obtaining large populations of synchronized Caenorhabditis elegans dauer larvae.</a> Methods in Molecular Biology. , 209-219 (2015).</li>
<li>Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+introduction+to+worm+lab%3A+from+culturing+worms+to+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis.</a> Journal of Visualized Experiments. (47), e2293(2011).</li>
<li>Karp, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Working+with+dauer+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22WormBook%22%5BJournal%5D)">Working with dauer larvae.</a> WormBook. , 1-19 (2018).</li>
<li>Dinno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonparametric+pairwise+multiple+comparisons+in+independent+groups+using+Dunn%27s+test%5BTitle%5D)+AND+%22The+Stata+Journal%22%5BJournal%5D)">Nonparametric pairwise multiple comparisons in independent groups using Dunn's test.</a> The Stata Journal. 15 (1), 292-300 (2015).</li>
<li>Gray, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+sensation+and+social+feeding+mediated+by+a+C.+elegans+guanylate+cyclase+homologue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Oxygen sensation and social feeding mediated by a C. elegans guanylate cyclase homologue.</a> Nature. 430 (6997), 317-322 (2004).</li>
<li>Goodman, M. B., Sengupta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Caenorhabditis+elegans+senses+mechanical+stress%2C+temperature%2C+and+other+physical+stimuli%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">How Caenorhabditis elegans senses mechanical stress, temperature, and other physical stimuli.</a> Genetics. 212 (1), 25-51 (2019).</li>
<li>Iliff, A. J., Xu, X. Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C.+elegans%3A+a+sensible+model+for+sensory+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurogenetics%22%5BJournal%5D)">C. elegans: a sensible model for sensory biology.</a> Journal of Neurogenetics. 34 (3-4), 347-350 (2020).</li>
<li>Russell, J., Vidal-Gadea, A. G., Makay, A., Lanam, C., Pierce-Shimomura, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Humidity+sensation+requires+both+mechanosensory+and+thermosensory+pathways+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Humidity sensation requires both mechanosensory and thermosensory pathways in Caenorhabditis elegans.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (22), 8269-8274 (2014).</li>
<li>Iliff, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+nematode+C.+elegans+senses+airborne+sound%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">The nematode C. elegans senses airborne sound.</a> Neuron. 109 (22), 3633-3646 (2021).</li>
<li>Metaxakis, A., Petratou, D., Tavernarakis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multimodal+sensory+processing+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biology%22%5BJournal%5D)">Multimodal sensory processing in Caenorhabditis elegans.</a> Open Biology. 8 (6), 180049(2018).</li>
<li>Wicks, S., Rankin, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+of+mechanosensory+stimuli+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Integration of mechanosensory stimuli in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 15, 3 Pt 2 2434-2444 (1995).</li>
<li>Chen, X., Chalfie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+C.+elegans+touch+sensitivity+is+integrated+at+multiple+levels%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modulation of C. elegans touch sensitivity is integrated at multiple levels.</a> The Journal of Neuroscience. 34 (19), 6522-6536 (2014).</li>
<li>Stockand, J. D., Eaton, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stimulus+discrimination+by+the+polymodal+sensory+neuron%5BTitle%5D)+AND+%22Commun.+Integrative+Biology%22%5BJournal%5D)">Stimulus discrimination by the polymodal sensory neuron.</a> Commun. Integrative Biology. 6 (2), 23469(2013).</li>
<li>Mackowetzky, K., Yoon, K. H., Mackowetzky, E. J., Waskiewicz, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evolution+of+the+vestibular+apparatuses+of+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Anatomy%22%5BJournal%5D)">Development and evolution of the vestibular apparatuses of the inner ear.</a> Journal of Anatomy. 239 (4), 801-828 (2021).</li>
<li>Eppsteiner, R. W., Smith, R. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+disorders+of+the+vestibular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Otolaryngology+%26+Head+and+Neck+Surgery%22%5BJournal%5D)">Genetic disorders of the vestibular system.</a> Current Opinion in Otolaryngology & Head and Neck Surgery. 19 (5), 397-402 (2011).</li>
<li>Roman-Naranjo, P., Gallego-Martinez, A., Lopez Escamez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+vestibular+syndromes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics of vestibular syndromes.</a> Current Opinion in Neurology. 31 (1), 105-110 (2018).</li>
<li>Mei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+and+the+individualized+therapy+of+vestibular+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neurology%22%5BJournal%5D)">Genetics and the individualized therapy of vestibular disorders.</a> Frontiers in Neurology. 12, 633207(2021).</li>
<li>Weghorst, F. P., Cramer, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+hearing+and+balance%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">The evolution of hearing and balance.</a> eLife. 8, 44567(2019).</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine Interessenkonflikte.

Vergleich mit bisherigen Methoden Im Gegensatz zur Chemotaxis kann die Gravitaxie bei Caenorhabditis nicht zuverlässig mit einem traditionellen Agarplatten-Versuchsdesign beobachtet werden. Eine Standard-Petrischale hat einen Durchmesser von 150 mm, so dass nur 75 mm in beide Richtungen für Dauers zur Verfügung stehen, um die Gravitaxispräferenz zu demonstrieren. Obwohl die Orientierungspräferenz von C. elegans in Lösung12 untersucht werden kann, hat diese Met...

Die Anziehungskraft der Erde zu spüren, ist entscheidend für die Orientierung, Bewegung, Koordination und das Gleichgewicht vieler Organismen. Die molekularen Mechanismen und Neuroschaltkreise der Schwerkraftempfindung sind jedoch im Vergleich zu anderen Sinnen kaum verstanden. Bei Tieren interagiert die Schwerkraftempfindung mit anderen Reizen und kann von ihnen übertroffen werden, um das Verhalten zu beeinflussen. Visuelle Hinweise, propriozeptives Feedback und vestibuläre Informationen können integriert werden, um ein Gefühl des Körperbewusstseins in Bezug auf die Umgebung eines Tieres zu erzeugen 1,2. Umgekehrt kann die gravitaktische Präferenz in Gegenwart anderer Reize verändert werden 3,4,5. Daher ist gravitaktisches Verhalten ideal, um die Schwerkraftempfindung zu untersuchen und die komplexe sensorische Integration und Entscheidungsfindung des Nervensystems zu verstehen.
C. elegans ist aufgrund seines polyphenischen Lebenszyklus ein besonders nützlicher Modellorganismus für die Untersuchung der Gravitaxie. Wenn sie während der Entwicklung Stressoren wie Hitze, Überfüllung oder Nahrungsmangel ausgesetzt sind, entwickeln sich C. elegans-Larven zu Dauern, die sehr stressresistent sind6. Als Dauern zeigen Würmer charakteristische Verhaltensweisen wie die Nickung, bei denen Würmer auf ihren Schwänzen "stehen" und mit dem Kopf wedeln, was die Ausbreitung in bessere Lebensräume erleichtern kann7. Gravitaxis-Assays von C. elegans und C. japonica deuten darauf hin, dass Dauerlarven negativ gravitax sind, und dass dieses Verhalten bei Dauertieren leichter beobachtet wird als bei Erwachsenen 8,9. Das Testen der Gravitaxie in anderen Caenorhabditis-Stämmen kann natürliche Variationen im gravitaktischen Verhalten aufdecken.
Mechanismen für die Schwerkraftempfindung wurden in Euglena, Drosophila, Ciona und verschiedenen anderen Spezies unter Verwendung der Gravitaxis-Assays 3,10,11 charakterisiert. In der Zwischenzeit lieferten Gravitaxisstudien bei Caenorhabditis zunächst gemischte Ergebnisse. Eine Studie der Orientierungspräferenz von C. elegans ergab, dass sich Würmer mit gesenktem Kopf in Lösung orientieren, was auf eine positive gravitaktische Präferenz hindeutet12. Obwohl C. japonica dauers früh als negativ gravitaktisch identifiziertwurden 8, wurde dieses Verhalten erst kürzlich in C. elegans9 beschrieben. Bei der Entwicklung eines repräsentativen Gravitaxis-Assays bei Würmern ergeben sich mehrere Herausforderungen. Caenorhabditis-Stämme werden auf Agarplatten gehalten; Aus diesem Grund verwenden Verhaltensassays typischerweise Agarplatten als Teil ihres experimentellen Designs13,14,15. Der früheste berichtete Gravitaxis-Assay bei Caenorhabditis wurde durchgeführt, indem eine Platte in einem 90°-Winkel zur horizontalen Kontrollplatte8 auf die Seite gestellt wurde. Das Gravitaxisverhalten ist unter diesen Bedingungen jedoch nicht immer robust. Während erwachsene Würmer in Lösung12 auf Orientierungspräferenz untersucht werden können, kann diese Richtungspräferenz auch kontextabhängig sein, was zu unterschiedlichen Verhaltensweisen führt, wenn die Würmer eher krabbeln als schwimmen. Darüber hinaus reagiert C. elegans empfindlich auf andere Reize, einschließlich Licht und elektromagnetische Felder16,17, die ihre Reaktionen auf die Schwerkraftstören 9. Daher ist ein aktualisierter Gravitaxis-Assay, der gegen andere Umweltvariablen abschirmt, wichtig, um die Mechanismen dieses sensorischen Prozesses zu analysieren.
Im vorliegenden Protokoll wird ein Assay zur Beobachtung von Caenorhabditis gravitaxis beschrieben. Der Aufbau für diese Studie basiert zum Teil auf einer Methode, die zur Untersuchung der neuromuskulären Integrität entwickelt wurde18,19. Dauerlarven werden mit Standardverfahrenkultiviert und isoliert 20. Sie werden dann in Kammern aus zwei mit Agar gefüllten 5-ml-serologischen Pipetten injiziert. Diese Kammern können vertikal oder horizontal ausgerichtet und für 12-24 h in einem dunklen Faradayschen Käfig platziert werden, um sich vor Licht und elektromagnetischen Feldern abzuschirmen. Die Position jedes Wurms in den Kammern wird aufgezeichnet und mit den vertikalen Taxis eines Referenzstamms wie C. elegans N2 verglichen.

<table><tbody><tr><td>1% Natriumdodecylsulfatlösung</td><td></td><td></td><td>Ab Lager 10% (w/v) SDS in DI-Wasser</td></tr><tr><td>15 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>3 mm Sechskantschlüssel</td><td></td><td></td><td>Andere Metallwerkzeuge ähnlicher Größe können verwendet werden</td></tr><tr><td>4% Agar in normalem Wachstumsmedium (NGM) - 1 l</td><td></td><td></td><td>Vor dem Autoklavieren: 3 g NaCl, 40 g Agar, 2,5 g Pepton, 2 g Dextrose, 10 mL Uracil (2 mg/mL), 500 &mu; L Cholesterin (10 mg/ml), 1 mL CaCl2, 962 mL DI Wasser; Nach dem Autoklavieren: 24,5 mL Phosphatpuffer, 1 mL 1 MgSO4 (1 M), 1 mL Streptomycin (200 mg/mL)</td></tr><tr><td>5 mL Serologische Pipetten</td><td>Fisherbrand</td><td>S68228C</td><td>Polystyrol, kein Borosilikatglas</td></tr><tr><td>60% Kalte Saccharoselösung</td><td></td><td></td><td>60% Saccharose (w/v) in DI-Wasser; Sterilisierung durch Filtration (0,45 &mu; m Filter). Halten Sie bei 4 Grad; C</td></tr><tr><td>AF16 C. briggsae oder anderer experimenteller Stamm</td><td></td><td></td><td>Erhältlich beim CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr><td>Bunsenbrenner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Frischhaltefolie</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654</td><td></td></tr><tr><td>Klinische Zentrifuge</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Rasierklingen</td><td>Fisherbrand</td><td>12-640</td><td></td></tr><tr><td>Faradayscher Käfig</td><td></td><td></td><td>Kann aus Pappe und Aluminiumfolie konstruiert werden; 30" L x 6" B x 26" H oder größer</td></tr><tr><td>Tintenmarker</td><td></td><td></td><td>Sharpie oder andere Marke zum Markieren auf Kunststoff</td></tr><tr><td>Beschriftungsband</td><td>Carolina</td><td>215620</td><td></td></tr><tr><td>M9 Puffer</td><td></td><td></td><td>22 mM KH2PO4, 42 mM Na2HPO4, 86 mM NaCl</td></tr><tr><td>N2 C. elegans Stamm</td><td></td><td></td><td>Erhältlich beim CGC (Caenorhabditis Genetics Center)</td></tr><tr><td>NGM-Platten mit OP50</td><td></td><td></td><td>1,7% (w/v) Agar in NGM (siehe Beschreibung: 4% Agar in NGM). Saatgut mit OP50</td></tr><tr><td>Paraffinfilm</td><td>Bemis</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Kunststoff-Schneidebrett</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zange</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotierender Vertikalmischer</td><td>BTLab SYSTEMS</td><td>BT913</td><td>Mit 22 x 15 mL Röhrchenstange</td></tr><tr><td>Serologische Pipette</td><td>Corning</td><td>357469</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Laxco</td><td>S2103LS100</td><td></td></tr><tr><td>Zählzähler</td><td>ULINE</td><td>H-7350</td><td></td></tr><tr><td>Dickes NGM/Agar-Plattenmedium - 1 L</td><td></td><td></td><td>Siehe 4% Agar im NGM-Rezept; ersetzen Sie 40 g Agar durch eine 20 g</td>Agar-Pinzette</tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

großangelegter gravitaxis-assay von caenorhabditis dauer-larven

Large-Scale Gravitaxis Assay of Caenorhabditis Dauer Larvae

Die Schwerkraftempfindung ist ein wichtiger und relativ wenig untersuchter Prozess. Die Erfassung der Schwerkraft ermöglicht es den Tieren, in ihrer Umgebung zu navigieren und erleichtert die Bewegung. Darüber hinaus ist die Schwerkraftempfindung, die im Innenohr von Säugetieren auftritt, eng mit dem Hören verbunden - daher hat das Verständnis dieses Prozesses Auswirkungen auf die auditive und vestibuläre Forschung. Gravitaxis Assays existieren für einige Modellorganismen, einschließlich Drosophila. Einzelne Würmer wurden zuvor auf ihre Orientierungspräferenz untersucht, wenn sie sich in Lösung niederlassen. Ein zuverlässiger und robuster Assay für Caenorhabditis gravitaxis wurde jedoch nicht beschrieben. Das vorliegende Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Durchführung von Gravitaxis-Assays, mit dem Hunderte von Caenorhabditis-Stadien gleichzeitig getestet werden können. Dieser groß angelegte Langstrecken-Assay ermöglicht eine detaillierte Datenerfassung und zeigt Phänotypen auf, die bei einem Standard-Plattentest möglicherweise übersehen werden. Die Dauerbewegung entlang der vertikalen Achse wird mit horizontalen Steuerungen verglichen, um sicherzustellen, dass die Richtungsvorspannung auf die Schwerkraft zurückzuführen ist. Die gravitaktische Präferenz kann dann zwischen Stämmen oder experimentellen Bedingungen verglichen werden. Diese Methode kann molekulare, zelluläre und Umweltanforderungen für die Gravitaxie in Würmern bestimmen.

Vergleich der Gravitaxie zwischen Arten Nach dem oben beschriebenen Verfahren kann C. briggsae dauer gravitaxis mit C. elegans gravitaxis und horizontalen Kontrollen verglichen werden. Die vertikale Verteilung (kastanienbraun) von C. briggsae dauers ist zu den Oberseiten der Kammern hin verzerrt, wobei ein großer Prozentsatz von Würmern +7 erreicht (Abbildung 2A). Im Gegensatz zu horizontalen Kontrollen (Aqua), bei denen die Dauern in einer annä...

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Durchführung eines groß angelegten Gravitaxis-Assays mit Caenorhabditis dauerlarven. Dieses Protokoll ermöglicht eine bessere Detektion des Gravitaxisverhaltens im Vergleich zu einem plattenbasierten Assay.

Großangelegter Gravitaxis-Assay von Caenorhabditis dauer-Larven

Gravity sensation is an important and relatively understudied process. Sensing gravity enables animals to navigate their surroundings and facilitates ...

Mit diesem Hochdurchsatz-Assay kann ein robustes gravitaktisches Verhalten in Caenorhabditis dauerlarven beobachtet werden. Das Verhalten von Würmern wird über große Entfernungen beobachtet, verglichen mit Assays, die an einer Petrischale durchgeführt werden. Dies erhöht die Empfindlichkeit des Assays und ermöglicht eine detaillierte Datenanalyse.Die Untersuchung des Gravitaxisverhaltens kann Aufschluss darüber geben, wie die Schwerkraftempfindung bei Caenorhabditis auftritt, was für das Verständnis des vestibulären Systems von Säugetieren relevant ist. Das Erstellen der Gravitaxis-Assay-Kammern, das Isolieren von Dauers und das Injizieren der Würmer in die Kammern erfordert Übung. Sie können Zeit sparen, indem Sie die Behälter isolieren und die Kammern einen Tag im Voraus erstellen.Beginnen Sie mit der Einrichtung eines Bunsenbrenners, ein bis zwei Rasierklingen, einer Zange, einer Pinzette und einer Kunststoffschneidefläche sowie einer Abzugshaube. Um eine Kammer zu bilden, sammeln Sie zwei serologische 5-Milliliter-Pipetten und entfernen Sie mit einer Pinzette den Baumwollpfropfen von einer Pipette. Halten Sie eine Rasierklinge mit einer Zange über den Bunsenbrenner, bis sie hei

large-scale-gravitaxis-assay-of-caenorhabditis-dauer-larvae

Research

Forschung

JoVE Journal

Behavior

Verhalten

C. elegans Eiablageverhalten kann wichtige Informationen in Entwicklungs-, Reproduktions- und anatomischen Studien liefern. Dieses Video stellt die wichtigen Schritte eines Eiablageassays vor und zeigt ein Beispielexperiment, in dem ein Medikament auf Reproduktionstoxizität getestet wird.

Egg Laying Assay: Eine Methode zur Quantifizierung des Eiablageverhaltens von C. elegans

Verfahren zur quantitativen Bewertung der chemotaktischen Reaktion...

C. elegans Chemotaxis-Assay

Eine halbautomatische mikroelektromechanischen fluidischen Verfahren zur On-Demand-Fortbewegung in...

Mikrofluidik-basierten electrotaxis für On-Demand-Quantitative Analyse von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; &#39;Locomotion

Wir beschreiben Methoden, um Aspekte der amylopathies in der Schnecke zu...

A<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; Modell-System für Amylopathy Study

Die Abbildung von Verhalten und neuronaler Aktivität über lange Zeitskalen ohne Immobilisierung des Tieres ist eine Voraussetzung, um Verhalten zu verstehen. Die mikrofluidische Kammerbildgebung (AMI) von Agarose kann verwendet werden, um die neuronale Aktivität und das Verhalten für alle Lebensstadien von Caenorhabditis elegans abzubilden.

Agarose Mikrokammern für Langzeit Calcium Imaging von<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Hier beschreiben wir ein einfaches Protokoll zur Herstellung von schnell Hunderte von Nematoden Wachstum Medien Agar, 96-Well-Kultur-Platten mit einer konsistenten Anzahl von Caenorhhabditis Elegans pro Bohrloch. Diese Kulturen sind nützlich für das phänotypische Screening von ganzen Organismen. Wir konzentrieren uns hier auf dieser Kulturen zu Bildschirm Chemikalien für pro-Langlebigkeit-Effekte verwenden.

Eine einfache Methode zur chemischen Hochdurchsatz-Screening in Caenorhabditis Elegans

Wir beschreiben eine modifizierte kleine Extraktion und Farbmetrische Assays von Laktat und Pyruvat in die Nematoden C. Elegans. Bei der Verwendung von kommerziellen Assay Kits ist die technische Entwicklung ihrer Empfindlichkeit und Genauigkeit wichtig. Proteinfällung Extraktion ist der wichtigste Schritt zur quantitativen Bestimmung von intrazellulären Metaboliten.

Kleinräumige farbmetrischen Assays der intrazellulären Laktat und Pyruvat in den Fadenwurm Caenorhabditis elegans

Um Caenorhabditis elegans (C. elegans) in der Omics-Forschung zu verwenden, wird eine Methode benötigt, um große Populationen von Würmern zu generieren, bei denen eine einzelne Probe plattformübergreifend für vergleichende Analysen gemessen werden kann. Hier wird eine Methode vorgestellt, um C. elegans Populationen auf großräumigen Kulturplatten (LSCPs) zu kulturieren und das Bevölkerungswachstum zu dokumentieren.

Kultur und Assay von großflächigen Caenorhabditis elegans-Populationen im gemischten Stadium

Ein Protokoll zur Abbildung der dynamischen Mikrotubuli in vivo unter Verwendung fluoreszierend markierten Endbindungsproteins wurde vorgestellt. Wir beschrieben die Methoden zur Markierung, Abbildung und Analyse der dynamischen Mikrotubuli im neuron posterioren lateralen Mikrotubuli (PLM) von C. elegans.

Im lebenden Organismus Beurteilung der Dynamik und Orientierung von Mikrotubuli in Caenorhabditis elegans Neuronen

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

Erfahren Sie, wie Sie einen hochdurchsatzfähigen Gravitaxis-Assay mit Caenorhabditis-Dauerlarven durchführen. Diese Methode ermöglicht die detaillierte Analyse von Schwerkraftreaktionen im Vergleich zu herkömmlichen Plattenassays.

Großangelegter Gravitaxis-Assay von Caenorhabditis dauer-Larven

Weitere Videos entdecken