Visualisierung der Dynamik der Kopplungsdynamik von Aktin und Mikrotubuli in vitro durch Total-Internal-Reflection-Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRF)

Trotz vieler Koordinationsbeispiele untersuchen die meisten Studien die Aktin- oder Mikrotubuliproteine einzeln. Diese Methode ermöglicht die Visualisierung beider dynamischer Polymere in einer einzigen Reaktion. Diese Technik ermöglicht es dem Benutzer, verschiedene regulatorische Proteine auf emergente Eigenschaften zu untersuchen, die nur mit dynamischen Versionen von Aktin und Mikrotubuli beobachtet werden können.

Diese Technik kann um Lipide oder Extrakte erweitert werden, um dem Aufbau einer synthetischen Zelle näher zu kommen. Beginnen Sie mit dem Auftauen von Aliquoten von PEG-Silan- und Biotin-PEG-Silanpulvern und dem Auflösen der PEG-Pulver in 80% Ethanol, um die Beschichtungsmateriallösungen von 10 Milligramm pro Milliliter mPEG-Silan und zwei bis vier Milligramm pro Milliliter Biotin-PEG-Silan zu erzeugen. Entfernen Sie den sauberen Deckbeleg mit einer Pinzette aus der Ethanollagerung.

Mit Stickstoffgas trocknen und in einer sauberen Petrischale aufbewahren. Beschichten Sie die Deckgläser mit 100 Mikrolitern Beschichtungslösung und inkubieren Sie sie bei 70 Grad Celsius für mindestens 18 Stunden oder bis zum Gebrauch. Schneiden Sie 12 Streifen doppelseitiges Klebeband auf eine Länge von 24 Millimetern.

Entfernen Sie eine Seite der Bandrückseite und befestigen Sie Bandstücke neben den sechs Rillen, die in einer sauberen Abbildungskammer vorhanden sind. Entfernen Sie das zweite Stück Bandrückseite, um die klebrige Seite des Bandes entlang jeder Kammernut freizulegen, und legen Sie das Kammerband mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Mischen Sie Epoxidharz- und Härterlösungen eins zu eins in einem kleinen Wägeboot und verwenden Sie eine P1000-Spitze, um einen Tropfen gemischtes Epoxidharz zwischen die Bandstreifen am Ende jeder Bildgebungskammerrille zu legen.

Legen Sie dann die Kammer, das Klebeband oder das Epoxid mit der Seite nach oben auf eine saubere Oberfläche. Entfernen Sie einen beschichteten Deckschlitten aus dem 70 Grad Celsius Inkubator und spülen Sie die beschichteten und unbeschichteten Oberflächen der Deckgläser sechsmal mit doppelt destilliertem Wasser ab. Mit gefiltertem Stickstoffgas trocknen und dann mit der Deckglasbeschichtung seitlich zum Band hin an der Bildkammer befestigen.

Verwenden Sie eine P200- oder P1000-Pipettenspitze, um Druck auf die verklebte Glasschnittstelle auszuüben, um eine gute Abdichtung zwischen dem Klebeband und dem Deckglas zu gewährleisten. Bebrüten Sie die montierten Kammern bei Raumtemperatur für mindestens fünf bis 10 Minuten, damit das Epoxidharz die Kammerschächte vor dem Gebrauch vollständig abdichten kann. Perfusionskammern verfallen innerhalb von 12 bis 18 Stunden nach der Montage.

Verwenden Sie eine Perfusionspumpe und tauschen Sie nacheinander Konditionierungslösungen in der Perfusionskammer aus, indem Sie 50 Mikroliter 1% BSA fließen lassen, um die Bildgebungskammer zu primieren. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir für die Köderverriegelung. Dann fließen 50 Mikroliter 0,005 Milligramm pro Milliliter Streptavidin und inkubieren für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir. Fließen Sie 50 Mikroliter 1% BSA, um die unspezifische Bindung zu blockieren und 10 bis 30 Sekunden lang zu inkubieren. Entfernen Sie den überschüssigen Puffer aus dem Reservoir.

Als nächstes fließen 50 Mikroliter warmer 1x TIRF-Puffer und dann 50 Mikroliter stabilisierte und 50% biotinylierte Mikrotubuli-Samen, die in 1x TIRF-Puffer verdünnt sind. Stellen Sie die Bühne oder das objektive Heizgerät so ein, dass 35 bis 37 Grad Celsius Temperatur für 30 Minuten aufrechterhalten werden, bevor die erste biochemische Reaktion abgebildet wird. Stellen Sie dann das Erfassungsintervall für 15 bis 20 Minuten auf alle fünf Sekunden ein.

Als nächstes setzen Sie 488 und 647 Laserbelichtungen auf 50 bis 100 Millisekunden bei 5% bis 10% Leistung, indem Sie zuerst die Polymerisationsreaktion anpassen, um die Aktinfilamentanordnung zu initiieren. Erfassen Sie die Bilder auf 647 Nanometern und nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor. Stellen Sie dann die Polymerisationsreaktion in einer zweiten konditionierten Perfusionsmulation ein, um die Mikrotubuli-Anordnung zu initiieren.

Visualisieren Sie bei 488 Nanometern und nehmen Sie entsprechende Anpassungen vor. Kombinieren Sie drei Mikroliter 10 Mikromolar 488 Tubulin mit dem 7,2 Mikroliter Aliquot von 100 Mikromolar fluoreszierend unmarkiertem Tubulin nicht mehr als 15 Minuten vor der Verwendung. Kombinieren Sie dann drei Mikroliter verdünntes Biotin-bezogenes Aktin in geeigneten Volumina von fluoreszierend unmarkiertem und markiertem Aktin, so dass die endgültige Mischung 12,5 Mikromolar Gesamtaktin mit 10% bis 30% fluoreszierender Markierung ist.

Bereiten Sie die Zytoskelettmischung vor, indem Sie zwei Mikroliter der 12,5-Mikromolaren Aktinmischung mit der Tubulin-Stammmischung nicht mehr als 15 Minuten vor der Bildgebung kombinieren. Bis zum Gebrauch auf Eis lagern. Bereiten Sie die Proteinreaktionsmischung vor, indem Sie alle anderen experimentellen Komponenten und Proteine kombinieren, einschließlich 2x TIRF-Puffer, Anti-Bleichmittel, Nukleotide, Puffer und akzessorische Proteine.

Inkubieren Sie die Zytoskelettmischung und die Proteinreaktionsmischung separat bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Sekunden. Um die Reaktion einzuleiten, fügen Sie den Inhalt der Proteinreaktionsmischung in die Zytoskelettmischung ein und mischen Sie sie. Fließen Sie 50 Mikroliter der Reaktionsmischung mit 1x TIRF-Puffer ergänzt mit 15 mikromolaren freien Tubulin, einem millimolaren GTP, 0,5 mikromolaren Aktinmonomeren und entsprechenden Mengen an Pufferkontrollen in die Perfusionskammer.

Nehmen Sie einen Zeitrafferfilm mit einer Mikroskopsoftware auf, um alle fünf Sekunden für 15 bis 20 Minuten zu erfassen. Konditionieren Sie eine neue Perfusionsbohrung und ersetzen Sie das Puffervolumen durch das regulatorische Protein von Interesse und Pufferkontrollen. Erwerben Sie, um die regulatorischen Proteine für emergente Actin-Mikrotubuli-Funktionen zu bewerten.

Beispielmessungen von Mikrotubuli und Aktinfilamentdynamik sind in diesen Bildern gezeigt. Die durchschnittliche Zeitprojektion des Tubulinkanals visualisiert effizient die Gesamtlängen der Mikrotubuli für die Linienscans, die zur Generierung der Kymograph-Diagramme verwendet werden. Schwarze gepunktete Linien entsprechen den beiden Beispielkymographen der dynamischen Mikrotubuli.

Die Wachstums- und Demontagephasen von Mikrotubuli sind auf jedem Kymographen dargestellt. Zwei Beispiele für Zeitraffer-Bildmontagen, die einzelne Aktinfilamente zeigen, die aktiv polymerisieren, werden hier gezeigt. Die Dehnungsraten werden als die Steigung der Plots der Länge der Aktinfilamente im Laufe der Zeit pro mikromolarem Aktin berechnet.

Daher muss ein Korrekturfaktor von zwei auf 0,5 mikromolare Aktinreaktionen angewendet werden, um die Raten zu vergleichen, die typischerweise bei der einen mikromolaren Aktinkonzentration bestimmt werden. Beispiele aus fünf Filamenten werden hier gezeigt. Totale interne Reflexionsfluoreszenz oder TIRF-Bilder der dynamischen Mikrotubuli in Aktinfilamenten, die in Abwesenheit oder Anwesenheit von 250 nanomolaren Tau polymerisieren, sind hier gezeigt.

Blau gepunktete Linien und Pfeile markieren Verschleiß Eine Linie wurde für die Linienscan-Diagramme entsprechend jeder Bedingung gezeichnet. Überlappungen zwischen den Mikrotubuli in den Aktinregionen können zu einem festgelegten Zeitpunkt pro Gebiet bewertet werden. Zytoskelettproteine, insbesondere Aktin, Mikrotubuli und ihre Regulatoren reagieren sehr empfindlich auf Gefrier- / Tauzyklen.

Für Konsistenz und Erfolg verwenden Sie hochreine und richtig gelagerte Proteine.