Name: Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: Erfahren Sie einen Endothelzell-Transzytose-Assay zur Bewertung der inneren Blut-Retina-Barriere-Permeabilität mit HRMECs. Diese tierfreie Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Regulatoren der endothelialen Permeabilität.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde durch NIH-Zuschüsse (R01 EY028100, EY024963 und EY031765) an JC unterstützt. ZW wurde durch ein Karriere-Starter-Stipendium der Knights Templar Eye Foundation unterstützt.

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am Boston Children's Hospital zur Erzeugung von lichtmikroskopischen und EM-Bildern genehmigt (Abbildung 3). Protokolle für die In-vivo-Studien können von Wang et al.24 bezogen werden. Alle Experimente mit humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs) wurden vom Institutional Biosafety Committee (IBC) am Boston Children's Hospital genehmigt.
1. Herstellung von Reagenzien
<ol><li>Lösung zur Beschichtung von Gewebekulturschalen: Bereiten Sie 0,1% ige Gelatinelösung vor, indem Sie 1 ml Gelatine-Stammlösung (40%-50%) in 500 ml steriler Gewebekultur 1x PBS (pH = 7,4) auflösen. Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22-μm-Filter. 0,1%ige Gelatinelösung bei 2-8°C lagern. Es kann auf unbestimmte Zeit in sterilem Zustand bei der genannten Temperatur gelagert werden.</li>
	<li>Wachstumsmedium: Bereiten Sie 500 ml Endothelzellwachstums-Komplettmedium (EGM) vor, indem Sie EGM-Ergänzungen gemäß den Anweisungen des Herstellers (Table of Materials) in das Endothelzellwachstums-Basalmedium (EBM) auflösen. Aliquotes Wachstumsmedium in 50-ml-Röhrchen geben und die Röhrchen bei 4 °C lagern. Die Haltbarkeit des Wachstumsmediums beträgt 12 Monate bei 4 °C.</li>
	<li>Trypsinlösung: Für 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung aliquot aus der Durchstechflasche in 50 ml Röhrchen geben und bei 4 °C (bis zu 2 Wochen) oder −20 °C (bis zu 24 Monaten) lagern.</li>
</ol>2. Kultivierung von HRMECs
<ol><li>Erste Zellkultur<ol><li>Zellkultur Petrischalen (100 mm Durchmesser x 20 mm Höhe) mit 5 ml 0,1% Gelatinelösung unter einer Laminar-Flow-Haube beschichten und 30 min bei Raumtemperatur (RT) ungestört in der Haube aufbewahren, um eine gleichmäßige Beschichtung zu erhalten. HINWEIS: Die Gelatinebeschichtung von Schalen verbessert die Zellanhaftung. Alternativ können auch mit Gelatine überzogene T75-Kulturkolben verwendet werden.</li>
		<li>Bevor Sie die Zellen säen, saugen Sie die Gelatinelösung mit einer Vakuumpumpe ab. Der Vakuumdruck des verwendeten Absaugers betrug bis zu 724 mmHg. HINWEIS: Die Aspiration muss unmittelbar vor der Aussaat der Zellen erfolgen, um ein Austrocknen der Beschichtungslösung zu verhindern.</li>
		<li>Eine gefrorene Durchstechflasche mit HRMECs (aus der Lagerung in flüssigem Stickstoff) entweder in einem Wasserbad bei 37 °C oder durch Zugabe eines warmen Wachstumsmediums in die Durchstechflasche auftauen. Nach dem Auftauen die Zellsuspension in 9 ml Wachstumsmedium überführen (unter der Annahme, dass die aufgetaute Durchstechflasche mit HRMECs 1 ml beträgt). HINWEIS: Die HRMECs wurden kommerziell erworben (Table of Materials). Das den Zellen zugesetzte Wachstumsmedium sollte vor Gebrauch immer auf 37 °C vorgewärmt werden.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT und saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, um zu vermeiden, dass das Zellpellet entfernt wird.</li>
		<li>Resuspendieren Sie das Zellpellet in 10 ml Wachstumsmedium und geben Sie die resultierende Suspension auf eine mit Gelatine überzogene Petrischale. Halten Sie die Zellen im Inkubator bei 37 °C und 5% CO2. Typischerweise sind HRMECs nach 72 h zu 70% -80% konfluent. HINWEIS: Das Wachstumsmedium wird jeden zweiten Tag gewechselt.</li>
	</ol></li>
	<li>Subkultur von HRMECs auf durchlässigen Membraneinsätzen<ol><li>Bereiten Sie Zellkulturfiltereinsätze (6,5-mm-Einsätze mit 0,4 μm porengroßer Polycarbonatmembran, platziert in einer 24-Well-Platte) für die Aussaat von HRMECs vor, indem Sie jeden Einsatz (apikale Kammer) mit 200 μL 0,1% Gelatinelösung für 30 Minuten unter einer Laminar-Flow-Haube beschichten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Unterseite des Filtereinsatzes bedeckt. HINWEIS: Jede Vertiefung hat eine apikale und basolaterale Kammer, die durch eine poröse Membran getrennt ist.</li>
		<li>Nehmen Sie die Petrischale mit kultivierten HRMECs (Schritt 2.1.5.) aus dem Inkubator und saugen Sie die Wachstumsmedien ab. Spülen Sie die Zellen vorsichtig 2x mit 10 ml 1x PBS unter einer Laminar-Flow-Haube, um potenzielle schwimmende/tote Zellen loszuwerden.</li>
		<li>Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,5-1 ml 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und legen Sie die Petrischale für 5 min in den Inkubator (37 °C und 5%CO2).</li>
		<li>Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 4,5-9 ml Wachstumsmedien und überführen Sie die Zellsuspension mit einer 10-ml-Pipette in ein 15-ml-Röhrchen.</li>
		<li>Drehen Sie die Zellen bei 200 x g für 5 min bei RT, entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 ml Wachstumsmedien.</li>
		<li>Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und säen Sie mit einer Dichte von 4 x 104 Zellen pro Filtereinsatz (d.h. 1,25 x 105 Zellen/cm2). Das Volumen der Zellsuspension für jeden Einsatz beträgt 250 μL.</li>
		<li>Die Beschichtungslösung wird aus den Vertiefungen mit durchlässigen Einsätzen abgesaugt und 250 μL der Zellsuspension pro Einsatz (apikale Kammer) überführt. Fügen Sie nur Medium (d.h. ohne Zellen) zu einem der Einsätze hinzu, das als "Blindkontrolle" für die TEER-Messung verwendet wird. Gleichzeitig fügen Sie auch 750 μL Medium pro Vertiefung in den basolateralen Kammern hinzu.</li>
		<li>Die 24-Well-Platte mit durchlässigen Einsätzen im Inkubator (37 °C und 5% CO2) 7-12 Tage aufbewahren, bis die kultivierten Zellen vollständig konfluent sind und der gewünschte TEER-Wert von ~20 Ω·cm2 erreicht ist.</li>
		<li>Wechseln Sie das Wachstumsmedium jeden zweiten Tag. Während des Medienwechsels saugen Sie das Medium vorsichtig ab, um die Störung der Zellmonoschicht zu minimieren, und fügen Sie 250 μL bzw. 750 μL frisches Medium pro Vertiefung in die apikalen bzw. basolateralen Kammern hinzu. HINWEIS: Das Wachstumsmedium wird sowohl für die apikalen als auch für die basolateralen Kammern der Vertiefungen gewechselt.</li>
	</ol></li>
</ol>3. TEER-Messungen (Abbildung 4)
<ol><li>Messen Sie am Tag 14 nach der Zellaussaat (Schritt 2.2.9) den TEER für HRMECs mit einem epithelialen Volt-Ohm-Meter (EVOM) elektrischen Widerstand (ER) System (Table of Materials) wie folgt.</li>
	<li>Laden Sie das ER-System vor und überprüfen Sie die Zählerfunktionalität mit der STX04-Testelektrode. Bei Bedarf kalibrieren.</li>
	<li>Verbinden Sie die Elektrode mit dem Messgerät und gleichen Sie die Elektrode aus, indem Sie sie zuerst für 15-20 Minuten in 70% Ethanol einweichen und dann kurz in das EGM-Wachstumsmedium der Zellkultur eintauchen.</li>
	<li>In der Zwischenzeit halten Sie die zellhaltige 24-Well-Platte in der Laminar-Flow-Haube für 15-20 min bei RT, um den Temperaturausgleich zu erreichen. HINWEIS: TEER-Messungen werden von der Temperatur beeinflusst, daher ist der Gleichgewichtsschritt unerlässlich.</li>
	<li>Für die TEER-Messung fügen Sie frisches Wachstumsmedium sowohl in die apikalen (250 μL) als auch in die basolateralen (750 μL) Kammern der Vertiefungen hinzu.</li>
	<li>Führen Sie die TEER-Messung durch, indem Sie die Elektrode vorsichtig so eintauchen, dass sich die kürzere Spitze im Einsatz befindet und die längere Spitze den Boden der Vertiefung berührt. Messen Sie zuerst den Widerstand über die Leerzeichensteuerung. Messen Sie für jede Einlage TEER in dreifacher Ausfertigung. HINWEIS: Zum Spülen der Elektrode zwischen den Messungen werden Nährmedien verwendet. Stellen Sie sicher, dass die Elektrode in einem 90°-Winkel zur Unterseite des Einsatzes gehalten wird, um stabile Messwerte zu erhalten.</li>
	<li>Berechnung des elektrischen Widerstands (in Ω·cm 2) über die Monoschicht nach der Formel TEER = Nettowiderstand (Ω) x Oberfläche des Filtereinsatzes (cm2); Hier ist der Nettowiderstand die Differenz zwischen dem Widerstand jeder Vertiefung (Wachstumsmedium mit Zellen) und der Leervertiefung (nur Wachstumsmedium).</li>
	<li>Führen Sie eine weitere Behandlung der Zellen erst durch, wenn der TEER-Wert ~20 Ω·cm2 erreicht. Wenn der gewünschte TEER-Wert nicht erreicht wird, bewahren Sie die Platte im Inkubator auf und messen Sie den TEER am nächsten Tag. HINWEIS: Die HRMEC-Konfluenz kann auch durch morphologische Untersuchung der Zellform (unter einem Mikroskop) mit typischer Kopfsteinpflastermorphologie und/oder durch das Vorhandensein von Zellverbindungsproteinen mit immunhistochemischer Färbung separat validiert werden.</li>
</ol>4. Transzytose-Assay
<ol><li>Clathrin-vermittelter In-vitro-Transzytose-Assay mit Cy3-markiertem Transferrin (Abbildung 5) <ol><li>Bei Erreichen der Konfluenz mit TEER-Werten um 20 Ω·cm2 entzieht das Serum die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5%CO2 unter Verwendung von 0,5% FBS in EBM (serumreduziertes Medium) in beiden Kammern (apikale Kammer: 250 μL und basolaterale Kammer: 750 μL) vor der Behandlung mit dem Liganden. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet.</li>
		<li>Die Zellen (unter Verwendung des serumreduzierten Mediums in Schritt 4.1.1.) werden in der apikalen Kammer mit fluoreszierendem (Cyanin 3)-markiertem Transferrinliganden (Cy3-Tf) (Endkonzentration von 40 μg/ml) für 60 min bei 37 °C inkubiert. HINWEIS: Platten, die Cy3-Tf enthalten, sollten vor Licht geschützt werden, um ein Photobleichen von Cy3-Tf zu vermeiden, indem Sie Aluminiumfolie einwickeln und das Experiment in einer Zellkulturhaube mit ausgeschaltetem Licht durchführen.</li>
		<li>Nach 1 h die Platte auf Eis legen und die Monoschicht apikal und basolateral 4x (3-5 min pro Waschgang) mit dem serumreduzierten Medium bei RT waschen, um das freie ungebundene Cy3-Tf zu entfernen. HINWEIS: Das Waschen ist unerlässlich, um freie Tracermoleküle zu entfernen und eine genaue Ablesung der Transzytose ohne mögliche Leckagen aus dem parazellulären Weg zu ermöglichen.</li>
		<li>Frisches, serumreduziertes Medium (wie in Schritt 4.1.1.) in die gründlich gewaschenen Filtereinsätze geben, die Zellen enthalten, und die Einsätze in frische Vertiefungen der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem serumreduziertem Medium überführen.</li>
		<li>Die Zellen für weitere 90 Minuten im Inkubator (37 °C und 5% CO2) inkubieren und dann das Medium aus der basolateralen Kammer sammeln.</li>
		<li>Die Fluoreszenzintensität der Lösung aus der basolateralen Kammer wird mit einem Fluoreszenzdetektor aufgezeichnet. Die Fluoreszenzintensität, gemessen als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU), gibt die Menge an Cy3-Tf-Komplex an, die über die HRMEC-Monoschicht über Clathrin-abhängige Transzytose transzytiert wird.</li>
	</ol></li>
	<li>Caveolae-vermittelter In-vitro-Transzytose-Assay mit HRP (Abbildung 6) <ol><li>Bei Erreichen der vollständigen Konfluenz mit TEER-Werten um 20 Ω·cm2 entziehen Serum die Zellen für 24 h bei 37 °C und 5% CO2 unter Verwendung von 0,5% FBS-haltigem EBM-Medium (serumreduziertes Medium) vor der Behandlung (wie in Schritt 4.1.1.). Während des gesamten Assays wurde serumreduziertes EBM-Medium verwendet.</li>
		<li>Behandeln Sie die Zellen in der apikalen Kammer mit den gewünschten Behandlungen und Vehikelkontrollen. HINWEIS: Hier haben wir Wnt-Modulatoren als Beispiel verwendet, um die Regulation der Caveolae-vermittelten Transzytose durch den Wnt-Signalweg in HRMECs zu demonstrieren: humanes rekombinantes Norrin und Wnt-Inhibitor XAV939. In einem typischen Experiment wurden die Zellen für 24 h in einem Inkubator (37 °C und 5%CO2) mit den folgenden Konzentrationen behandelt: Norrin (125 ng/ml), Norrin (125 ng/ml) + XAV939 (10 μM) und Vehikelsteuerungslösung. Darüber hinaus wurde auch Wnt3a-konditioniertes Medium (hergestellt aus L Wnt-3A-Zellen) verwendet.</li>
		<li>Die Zellen in der apikalen Kammer mit HRP (5 mg/ml) für 15 min bei 37 °C inkubieren.</li>
		<li>Anschließend die 24-Well-Platte auf Eis legen und die apikalen und basolateralen Kammern intensiv 6x mit P-Puffer (10 mM HEPES pH = 7,4, 1 mM Natriumpyruvat, 10 mM Glucose, 3 mM CaCl2, 145 mM NaCl) waschen, um das freie extrazelluläre HRP zu entfernen. HINWEIS: Das Waschen ist unerlässlich, um freie Tracermoleküle zu entfernen und eine genaue Ablesung der Transzytose ohne mögliche Leckagen aus dem parazellulären Weg zu ermöglichen.</li>
		<li>Frisches, serumreduziertes Medium (wie in Schritt 4.1.1.) in die apikale Kammer geben und die Einsätze in eine frische Vertiefung mit vorgewärmtem Medium überführen.</li>
		<li>Die Monoschicht für weitere 90 min im Inkubator bei 37 °C und 5%CO2 inkubieren, bevor das Medium aus der basolateralen Kammer aufgefangen wird.</li>
		<li>Fügen Sie dem gesammelten Medium 100 μL HRP-fluorogenes Peroxidasesubstrat (Table of Materials) gemäß den Anweisungen des Herstellers hinzu und inkubieren Sie bei RT für 10 Minuten, bevor Sie die Reaktion mit 100 μL Stop-Lösung stoppen.</li>
		<li>Erfassen Sie die Konzentrationen des HRP-Substratreaktionsprodukts in den Medien mit einem Fluoreszenzplattenleser. Messung der Fluoreszenzintensität bei 420 nm Emissionswellenlänge (mit 325 nm Anregung) und als relative Fluoreszenzeinheiten (RFU). Die Werte geben das Niveau der HRP an, die durch Caveolae-vermittelte Transzytose über die HRMEC-Schicht transzytiert wird. HINWEIS: Das hier verwendete fluoreszierende Produkt (Table of Materials) photobleichen nicht. Ein Lichtschutz gegen Photobleiche ist nicht erforderlich.</li>
	</ol></li>
</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte oder finanziellen Interessen offenzulegen.

BRB spielt eine wesentliche Rolle bei der Gesundheit und Erkrankung der Netzhaut. In-vitro-Techniken zur Beurteilung der vaskulären Permeabilität haben sich als entscheidende Werkzeuge in Studien zur Entwicklung und Funktion von Barrieren (BRB/BBB) erwiesen. Das hier beschriebene Verfahren könnte verwendet werden, um die molekularen Mechanismen der EC-Transzytose zu untersuchen oder verwandte molekulare Modulatoren zu bewerten, die die BRB-Permeabilität beeinflussen. In vitro EC-Transzytose-Assays haben...

Die menschliche Netzhaut ist eines der am höchsten energieintensiven Gewebe im Körper. Das reibungslose Funktionieren der neuronalen Netzhaut erfordert eine effiziente Versorgung mit Sauerstoff und Nährstoffen sowie einen begrenzten Fluss anderer potenziell schädlicher Moleküle zum Schutz der Netzhautumgebung, die über die Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) vermittelt wird1. Ähnlich wie die Blut-Hirn-Schranke (BBB) im zentralen Nervensystem wirkt die BRB als selektive Barriere im Auge und reguliert die Bewegung von Ionen, Wasser, Aminosäuren und Zucker in und aus der Netzhaut. BRB erhält auch die Netzhauthomöostase und ihr Immunprivileg aufrecht, indem sie die Exposition gegenüber Kreislauffaktoren wie Immunzellen, Antikörpern und schädlichen Krankheitserregern verhindert2. BRB-Dysfunktion trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, wie diabetische Retinopathie, altersbedingte Makuladegeneration (AMD), Frühgeborenenretinopathie (ROP), Netzhautvenenverschluss und Uveitis, was zu vasogenen Ödemen und anschließendem Sehverlust führt 3,4,5.
Die BRB besteht aus zwei separaten Barrieren für zwei unterschiedliche okuläre vaskuläre Netzwerke: das retinale Gefäßsystem und die fenestrierte Choriokapillare unter der Netzhaut. Die innere BRB (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (RMECs), die die retinale Mikrovaskulatur auskleiden, die die inneren retinalen neuronalen Schichten nährt. Zum anderen bildet das retinale Pigmentepithel den Hauptbestandteil des äußeren BRB, das zwischen neurosensorischer Netzhaut und Choriokapillaris2 liegt. Für den iBRB findet der molekulare Transport zwischen RMECs sowohl über parazelluläre als auch über transzelluläre Wege statt (Abbildung 1). Der hohe Grad an Substanzselektivität über den iBRB beruht auf (i) dem Vorhandensein von junctionalen Proteinkomplexen, die den parazellulären Transport zwischen benachbarten Endothelzellen (ECs) einschränken, und (ii) niedrigen Expressionsniveaus von Caveolae-Mediatoren, Transportern und Rezeptoren innerhalb der Endothelzellen, die niedrige transzelluläre Transportraten aufrechterhalten 1,6,7,8 . Junctionale Komplexe, die den parazellulären Fluss regulieren, bestehen aus Tight Junctions (Claudine, Occludine), Adherens-Junctions (VE-Cadherine) und Gap Junctions (Connexine), die den Durchgang von Wasser und kleinen wasserlöslichen Verbindungen ermöglichen. Während kleine lipophile Moleküle passiv über das Innere von RMECs diffundieren, wird die Bewegung größerer lipophiler und hydrophiler Moleküle durch ATP-getriebene transendotheliale Signalwege einschließlich vesikulärer Transport- und Membrantransporter reguliert 5,9.
Vesikuläre Transzytose kann als Caveolin-vermittelte katolare Transzytose, Clathrin-abhängige (und rezeptorvermittelte) Transzytose und Clathrin-unabhängige Makropinozytose kategorisiert werden (Abbildung 2). Diese vesikulären Transportprozesse umfassen unterschiedlich große Vesikel, wobei Makropinosomen die größten (im Bereich von 200-500 nm) und Caveolae die kleinsten (durchschnittlich 50-100 nm) sind, während Clathrin-beschichtete Vesikel von 70-150 nm10 reichen. Caveolae sind kolbenförmige lipidreiche Plasmamembraninvaginationen mit einer Proteinhülle, die hauptsächlich aus Caveolin-1 besteht, das Lipidmembrancholesterin und andere Struktur- und Signalproteine über ihre Caveolin-Gerüstdomäne11 bindet. Caveoline arbeiten mit peripher angeschlossenem Cavin zusammen, um die Stabilisierung der Caveolae an der Plasmamembran12 zu fördern. Katolarmembranen können auch Rezeptoren für andere Moleküle wie Insulin, Albumin und zirkulierende Lipoproteine einschließlich High-Density-Lipoprotein (HDL) und Low-Density-Lipoprotein (LDL) tragen, um ihre Bewegung durch Endothelzellen zu unterstützen13. Während der Entwicklung hängt die Bildung von funktionellem BRB von der Unterdrückung der EC-Transzytoseab 8. Reifes retinales Endothel weist daher relativ niedrige Konzentrationen von Caveolae-, Caveolin-1- und Albuminrezeptoren im Vergleich zu anderen Endothelzellen unter physiologischen Bedingungen auf, was zu seinen Barriereeigenschaften beiträgt 4,9.
Da der iBRB-Abbau ein wesentliches Kennzeichen vieler pathologischer Augenerkrankungen ist, ist es wichtig, Methoden zur Beurteilung der retinalen vaskulären Permeabilität in vivo und in vitro zu entwickeln. Diese Methoden helfen, wahrscheinliche Einblicke in die Mechanismen der kompromittierten BRB-Integrität zu liefern und die Wirksamkeit potenzieller therapeutischer Ziele zu bewerten. Aktuelle In-vivo-Bildgebungs- oder quantitative vaskuläre Leckage-Assays verwenden typischerweise fluoreszierende (Natriumfluorescein und Dextran), kolorimetrische (Evans-Blue-Farbstoff und Meerrettichperoxidase [HRP]-Substrat) oder radioaktive Tracer14, um eine Extravasation aus dem Gefäßsystem in das umgebende Netzhautgewebe mit mikroskopischer Bildgebung oder in isoliertem Gewebelysat nachzuweisen. Ein idealer Tracer zur Quantifizierung der vaskulären Integrität sollte inert und groß genug sein, um kompromittierte Gefäße frei zu durchdringen, während sie in gesunden und intakten Kapillaren eingeschlossen sind. Methoden, die Natriumfluorescein oder Fluorescein-Isothiocyanat-konjugiertes Dextran (FITC-Dextran) in lebender Fundus-Fluorescein-Angiographie (FFA) oder isolierten Netzhaut-Flachmounts verwenden, werden häufig zur Quantifizierung der Netzhautextravasation in vivo oder ex vivo verwendet. FITC-Dextran hat den Vorteil, dass es in verschiedenen Molekulargewichten von 4-70 kDa für größenselektive Studien15,16,17 verfügbar ist. FITC-Albumin (~68 kDa) ist ein alternativer großformatiger Proteintracer von biologischer Relevanz für vaskuläre Leckagestudien18. Evansblau-Farbstoff, intrakardialinjiziert 19, retroorbital oder durch die Schwanzvene 20, beruht auch auf seiner Bindung mit endogenem Albumin, um ein großes Molekül zu bilden, das durch meist spektrophotometrische Detektion oder, seltener, Fluoreszenzmikroskopie in flachen Halterungen quantifiziert werden kann20,21. Diese quantitativen oder lichtbildgebenden Methoden unterscheiden jedoch oft nicht zwischen parazellulärem Transport und transendothelialem Transport. Für die spezifische Analyse der Transzytose mit ultrastruktureller Visualisierung transzytosierter Vesikel werden typischerweise Tracermoleküle wie HRP verwendet, um transzytosierte Vesikel innerhalb von Endothelzellen zu lokalisieren, die unter einem Elektronenmikroskop 22,23,24 beobachtet werden können (Abbildung 3A-C).
Die Entwicklung und Verwendung von In-vitro-iBRB-Modellen zur Bewertung der Permeabilität von Endothelzellen könnte eine robuste Bewertung mit hohem Durchsatz ermöglichen, um In-vivo-Experimente zu ergänzen und die Untersuchung molekularer Regulatoren der vaskulären Leckage zu unterstützen. Häufig verwendete Assays zur Beurteilung des parazellulären Transports und der Integrität von Tight Junctions umfassen den transendothelialen elektrischen Widerstand (TEER), ein Maß für die Ionenleitfähigkeit (Abbildung 4)2,25, und den In-vitro-Gefäßleckage-Assay unter Verwendung von fluoreszierenden Tracern mit kleinem Molekulargewicht 26. Darüber hinaus wurden Transferrin-basierte Transzytose-Assays zur Modellierung von BBB verwendet, um die Clathrin-abhängige Transzytosezu untersuchen 27. Trotzdem sind die Assays zur Bewertung der BRB und insbesondere der retinalen EC-Katolartranszytose in vitro begrenzt.
In dieser Studie beschreiben wir einen EC-Transzytose-Assay unter Verwendung humaner retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen (HRMECs) als in vitro-Modell zur Bestimmung der iBRB-Permeabilität und der EC-Transzytose. Dieser Assay beruht auf der Fähigkeit von HRMECs, Transferrin oder HRP über die rezeptorvermittelten bzw. caveolae-abhängigen Transzytosewege zu transportieren (Abbildung 2). HRMECs, die bis zur vollständigen Konfluenz in der apikalen Kammer (d. h. Filtereinsatz) kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzkonjugiertem Transferrin (Cy3-Tf) oder HRP inkubiert, um die Fluoreszenzintensität zu messen, die den Transferrin- oder HRP-Spiegeln entspricht, die ausschließlich durch EC-Transzytose in die untere Kammer übertragen werden. Die Konfluenz der Zellmonoschicht kann durch Messung von TEER bestätigt werden, was die Tight-Junction-Integritätanzeigt 25. Um die TEER- und Transzytose-Assay-Technik zu demonstrieren, wurden bekannte molekulare Modulatoren der vaskulären Permeabilität und EC-Transzytose verwendet, einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors (VEGF)28 und derjenigen im Wnt-Signalweg (Wnt-Liganden: Wnt3a und Norrin)29.

<table><tbody><tr><td>Biologische Sicherheitswerkbank</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>1286</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur Petrischist&nbsp;</td><td>Nest Biotechnology</td><td>704001</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5702</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (15 mL)</td><td>Corning Inc.</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen (50 mL)</td><td>Denville Scientific Inc.</td><td>C1062-P</td><td></td></tr><tr><td>Cyanin 3-menschliches Transferrin&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>AB_2337082</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzell-Basalmedium-2 (EBM-2)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-3156</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellwachstumsmedium-2 (EGM-2) SingleQuots Nahrungsergänzungsmittel</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4176</td><td></td></tr><tr><td>EVOM Millicell Electrical Resistance System-2 (ERS-2)</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Lonza Bioscience</td><td>CC-4102B</td><td></td></tr><tr><td>Gelatine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer (2-Chip)</td><td>Bulldog Bio</td><td>DHC-N002</td><td></td></tr><tr><td>Meerrettichperoxidase (HRP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8250</td><td></td></tr><tr><td>Mikrovaskuläre Endothelzellen der menschlichen Netzhaut (HRMEC)</td><td>Zellsysteme</td><td>ACBRI 181</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Thermo Electron Corporation, Thermo Fisher Scientific</td><td>3110</td><td></td></tr><tr><td>L Zellen (für kontrollkonditioniertes Medium)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2648</td><td></td></tr><tr><td>L Wnt-3A Zellen (für Wnt3A-konditioniertes Medium)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2647</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td>Leica</td><td>DMi1</td><td></td></tr><tr><td>Multimode Plate Reader</td><td>EnSight, PerkinElmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Puffer (1x)</td><td>GIBCO</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>QuantaBlu Fluorogenes Peroxidase-Substrat-Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15169</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinantes humanes Norrin (rhNorrin)</td><td>R& D Systems</td><td>3014-NR</td><td></td></tr><tr><td>Rekombinanter humaner vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (rhVEGF)</td><td>R& D Systems</td><td>293-VE</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatzfilter (0,22 & Mikro; m)</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Transwell-Einsätze (6,5 mm Transwell, 0,4 & Mikro; m pore Polyester-Membraneinlage)</td><td>Corning Inc.</td><td>CLS3470-48EA</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%) (1x)</td><td>GIBCO</td><td>25-200-072</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>Precision, Thermo Fisher Scientific</td><td>51221060</td><td></td></tr><tr><td>XAV939 (Wnt/&beta;-Catenin-Inhibitor)</td><td>Selleckchem</td><td>S1180</td><td></td></tr></tbody></table>

endothelzell-transzytose-assay als in-vitro-modell zur beurteilung der permeabilität der inneren blut-retina-barriere

Endothelial Cell Transcytosis Assay as an In Vitro Model to Evaluate Inner Blood-Retinal Barrier Permeability

Eine Dysfunktion der Blut-Netzhaut-Schranke (BRB) trägt zur Pathophysiologie mehrerer vaskulärer Augenerkrankungen bei, was häufig zu Netzhautödemen und anschließendem Sehverlust führt. Die innere Blut-Netzhaut-Barriere (iBRB) besteht hauptsächlich aus retinalem vaskulärem Endothel mit geringer Permeabilität unter physiologischen Bedingungen. Dieses Merkmal der geringen Permeabilität wird durch niedrige parazelluläre Transportraten zwischen benachbarten retinalen mikrovaskulären Endothelzellen sowie durch den transzellulären Transport (Transzytose) durch sie streng reguliert und aufrechterhalten. Die Bewertung der retinalen transzellulären Barrierepermeabilität kann grundlegende Einblicke in die Integrität von iBRB in Gesundheit und Krankheit liefern. In dieser Studie beschreiben wir einen Endothelzell (EC) Transzytose-Assay als in vitro Modell zur Bewertung der iBRB-Permeabilität unter Verwendung von humanen retinalen mikrovaskulären Endothelzellen (HRMECs). Dieser Assay bewertet die Fähigkeit von HRMECs, Transferrin und Meerrettichperoxidase (HRP) in rezeptor- bzw. caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren. Vollständig konfluente HRMECs, die auf poröser Membran kultiviert wurden, wurden mit fluoreszenzmarkiertem Transferrin (Clathrin-abhängige Transzytose) oder HRP (Caveolae-vermittelte Transzytose) inkubiert, um die Transferrin- oder HRP-Spiegel zu messen, die in die Bodenkammer übertragen wurden, was auf Transzytosespiegel in der gesamten EC-Monoschicht hinweist. Der Wnt-Signalweg, ein bekannter Signalweg, der iBRB reguliert, wurde moduliert, um die Caveolae-vermittelte HRP-basierte Transzytose-Assay-Methode zu demonstrieren. Der hier beschriebene EC-Transzytose-Assay kann ein nützliches Werkzeug für die Untersuchung der molekularen Regulatoren der EC-Permeabilität und iBRB-Integrität in vaskulären Pathologien und für das Screening von Arzneimittelabgabesystemen sein.

EM-Bilder des retinalen vaskulären Endothels zeigen transzytotischen vesikulären Transport und katoolare Vesikel in Endothelzellen in vivo. Die EC-Transzytose kann in vivo innerhalb von Netzhautquerschnitten mit dunkelbraunem Niederschlag, der HRP-haltige Blutgefäße unter einem Lichtmikroskop reflektiert (Abbildung 3A) und als elektronendichter Niederschlag, der auf HRP-haltige transzytotische Vesikel hinweist (Abbildung 3B,C</st...

Dieses Protokoll veranschaulicht einen In-vitro-Endothelzell-Transzytose-Assay als Modell zur Bewertung der Permeabilität der inneren blutretinalen Barriere durch Messung der Fähigkeit menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen, Meerrettichperoxidase über Zellen in caveolae-vermittelten transzellulären Transportprozessen zu transportieren.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Dysfunction of the blood-retinal barrier (BRB) contributes to the pathophysiology of several vascular eye diseases, often resulting in retinal edema and ...

Dieses Protokoll bietet ein nützliches zellbasiertes Modell zur Untersuchung der Funktion und Permeabilität selektiver Gefäßbarrieren wie der Blutretina- oder Blut-Hirn-Schranke mit besonderem Fokus auf endotheliale Transzytose. Dieser Assay ist einfach einzurichten und zu verwenden und erfordert keine lebenden Tiere. Es kann zur Untersuchung verschiedener molekularer Regulatoren der Endothelzellpermeabilität und Transzytose verwendet werden, die die innere Integrität der Blut-Netzhaut-Barriere beeinflussen.Dieser Assay kann Einblicke in die vaskuläre Biologie sowie in die Augen- und Hirnforschung geben, was ein besseres Verständnis der Molekülmechanismen ermöglicht, die der BRB-BBB-Kontrolle zugrunde liegen, und die Erforschung einer potenziellen Medikamentenabgabe über die Barrieren hinweg. Bereiten Sie zunächst die Zellkulturfiltereinsätze für die Aussaat menschlicher retinaler mikrovaskulärer Endothelzellen oder HRMECs vor, indem Sie jeden Einsatz 30 Minuten lang unter einer Laminar-Flow-Haube mit 200 Mikrolitern 0,1% Gelatinelösung beschichten. Stellen Sie sicher, dass die Lösung die gesamte Unterseite des Filtereinsatzes bedeckt.Nehmen Sie eine Petrischale mit kultivierten HRMECs, die bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid inkubiert wurden, und saugen Sie die Wachstumsmedien ab. Spülen Sie die Zellen zweimal vorsichtig mit 10 Milliliter 1X PBS unter der Laminar-Flow-Haube, um die potenziellen schwimmenden oder toten Zellen loszuwerden. Dissoziieren Sie die Zellen mit 0,5 bis 1 Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA-Lösung und legen Sie die Petrischale bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 5 Minuten in den Inkubator.Löschen Sie die Trypsinaktivität durch Zugabe von 4,5 bis 9 Milliliter Wachstumsmedien und überführen Sie die Zellsuspension mit einer 10-Milliliter-Pipette in ein 15-Milliliter-Röhrchen. Drehen Sie die Zellen bei 200 mal g für 5 Minuten bei Raumtemperatur. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 3 Milliliter Wachstumsmedien.Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem manuellen Hämozytometer oder einem automatisierten Zellzähler und säen Sie mit einer Dichte von 40.000 Zellen pro Filtereinsatz. Das Volumen der Zellsuspension für jeden Einsatz beträgt 250 Mikroliter. Die Beschichtungslösung wird aus den Vertiefungen mit durchlässigen Einsätzen abgesaugt und 250 Mikroliter der Zellsuspension pro Einsatz überführt, dann nur Medium zu einem der Einsätze hinzugefügt, das als Blindkontrolle für die Messung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) verwendet wird.Gleichzeitig fügen Sie auch 750 Mikroliter Medium pro Vertiefung in den basolateralen Kammern hinzu. Halten Sie die 24-Well-Platte mit durchlässigen Einsätzen im Inkubator bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid für 7 bis 12 Tage, bis die kultivierten Zellen vollständig konfluent sind und der gewünschte TEER-Wert von etwa 20 Ohm pro Quadratzentimeter erreicht ist. Vor TEER-Messungen die zellhaltige 24-Well-Platte für 15 bis 20 Minuten bei Raumtemperatur in die Laminar-Flow-Haube legen, um den Temperaturausgleich zu erreichen.Um den TEER für HRMECs mit einem elektrischen Widerstandssystem für Epithelvolt / Ohm zu messen, verbinden Sie die Elektrode mit dem Messgerät und gleichen Sie die Elektrode aus, indem Sie sie zuerst 15 bis 20 Minuten lang in 70% Ethanol einweichen und dann kurz in das EGM-Wachstumsmedium der Zellkultur eintauchen. Führen Sie die TEER-Messung durch, indem Sie die Elektrode vorsichtig eintauchen, so dass sich die kürzere Spitze im Einsatz befindet und die längere Spitze den Boden der Vertiefung berührt. Messen Sie zuerst den Widerstand über den Blank-Regler und dann für jede Einlage TEER in dreifacher Ausfertigung.Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter werden die Zellen vor der Behandlung mit dem Liganden 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid mit 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern beraubt. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Inkubieren Sie die Zellen mit dem serumreduzierten Medium in der apikalen Kammer mit fluoreszierendem Cyanin-3-Tag zum Transferrin-Liganden für 60 Minuten bei 37 Grad Celsius.Nach dem 4-fachen Waschen der Monoschicht apikal und basolateral mit dem serumreduzierten Medium frisches Medium in die Filtereinsätze mit den Zellen geben und die Einsätze in frische Vertiefungen der 24-Well-Platte mit vorgewärmtem serumreduziertem Medium überführen. Inkubieren Sie die Zellen für weitere 90 Minuten im Inkubator und sammeln Sie dann das Medium aus der basolateralen Kammer. Die Fluoreszenzintensität der Lösung aus der basolateralen Kammer wird mit einem Fluoreszenzdetektor aufgezeichnet.Bei Erreichen des Zusammenflusses mit TEER-Werten um 20 Ohm Quadratzentimeter Serumentzug der Zellen für 24 Stunden bei 37 Grad Celsius und 5% Kohlendioxid unter Verwendung von 0,5% FBS in EBM in beiden Kammern vor der Behandlung mit dem Liganden. Serumreduziertes EBM wurde während des gesamten Assays verwendet. Als nächstes behandeln Sie die Zellen in der apikalen Kammer mit den gewünschten Behandlungen und Vehikelkontrollen.Fügen Sie 5 Milligramm pro Milliliter Meerrettichperoxidase oder HRP zu den Zellen hinzu und inkubieren Sie für 15 Minuten bei 37 Grad Celsius. Geben Sie frisches, serumreduziertes Medium in die apikale Kammer und geben Sie die Einsätze in eine frische Vertiefung, die vorgewärmte Medien enthält. Inkubieren Sie die Monoschicht für weitere 90 Minuten im Inkubator.Nach dem Sammeln von Medium aus der basolateralen Kammer 100 Mikroliter HRP-fluorogenes Peroxidasesubstrat in das gesammelte Medium geben und 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Stoppen Sie die Reaktion mit 100 Mikrolitern Stopplösung und detektieren Sie die Konzentrationen des HRP-Substratreaktionsprodukts in den Medien mit einem Fluoreszenzplattenleser. Vor der Demonstration der in vitro Transzytose-Assays wird die Visualisierung der Endothelzelltranszytose in der Netzhaut als Hintergrundinformation gezeigt.Hier zeigt das lichtmikroskopische Bild ein HRP-gefülltes Blutgefäßlumen aus einem 3 Monate alten Wildtyp-Maus-Netzhautabschnitt, der mit DAB gefärbt ist. HRP wurde retroorbital injiziert. HRP-gefüllte Netzhautgefäße können unter dem Lichtmikroskop als dunkelbrauner Niederschlag gesehen werden.Der ultradünne Transmissionselektronenmikroskop zeigt HRP-gefüllte transzytotische Gefäße mit RMECs, die die EC-Transzytose über die innere Blut-Netzhaut-Barriere darstellen. Hier reflektiert das große Vesikel möglicherweise Makropinosom und ein rotes Blutkörperchen auf der Luminolseite. Das TeM-Bild zeigt HRP-gefüllte kleine transzytotische Vesikel, wahrscheinlich Caveola-Vesikel, innerhalb des RMEC.Die immunhistochemische Färbung von CAV-1-Antikörpern und Isolectin B4 zeigt die Lokalisation von CAV-1, einem Marker von Caveola-Vesikeln in retinalen Blutgefäßen, in der 3 Monate alten Wildtyp-Mausnetzhaut. TeM-Bild von Immunogold-markiertem CAV-1 innerhalb der retinalen Endothelzellen ist hier mit einem vergrößerten Bild von CAV-1-positivem Caveola-Vesikel gezeigt. Für Clathrin-vermittelte EC-Transzytose-Assays in HRMECs unter Verwendung von Transferrin zeigt hier ein fluoreszenzmikroskopisches Bild endozytosiertes Cy3-Transferrin in roter Farbe innerhalb von HRMECs, die mit DAPI in blau gefärbt sind.Für die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose mittels HRP wird der Wnt-Signalweg hier als Beispiel zur Demonstration des Assays verwendet. Kürzlich wurde festgestellt, dass der Wnt-Signalweg die Caveolae-vermittelte EC-Transzytose reguliert. Die Zellen wurden mit Wnt-Signalweg-Aktivator Wnt3a-konditioniertem mittlerem und rekombinantem Norrin mit oder ohne Wnt-Signalinhibitor XAV939 und ihren reaktiven Kontrollen behandelt.Wnt-Aktivatoren reduzierten das Niveau der HRP-basierten Transzytose, die durch XAV939 umgekehrt wurden. Die korrekte TEER-Messung ist entscheidend für die Bestimmung der Monolayer-Integrität. Es wird stark von verschiedenen Faktoren wie unsachgemäßer Handhabung, Temperaturschwankungen, Kulturmedium, Kulturdauer usw. beeinflusst.Dieser Assay könnte als Kokultur oder 3D-Organotypisches Kultursystem modifiziert werden, das In-vivo-Bedingungen nachahmt.

endothelial-cell-transcytosis-assay-as-an-vitro-model-to-evaluate

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt einen Permeabilitätsassay zur Bewertung der Permeabilität der in vitro Blut-Hirn-Schranke mit Natriumfluoresceinmolekülen.

Assay zur Nachahmbarkeit der Blut-Hirn-Schranke: Ein In-vitro-Assay zur Beurteilung der Durchlässigkeit von BHS-Nachahmung gegenüber Tracermolekülen

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bestimmung des transendothelialen elektrischen Widerstands (TEER) in mikrovaskulären Endothelzellen des Mausgehirns in vitro. Ein hoher TEER-Wert deutet auf intakte Endothelzellverbindungen hin, während die Zugabe von aktivierten T-Zellen den TEER-Wert senkt, was eine Störung der Verbindungsbarriere widerspiegelt.

Bewertung des transendothelialen elektrischen Widerstands in einem in vitro Blut-Hirn-Schrankenmodell

Ein<em&gt; In vivo</em&gt; Assay Blood Vessel Durchlässigkeitsprüfung

Viele therapeutische Anwendungen erfordern sicheren und effizienten Transport von Arzneistoffträger und ihre Ladungen über zelluläre Barrieren im Körper. Dieser Artikel beschreibt eine Anpassung der etablierten Verfahren, um die Geschwindigkeit und der Mechanismus der Medikamententransport Nanoträger (NCS) über zelluläre Barrieren, wie der gastrointestinalen (GI) Epithel auszuwerten.

Modelle und Methoden zum Transport von Drug Delivery Systems über zelluläre Barrieren Bewerten

Das Ziel der vorliegenden Studie war es, die Reproduzierbarkeit der einem in vitro-Modell mit BBB eine Ratte syngenen Co-Kultur von Endothelzellen und Astrozyten zu validieren. Die Endothel-Zellschicht vorgestellt hohen und niedrigen TEER LY Durchlässigkeit. Expression spezifischer TJ Proteinen wurden funktionellen Antworten zu Entzündungen und Funktionalität von Transportern und Rezeptoren untersucht.

Einrichten einer<em&gt; In-vitro-</em&gt; Modell der Ratte Blut-Hirn-Schranke (BBB): Ein Fokus auf BBB-Undurchlässigkeit und Rezeptor-vermittelten Transport

Eine Methode zur Etablierung eines in vitro Modells der Blut-Hirn-Schranke, die auf einer Co-Kultur von mikrovaskulären Endothelzellen und Astrozyten des Rattenhirns basiert, wird beschrieben und validiert. Dieses System erwies sich als ein valides Werkzeug, um die Wirkung der Nanoformulierung auf die Transbarriere-Permeation von fluoreszierenden Molekülen zu untersuchen.

In - vitro - Permeation von FITC-geladen Ferritine Über eine Ratte Blut-Hirn - Schranke: ein Modell für die Lieferung von Nanoformulated Moleküle zu studieren

Hier beschreiben wir ein in vitro Mausmodell der Blut-Hirn-Schranke, das Impedanzzellspektroskopie verwendet, mit einem Schwerpunkt auf den Auswirkungen auf die Integrität und Permeabilität von Endothelzellen bei Interaktion mit aktivierten T-Zellen.

Ein<em&gt; In Vitro</em&gt; Modell der Blut-Hirn-Schranke Mit Impedanzspektroskopie: Ein Fokus auf T-Zell-Endothelzellinteraktion

Eine kostengünstige, einfach zu bedienende und leistungsfähige System etabliert mögliche Behandlungen zu bewerten, die Blut Retina-Schranke Verletzung durch Histamin induzierte verbessern könnte. Blutgefäße Leckage, Müller-Zell-Aktivierung und die Kontinuität der neuronalen Prozesse werden genutzt, um die Schadensantwort und deren Umkehrung mit einem potenziellen Medikament, Lipoxin A4 zu beurteilen.

Eine akute Retinal Modell zur Bewertung von Blut Retinal Barrier Breach und potenzielle Medikamente für die Behandlung

Hier präsentieren wir einen Maus Gehirn vaskulären Permeabilität Assay mit intraperitonealer Injektion von Fluoreszenz Tracer gefolgt von Perfusion, die auf Tiermodelle der Blut - Hirn-Schranke Dysfunktion anwendbar ist. Ein Hemi-Gehirn dient zur Durchlässigkeit quantitativ bewerten und die andere für die Tracer Visualisierung/Immunostaining. Der Eingriff dauert ca. 5-6 h für 10 Mäuse.

Eine In Vivo Blut - Hirn-Schranke Permeabilität Assay bei Mäusen mit Gewebekulturen beschriftet Tracer

Hier beschreiben wir die Herstellung von humanen Organoid-abgeleiteten intestinalen Epithel-Monolayern zur Untersuchung der Darmbarrierefunktion, Permeabilität und des Transports. Da Organoide die ursprüngliche Reaktion des Epithelgewebes auf äußere Reize darstellen, kombinieren diese Modelle die Vorteile der Erweiterbarkeit von Zelllinien und die Relevanz und Komplexität von Primärgewebe.

Organoid-abgeleitete Epithel-Monolayer: Ein klinisch relevantes In-vitro-Modell für die Darmbarrierefunktion

Erfahren Sie einen Endothelzell-Transzytose-Assay zur Bewertung der inneren Blut-Retina-Barriere-Permeabilität mit HRMECs. Diese tierfreie Methode ermöglicht die Untersuchung molekularer Regulatoren der endothelialen Permeabilität.

Endothelzell-Transzytose-Assay als In-vitro-Modell zur Beurteilung der Permeabilität der inneren Blut-Retina-Barriere

Weitere Videos entdecken