Name: CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie ein optimiertes Protokoll zur Ex-vivo-Kultur hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen mit CRISPR/Cas9-Gen-Editing. Diese Methode erhält die Stammzellfähigkeit und verbessert die Engraftment-Rate für Gentherapie-Anwendungen.

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Die Autoren möchten die Mitarbeiter der Durchflusszytometrie-Einrichtung und der Tiereinrichtung des CSCR würdigen. A. C. wird durch ein ICMR-SRF-Stipendium finanziert, K. V. K. wird durch ein DST-INSPIRE-Stipendium und P. B. durch ein CSIR-JRF-Stipendium finanziert. Diese Arbeit wurde vom Department of Biotechnology der indischen Regierung finanziert (Fördernummer BT/PR26901/MED/31/377/2017 und BT/PR31616/MED/31/408/2019)

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<li>Venkatesan, V., Srinivasan, S., Babu, P., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manipulation+of+developmental+gamma-globin+gene+expression%3A+An+approach+for+healing+hemoglobinopathies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Manipulation of developmental gamma-globin gene expression: An approach for healing hemoglobinopathies.</a> Molecular and Cellular Biology. 41 (1), 00253(2020).</li>
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<li>Azhagiri, M. K. K., Babu, P., Venkatesan, V., Thangavel, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homology-directed+gene-editing+approaches+for+hematopoietic+stem+and+progenitor+cell+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+%26+Therapy%22%5BJournal%5D)">Homology-directed gene-editing approaches for hematopoietic stem and progenitor cell gene therapy.</a> Stem Cell Research & Therapy. 12, 500(2021).</li>
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<li>Ravi, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+HPFH-like+mutations+by+CRISPR+base+editing+that+elevates+the+expression+of+fetal+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Identification of novel HPFH-like mutations by CRISPR base editing that elevates the expression of fetal hemoglobin.</a> eLife. 11, 65421(2020).</li>
<li>Conant, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inference+of+CRISPR+edits+from+Sanger+trace+data%5BTitle%5D)+AND+%22CRISPR+Journal%22%5BJournal%5D)">Inference of CRISPR edits from Sanger trace data.</a> CRISPR Journal. 5 (1), 123-130 (2022).</li>
<li>Shultz, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+lymphoid+and+myeloid+cell+development+in+NOD%2FLtSz-scid+IL2R%CE%B3null+mice+engrafted+with+mobilized+human+hemopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Human lymphoid and myeloid cell development in NOD/LtSz-scid IL2Rγnull mice engrafted with mobilized human hemopoietic stem cells.</a> The Journal of Immunology. 174 (10), 6477-6489 (2005).</li>
<li>McIntosh, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonirradiated+NOD%2CB6.SCID+Il2r%CE%B3-%2F-+Kit%28W41%2FW41%29+%28NBSGW%29+mice+support+multilineage+engraftment+of+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Nonirradiated NOD,B6.SCID Il2rγ-/- Kit(W41/W41) (NBSGW) mice support multilineage engraftment of human hematopoietic cells.</a> Stem Cell Reports. 4 (2), 171-180 (2015).</li>
<li>Leonard, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low-dose+busulfan+reduces+human+CD34%2B+cell+doses+required+for+engraftment+in+c-kit+mutant+immunodeficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">Low-dose busulfan reduces human CD34+ cell doses required for engraftment in c-kit mutant immunodeficient mice.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 15, 430-437 (2019).</li>
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<li>Boitano, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aryl+hydrocarbon+receptor+antagonists+promote+the+expansion+of+human+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aryl hydrocarbon receptor antagonists promote the expansion of human hematopoietic stem cells.</a> Science. 329 (5997), 1345-1348 (2010).</li>
<li>Ngom, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UM171+enhances+lentiviral+gene+transfer+and+recovery+of+primitive+human+hematopoietic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Therapy+-+Methods+%26+Clinical+Development%22%5BJournal%5D)">UM171 enhances lentiviral gene transfer and recovery of primitive human hematopoietic cells.</a> Molecular Therapy - Methods & Clinical Development. 10, 156-164 (2018).</li>
<li>Park, Y. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancement+of+proliferation+of+human+umbilical+cord+blood-derived+CD34%2B+hematopoietic+stem+cells+by+a+combination+of+hyper-interleukin-6+and+small+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry+and+Biophysics+Reports%22%5BJournal%5D)">Enhancement of proliferation of human umbilical cord blood-derived CD34+ hematopoietic stem cells by a combination of hyper-interleukin-6 and small molecules.</a> Biochemistry and Biophysics Reports. 29, 101214(2022).</li>
<li>Aiuti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentivirus-based+gene+therapy+of+hematopoietic+stem+cells+in+Wiskott-Aldrich+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Lentivirus-based gene therapy of hematopoietic stem cells in Wiskott-Aldrich syndrome.</a> Science. 341 (6148), 1233151(2013).</li>
<li>Rai, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+cell+culture+conditions+promote+ex-vivo+manipulation+and+expansion+of+primitive+hematopoietic+stem+cells+for+therapeutic+gene+editing%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Optimized cell culture conditions promote ex-vivo manipulation and expansion of primitive hematopoietic stem cells for therapeutic gene editing.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Wilkinson, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas9-AAV6+gene+correction+of+beta-globin+in+autologous+HSCs+improves+sickle+cell+disease+erythropoiesis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Cas9-AAV6 gene correction of beta-globin in autologous HSCs improves sickle cell disease erythropoiesis in mice.</a> Nature Communications. 12 (1), 1-9 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass keine konkurrierenden finanziellen Interessen bestehen.

Das erfolgreiche Ergebnis der HSPC-Gentherapie hängt hauptsächlich von der Qualität und Quantität der transplantierbaren HSZ im Transplantat ab. Die funktionellen Eigenschaften von HSZ werden jedoch während der Vorbereitungsphase von Gentherapieprodukten stark beeinträchtigt, einschließlich durch In-vitro-Kultur und Toxizität im Zusammenhang mit dem Genmanipulationsverfahren. Um diese Einschränkungen zu überwinden, haben wir ideale HSPC-Kulturbedingungen identifiziert, die die Stammheit von CD34+CD133...

Die Unzugänglichkeit zu humanen Leukozytenantigen (HLA)-passenden Spendern in allogenen Transplantationsumgebungen und die rasche Entwicklung äußerst vielseitiger und sicherer gentechnischer Werkzeuge machen die autologe hämatopoetische Stammzelltransplantation (HSCT) zu einer kurativen Behandlungsstrategie für erbliche Blutkrankheiten 1,2. Die autologe hämatopoetische Stamm- und Vorläuferzell-Gentherapie (HSPC) umfasst die Sammlung von HSPCs der Patienten, genetische Manipulation, Korrektur krankheitsverursachender Mutationen und Transplantation genkorrigierter HSPCs in den Patienten 3,4. Das erfolgreiche Ergebnis der Gentherapie hängt jedoch von der Qualität des transplantierbaren, genmodifizierten Transplantats ab. Die Genmanipulationsschritte und die Ex-vivo-Kultur von HSPCs beeinflussen die Qualität des Transplantats, indem sie die Häufigkeit von langfristigen hämatopoetischen Stammzellen (LT-HSCs) verringern, was die Infusion großer Dosen genmanipulierter HSPCs erfordert 2,5,6.
Mehrere kleine Moleküle, darunter SR1 und UM171, werden derzeit verwendet, um Nabelschnurblut-HSPCs robust zu expandieren 7,8. Für adulte HSPCs ist aufgrund der höheren Zellausbeute, die bei der Mobilisierung erzielt wird, keine robuste Expansion erforderlich. Die Beibehaltung der Stammzellen isolierter HSPCs in Ex-vivo-Kultur ist jedoch entscheidend für ihre Gentherapieanwendungen. Daher wird ein Ansatz entwickelt, der sich auf die Kulturanreicherung von hämatopoetischen Stammzellen (HSZ) konzentriert, wobei eine Kombination kleiner Moleküle verwendet wird: Resveratrol, UM729 und SR1 (RUS)7. Die optimierten HSPC-Kulturbedingungen fördern die Anreicherung von HSCs, was zu einer erhöhten Häufigkeit genmodifizierter HSCs in vivo führt und die Notwendigkeit reduziert, große Dosen von HSPCs genmanipulieren zu müssen, was kostengünstige Gentherapieansätze ermöglicht8.
Hier wird ein umfassendes Protokoll für die HSPC-Kultur beschrieben, zusammen mit der Infusion und Analyse von geneditierten Zellen in vivo.

<table><tbody><tr><td>4D-Nukleofektor&reg; X Einheit</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>AAF-1003X</td><td></td></tr><tr><td>4D-Nukleofektor&trade; X Kit ( 16-Well-Nukleocuvette&trade; Streifen)</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>V4XP-3032</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum (100X)</td><td>THERMO SCIENTIFIC 15240096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD45 APC</td><td>BD BIOSCIENCE&nbsp;</td><td>555485&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD13 PE</td><td>BD BIOSCIENCE 555394</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD19 PerCP</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 340421 <tr><td>Anti-Human-CD3 PE-Cy7</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>557749</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD90 APC</td><td>BD BIOSCIENCE 561971</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD133/1&nbsp;</td><td>Miltenyibiotec</td><td>130-113-673</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Human-CD34 PE</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 348057 <tr><td>Anti-Maus CD45.1 PerCP-Cy5</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>560580</td><td></td></tr><tr><td>Blut-Irradiator-2000</td><td>&nbsp; BRIT (Department of Biotechnology, Indien)</td><td>BI 2000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Zellkulturschale (6-Well-Platten mit Delta-Oberflächenbehandlung)</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>140675 <tr><td>CrysoStor CS10</td><td>BioLife solutions</td><td>#07952</td><td></td></tr><tr><td>Busulfan</td><td>CELON LABS (60mg/10mL)</td><td>-&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Guide-it Rekombinant Cas9</td><td>TAKARA BIO</td><td>632640</td><td></td></tr><tr><td>Cas9-eGFP</td><td>SIGMA</td><td>C120040&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zentrifugenröhrchen-15ml</td><td>CORNING</td><td>430790</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Zentrifugenröhrchen - 50ml</td><td>NUNC (THERMO SCIENTIFIC)</td><td></td><td></td></tr>339652 <tr><td>DMSO</td><td>MPBIO</td><td>219605590</td><td></td></tr><tr><td>DNAase STEMCELL</td><td>TECHNOLOGIES</td><td>6469</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung - 1X</td><td>HYCLONE</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>EasySep&trade; Humanes CD34 Positivauswahl-Kit II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>17856</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>Elektrophoresegerät</td><td>ORANGE INDIA</td><td>HDS0036</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td></td><td></td></tr> 10270106 <tr><td>Durchflusszytometer &ndash; ARIA III</td><td>BD BIOWISSENSCHAFTEN</td><td>-&NBSP;</td><td></td></tr><tr><td>FlowJo&nbsp;</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>&nbsp;-</td>Flt3-L PEPROTECH 300-19-1000 Gel-Imaging-System <td></td></tr><tr><td></td><td>CELL BIOSCIENCES</td><td>11630453</td><td></td></tr><tr><td>HighPrep DTR-Reagenz</td><td>MAGBIOGENOMICS</td><td>DT-70005</td><td></td></tr><tr><td>Human BD Fc Block</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td>553141</td><td></td></tr><tr><td>IL6</td><td>PEPROTECH</td><td>200-06-50</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> IMDM <td></td></tr><tr><td> Medien</td><td>THERMO SCIENTIFIC 12440053</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Infrarotlampe</td><td>MURPHY-Insulin</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Spritze 6mm 31G</td><td>BD BIOSCIENCE</td><td></td><td></td></tr> 324903 <tr><td>Ketamin</td><td>KETMIN 50-Loading</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Farbstoff 6X</td><td>TAKARA BIO</td><td>9156</td><td></td></tr><tr><td>Lymphoprep</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>7851</td><td></td></tr><tr><td>Mäuse-Zurückhaltung</td><td>AVANTOR</td><td>TV-150</td><td></td></tr><tr><td>Nano-Tropfen-Spektralphotometer</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>ND-2000C</td><td></td></tr><tr><td>Neubauer Zellzählkammer</td><td>ROHEM INSTRUMENTS</td><td>CC-3073</td><td></td></tr><tr><td>NOD. Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ (NSG)</td><td>Das Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:005557</td><td></td></tr><tr><td>NOD,B6. SCID Il2r&gamma; &minus;/&minus; KitW41/W41 (NBSGW)</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>RRID:IMSR_JAX:026622</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Delta 6-Well-Platte</td><td>THERMO SCIENTIFIC</td><td>140675</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Rundbodenröhrchen</td><td>BD</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>P3 Primärzelle Nukleofektionslösung</td><td>LONZA BIOSCIENCE</td><td>PBP3-02250</td><td></td></tr><tr><td>Pasteurpipette</td><td>FISHER SCIENTIFIC</td><td>13-678-20A</td><td></td></tr><tr><td>PCR-Clean-up-Kit</td><td>TAKARA BIO</td><td>740609.25</td><td></td></tr><tr><td>Maus-Pie-Käfig</td><td>FISCHER SCIENTIFIC</td><td>50-195-5140</td><td></td></tr><tr><td>Polystyrol-Rundbodenröhrchen (12 x 75 mm)</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>38007</td><td></td></tr><tr><td>Primer3</td><td>Whitehead Institute for Biomedical Research</td><td><a href="https://primer3.ut.ee/">https://primer3.ut.ee/</a></td><td></td></tr><tr><td>QuickExtract&Handel; DNA-Extraktionslösung</td><td>Lucigen</td><td>QE09050</td><td></td></tr><tr><td>Reserveratrol</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72862</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>PEPROTECH</td><td>300-07-1000</td><td></td></tr><tr><td>SFEM-II</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>9655</td><td></td></tr><tr><td>sgRNA</td><td>SYNTHEGO-</td><td>&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SPINWIN</td><td>TARSON</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StemReginin 1</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72342</td><td></td></tr><tr><td>ICE-Analysewerkzeug</td><td>SYNTHEGO</td><<td>a href="https://ice.synthego.com/">https://ice.synthego.com/</a></td><td></td></tr><tr><td>Tris-EDTA Pufferlösung (TE) 1X</td><td>SYNTHEGO</td><td>Lieferung mit gRNA&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>APPLIED BIOSYSTEMS</td><td>4375305</td><td></td></tr><tr><td>TPO</td><td>PEPROTECH</td><td>300-18-1000</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>HIMEDIA LABS</td><td>TCL046</td><td></td></tr><tr><td>UM171</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72914</td><td></td></tr><tr><td>UM729</td><td>STEMCELL TECHNOLOGIES</td><td>72332</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin</td><td>XYLAXIN - INDIAN IMMUNOLOGICALS LIMITED</td><td>-</td><td></td></tr></tbody></table>

crispr/cas9-gen-editing von hämatopoetischen stamm- und vorläuferzellen für gentherapeutische anwendungen

CRISPR/Cas9 Gene Editing of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells for Gene Therapy Applications

CRISPR/Cas9 ist ein äußerst vielseitiges und effizientes Gen-Editing-Tool, das häufig zur Korrektur verschiedener genetischer Mutationen eingesetzt wird. Die Machbarkeit der Genmanipulation von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) in vitro macht HSPCs zu einer idealen Zielzelle für die Gentherapie. HSPCs verlieren jedoch in Ex-vivo-Kultur moderat ihr Engraftment- und Multilineage-Repopulationspotenzial. In der vorliegenden Studie werden ideale Kulturbedingungen beschrieben, die das HSPC-Engraftment verbessern und eine erhöhte Anzahl genmodifizierter Zellen in vivo erzeugen. Der aktuelle Bericht zeigt optimierte In-vitro-Kulturbedingungen , einschließlich der Art der Kulturmedien, der einzigartigen Ergänzung mit niedermolekularen Cocktails, der Zytokinkonzentration, der Zellkulturplatten und der Kulturdichte. Darüber hinaus werden ein optimiertes HSPC-Gen-Editing-Verfahren sowie die Validierung der Gen-Editing-Ereignisse bereitgestellt. Für die In-vivo-Validierung werden die geneditierte HSPC-Infusion und die Post-Engraftment-Analyse bei Mausempfängern angezeigt. Die Ergebnisse zeigten, dass das Kultursystem die Häufigkeit funktioneller HSZ in vitro erhöhte, was zu einer robusten Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo führte.

Die vorliegende Studie identifiziert ideale HSPC-Kulturbedingungen, die die Retention von CD34+CD133+CD90+ HSCs in Ex-vivo-Kultur erleichtern. Um die Kulturanreicherung von HSZ zusammen mit der verbesserten Erzeugung genmodifizierter HSCs zu demonstrieren, werden die optimierten Verfahren für PBMNC-Isolierung, CD34+-Zellreinigung, Kultur, Geneditierung, Transplantation, Charakterisierung von Engraftment und genmodifizierte Zellen in vivo bereitgestellt (<stron...

Das vorliegende Protokoll beschreibt ein optimiertes hämatopoetisches Stamm- und Vorläuferzell-Kulturverfahren (HSPC) für die robuste Anpflanzung von geneditierten Zellen in vivo.

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

CRISPR/Cas9 is a highly versatile and efficient gene-editing tool adopted widely to correct various genetic mutations. The feasibility of gene ...

Ex-vivo-Kultur kann das Wiederbesiedlungspotenzial von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen behindern. Unser Protokoll bewahrt die Stammhaut während der Kultur und verbessert so die Häufigkeit von genmodifizierten Zellen in vivo. Die Gentherapie mit hämatopoetischen Stammzellen wird derzeit bei monogenen Erkrankungen und Infektionskrankheiten wie HIV eingesetzt.Das HSPC-Gentherapieprotokoll stützt sich stark auf Ex-vivo-Kultur. Unser Protokoll sollte mit jedem Verfahren kompatibel sein, das Ex-vivo-Kultur verwendet. Dieses Protokoll wird Vigneshwaran Venkatesan, Doktorand aus meinem Labor, demonstrieren.Nach der Isolierung der HSPCs kultivieren Sie sie in Stammzellkulturmedien, die Zytokine und kleine Moleküle Resveratrol, UM729 und StemRegenin1 enthalten. Stellen Sie den ThermoMixer vor der Genbearbeitung auf 37 Grad Celsius, um die Guide-RNA wiederherzustellen, und heizen Sie dann den TE-Puffer auf 37 Grad Celsius für 10 Minuten vor. Zentrifugieren Sie das synthetische chemisch modifizierte sgRNA-Fläschchen bei 11.000 mal g für 1 Minute bei 4 Grad Celsius und fügen Sie 15 Mikroliter TE-Puffer in die Durchstechflasche mit 1,5 Nanomolar lyophilisierter sgRNA und mischen Sie durch sanftes Schwenken, um eine Endkonzentration von 100 Picomolar pro Mikroliter zu erhalten.Inkubieren Sie die Durchstechflasche im ThermoMixer mit minimalem Schütteln bei 37 Grad Celsius für 30 bis 40 Sekunden. Klopfen Sie vorsichtig auf die Durchstechflasche an den Seiten und drehen Sie die Durchstechflasche, um 15 Mikroliter sgRNA zu sammeln. Stellen Sie 1-Mikroliter-Aliquots her und lagern Sie sie bei minus 80 Grad Celsius für bis zu 1 Jahr.Für die Nukleofektion Pellet 2 mal 10 zu den 5. Zellen durch Zentrifugieren bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Sobald der Überstand verworfen ist, resuspendieren Sie das Pellet in 20 Mikrolitern des Puffers. Mischen Sie die Zellsuspension vorsichtig mit dem vorbereiteten RNP-Komplex, um Luftblasen zu vermeiden.Übertragen Sie nun die Suspension auf den handelsüblichen Nukleofektionsstreifen und elektropolieren Sie die Zellen mit dem 4D-Nucleofector durch Auswahl des Pulscodes DZ-100. Fügen Sie den elektropolierten Zellen im Nukleofektionsstreifen 100 Mikroliter vorinkubiertes Kulturmedium hinzu und lassen Sie die Zellen 10 Minuten bei Raumtemperatur ungestört. Am Ende der Inkubation wird der Inhalt gemäß den experimentellen Anforderungen auf die Kulturplatte überführt.Legen Sie die NSG-Mäuse 6 bis 8 Stunden vor der HSPC-Transplantation in die Kuchenkäfige. Bestrahlen Sie die Mäuse bei 3,5 Grau mit einem handelsüblichen Bestrahlungsgerät. Für NBSGW, Vorbedingung 6 bis 8 Wochen alte männliche und weibliche Mäuse durch intraperitoneale Injektion von Busulfan in einer Dosis von 12,5 Milligramm pro Kilogramm Körpergewicht 48 Stunden vor HSPC-Transplantation.Zum Aufgießen von 1 Maus 6 mal 10 bis zur 5. Zelle in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen durch Zentrifugieren bei 200 mal g für 5 Minuten pelletieren. bei Raumtemperatur. Pipetten Sie den Überstand vorsichtig heraus, ohne das Pellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 100 Mikroliter PBS.Legen Sie die vorkonditionierten NSG- oder NBSGW-Mäuse in das Maus-Resieb und infundieren Sie die HSPCs durch Schwanzveneninjektion. Halten Sie den Mausschwanz und drücken Sie vorsichtig auf den Stecker, um die Maus zurückzuhalten. Wischen Sie den Mausschwanz vorsichtig mit 70% Ethanol ab.Mit einer 31-Gauge-Insulinspritze 100 Mikroliter der Zellsuspension absaugen. Richten Sie nun das Licht der Infrarotlampe für 30 bis 40 Sekunden auf den Schwanz und bedecken Sie den Körperbereich der Maus mit Falten aus Seidenpapier. Um den Schwanz mit der Spritze in der Hobelachse zu halten, heben Sie ihn mit dem linken Zeigefinger an.Führen Sie den abgeschrägten Teil der Nadel vorsichtig in einem Winkel von 20 Grad in die linke oder rechte Schwanzvene ein. Drücken Sie den Kolben, um die Zellsuspension in die Vene zu infundieren, üben Sie sanften Druck in der Nähe der durchbohrten Region mit Seidenpapier aus und ziehen Sie die Nadel heraus. Nach der Narkose positionieren Sie das Tier in ventraler Liege und schrubben Sie die Mäuse vorsichtig, um das Auge zu öffnen, so dass die Augenkugel leicht hervorstehen kann.Führen Sie die Weidepipette vorsichtig in einem Winkel von 30 bis 45 Grad in den medialen Knoten des Auges unter der Nickhaut ein. Nachdem Sie die Pasteur-Pipette in die richtige Position gebracht haben, üben Sie leichten Druck auf das Röhrchen aus und beginnen Sie, das Rohr sanft zu drehen. Nachdem Sie 50 bis 80 Mikroliter peripheres Blut gesammelt haben, ziehen Sie die Pipette vorsichtig aus dem medialen Canthus des Auges.Machen Sie nach der Euthanasierung einen vertikalen Schnitt 1 Zentimeter über der Harnröhre und erstrecken Sie sich bis 1 Zentimeter unter das Zwerchfell. Schneiden Sie horizontal an den Ecken des eingeschnittenen Bereichs, um die Bauchregion zu öffnen. Nachdem Sie den Femur und die Tibia seziert haben, entfernen Sie mit einer Schere die Weichteile, die am Femur und der Tibia befestigt sind, und schrubben Sie die Knochen vorsichtig mit einem Seidenpapier.Verwenden Sie ein Skalpell, um ein kleines Loch mit einem Durchmesser von nicht mehr als 0,2 Zentimetern am Boden eines 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchens zu machen. Entfernen Sie die proximalen Enden der Knochen mit einem Skalpell und legen Sie die Knochen mit der geschnittenen Seite zum Loch des 0,5-Milliliter-Mikrozentrifugationsröhrchens. Legen Sie nun das 0,5-Milliliter-Röhrchen mit den Knochen in das 1,5-Milliliter-Röhrchen, das 100 Mikroliter steriles PBS enthält.Schließen Sie den Deckel, drehen Sie die Röhrchen bei 200 mal g für 3 Minuten unter sterilen Bedingungen bei Raumtemperatur und entsorgen Sie die 0,5-Milliliter-Röhrchen mit Knochen in einer leeren Markhöhle. In das 1,5-Milliliter-Reaktionsröhrchen mit Knochenmark 1 Milliliter PBS geben und dann mit einer 1-Milliliter-Pipette die Zellen 10 Mal vorsichtig resuspendieren. 1 Milliliter der Zellsuspension wird in ein 15-Milliliter-Röhrchen mit 9 Milliliter RBC-Lysepuffer überführt.Inkubieren Sie die Zellen für 7 Minuten in Eis, indem Sie die Röhre alle zwei Minuten vorsichtig umdrehen. Nach der Inkubation zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur und wiederholen Sie das Waschen, bis ein klares hellweißes Pellet beobachtet wird. Die Häufigkeit lebender Zellen und CD34-positiver, CD90-positiver Zellen hat in der RUS-Gruppe nach 48 Stunden Nukleofektion zugenommen.Nach 72 Stunden nahmen der Prozentsatz und die Häufigkeit von Indel in der mit RUS behandelten Gruppe im Vergleich zur DMSO-behandelten Gruppe zu, was auf eine Zunahme der Geneditierung hindeutet. Die absolute Anzahl der CD34-positiven, CD90-positiven Zellen und der gesamten kernhaltigen Zellen ist 48 Stunden nach der Bearbeitung signifikant höher. Die Durchflusszytometrie-Analyse menschlicher CD45-positiver Zellen in den NSG-Mäusen zeigte eine erhöhte Anpflanzung unter den Kulturbedingungen.Die Analyse der Gen-Editing-Häufigkeit in den BM-Zellen der Maus zeigte eine erhöhte Anpflanzung von geneditierten HSPCs unter RUS-ergänzten Kulturbedingungen. Die Kultivierung der HSPCs bei einem Zusammenfluss von 200.000 Zellen pro ml ist entscheidend für die Verbesserung der funktionellen Stammzellen. Die Amplifikation der Nabelschnurblut-Stammzellen und der iSPC-abgeleiteten Stammzellen sind die neuen Bereiche, in denen dieses Protokoll getestet wird.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Dieses Video zeigt einen Assay zur Durchführung von Gen-Editierung in menschlichen T-Zellen mit der CRISPR-Cas9-Technologie. Eine Mischung aus primären CD4+- und CD8+-T-Zellen wird mit einem CRISPR-Cas9-Ribonukleoprotein-Komplex kombiniert, der auf spezifische Gene für den Knockout abzielt. Bei der Elektroporation leitet die sgRNA Cas9 zur Ziel-DNA-Sequenz und erzeugt so präzise Schnitte. Diese Schnitte werden dann durch den nicht-homologen Endverbindungsmechanismus der Zelle repariert, was zu...

Eine CRISPR-Cas9-Technik zur Gen-Editierung in T-Zellen

Gezielte gen bearbeiten CRISPR/Cas9 hat das Verständnis der biologischen Funktionen der Gene erheblich erleichtert. Hier nutzen wir die CRISPR/Cas9-Methodik zu Modell Calreticulin Mutationen in hämatopoetischen Zellen Zytokin-abhängige um ihre onkogenen Aktivität zu studieren.

Mit CRISPR/Cas9 gen untersuchen die Onkogene Aktivität des mutierten Calreticulin in Cytokine abhängigen hämatopoetischen Zellen bearbeiten

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Hier wird ein Protokoll zur effizienten CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelten Genbearbeitung in Säugetierzellen mittels Röhrenelektroporation vorgestellt.

CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein-vermittelte präzise Genbearbeitung durch Tube Electroporation

Hier stellen wir ein Protokoll zur genetischen Bearbeitung von CAR-T-Zellen über ein CRISPR/Cas9-System vor.

Verwenden von CRISPR/Cas9 zum Knock Out von GM-CSF in CAR-T-Zellen

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Hier beschreiben wir eine detaillierte Methode zur nahtlosen Genbearbeitung in humanen pluripotenten Stammzellen unter Verwendung eines piggyBac-basierten Donorplasmids und der Cas9-Nickase-Mutante. Zwei Punktmutationen wurden in Exon 8 des Hepatozyten-Kernfaktor-4-alpha-Locus (HNF4α) in humanen embryonalen Stammzellen (hES-Zellen) eingeführt.

Einführung von Punktmutationen in humane pluripotente Stammzellen durch nahtlose Genom-Editierung

Hier stellen wir ein Protokoll für die Genbearbeitung in primären menschlichen T-Zellen vor, das die CRISPR Cas-Technologie verwendet, um CAR-T-Zellen zu modifizieren.

Herstellung von humanen CRISPR-engineered CAR-T Zellen

Neue Strategien zur getreuen Modellierung somatischer Mutationen in hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPCs) sind notwendig, um die hämatopoetische Stammzellbiologie und hämatologische Malignome besser zu untersuchen. Hier wird ein Protokoll zur Modellierung heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in HSPCs durch Kombination der Verwendung von CRISPR/Cas9 und dualer rAAV-Donortransduktion beschrieben.

Entwicklung onkogener heterozygoter Gain-of-Function-Mutationen in humanen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das die CRISPR/Cas9-Technologie mit dem Cell Counting Kit-8 (CCK-8) Assay integriert, um Kandidatengene zu identifizieren, die für die abnormale proliferative Kapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen entscheidend sind.

Bewertung abnormer wachstumsbezogener Gene von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen durch Kombination der CRISPR/Cas9-Technologie mit der Zellzählung

Erfahren Sie ein optimiertes Protokoll zur Ex-vivo-Kultur hämatopoetischer Stamm- und Vorläuferzellen mit CRISPR/Cas9-Gen-Editing. Diese Methode erhält die Stammzellfähigkeit und verbessert die Engraftment-Rate für Gentherapie-Anwendungen.

CRISPR/Cas9-Gen-Editing von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen für gentherapeutische Anwendungen

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