Experimentelles Melanom-Immuntherapiemodell mit Tumorimpfung mit einem hämatopoetischen Zytokin

Dieses Protokoll bietet ein klinisches solides Tumorimmuntherapiemodell und eine Forschungsplattform, um die Beziehung zwischen Tumorzellen und infiltrierenden Immunzellen zu untersuchen. Dieser zellbasierte Tumorimpfstoff ist praktisch, einfach zu verwenden und kann mit anderen therapeutischen Modalitäten wie Checkpoint-Blockade kombiniert werden, um einen additiven oder synergistischen Effekt zu erzielen, der zu einer stärkeren und höheren Tumorimmunität führen kann. Bei der Demonstration des Verfahrens wird Ann Balancio, eine Forschungstechnikerin aus meinem Labor, helfen.

Um zu beginnen, kultivieren Sie B16-F10 Melanomzellen in IMDM, die 10% wärmeinaktives FBS, 2 Millimolar Glutamin, 1 Millimolar Natriumpyruvat, 1 Millimolar MEM nicht-essentielle Aminosäuren und jeweils 100 Einheiten pro Milliliter Penicillin und Streptomycin enthalten. Halten Sie die Zelllinie bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid. Saat und Ernte der B16-F10-Zellen wie im Textmanuskript beschrieben.

Entfernen Sie das Kulturmedium und waschen Sie die Kolben einmal mit PBS. PBS absaugen und 5 Milliliter 0,25% Trypsin-EDTA hinzufügen, gefolgt von einem harten Klopfen auf den Rand des Kulturkolbens. Fügen Sie 15 Milliliter Kulturmedium hinzu, um das Trypsin-EDTA zu neutralisieren, und gießen Sie den Inhalt des Kolbens in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Waschen Sie die Schalenoberfläche mit 10 Milliliter PBS und gießen Sie sie in das gleiche 50 Milliliter Zentrifugenröhrchen. Zentrifugieren Sie die Zellen für 5 Minuten bei 200 RCF. Verwerfen Sie den Überstand und brechen Sie das Zellpellet, indem Sie mit dem Finger auf den Boden des Röhrchens klopfen.

Fügen Sie kalte 10 Milliliter PBS hinzu und pipetten Sie die Zellsuspension vorsichtig. Dann zählen Sie die Zellen manuell mit einem Hämozytometer. Halten Sie die Zellen vor der Injektion auf Eis.

Intradermal 500.000 Zellen B16-F10 Tumorzellen in 50 Mikroliter kaltes PBS in der linken Flanke mit einer 30-Gauge-Nadel implantieren. Die Dosis der implantierten B16-F10-Tumorzellen muss möglicherweise in einem Bereich von 50.000 bis 500.000 Zellen für eine erfolgreiche Tumorentwicklung angepasst werden. Nach der Implementierung messen Sie die Tumorlänge und -breite dreimal pro Woche mit einem elektronischen digitalen Messschieber.

Berechnen Sie das Tumorvolumen und behandeln Sie die Mäuse mit Tumorimpfstoff, wenn Tumore eine Größe von zwei Millimetern erreicht haben, wie im Textmanuskript beschrieben. Mit einem Röntgenstrahler, der auf 160 Kilovolt und 25 Milliampere eingestellt ist, bestrahlen Sie Zellen mit 150 Graudosen Gammastrahlen. Zählen und überprüfen Sie die Zelllebensfähigkeit durch Trypanblau-Färbung vor der Injektion.

Intradermal injizieren Sie den Mäusen 1 Million bestrahlte B16-Flt3L-Zellen in 50 Mikrolitern kaltem PBS auf derselben Flanke wie die ursprüngliche Tumorimplantation. Etwa einen Zentimeter von der Stelle des Primärtumors entfernt an den Tagen 3, 6 und 9 nach der ersten Zellimplantation. Markieren Sie die Impfstoffinjektionsstellen mit einem farbigen Stift, um sie vom Primärtumor zu unterscheiden.

Wenn ursprünglich 50.000 B16-F10-Zellen implantiert wurden, wird empfohlen, eine Impfbehandlung an den Tagen 8, 11 und 14 durchzuführen. Entfernen Sie den Tumor chirurgisch mit der Haut von jeder eingeschläferten Maus und legen Sie ihn in eine 24-Well-Platte mit 1 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium. Schneiden Sie die Tumore in zwei Milliliter Verdauungspuffer in kleine Stücke und inkubieren Sie für 25 Minuten bei 37 Grad Celsius.

Fügen Sie 10 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium hinzu, um die Verdauung zu stoppen. Die Zellen werden mit einer 25-Milliliter-serologischen Pipette in ein 40-Mikrometer-Zellsieb überführt. Verwenden Sie dann den Kolben einer Ein-Milliliter-Spritze, um das Gewebe zu mahlen.

Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius. Resuspendieren Sie das Pellet in 5 Milliliter 40% Dichte Gradient spezifisches Medium in PBS verdünnt auf 1x Konzentration. Fügen Sie die Zellsuspension langsam auf 5 Milliliter 80% Dichtegradienten-spezifisches Medium hinzu, das PBS enthält.

Zentrifugieren Sie zu den Zellen bei 325 RCF mit niedriger Bremseinstellung für 23 Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Zentrifugation die Leukozytenschicht an der Grenzfläche zwischen 40% und 80% Dichte gradientenspezifisches Medium vorsichtig sammeln und durch ein 40-Mikrometer-Zellsieb leiten. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 500 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Inkubieren Sie das Pellet in zwei Milliliter Lysepuffer der roten Blutkörperchen für fünf Minuten bei Raumtemperatur. Nach der Inkubation 10 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium hinzufügen, um den RBC-Lysepuffer zu löschen. Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 RCF für 5 Minuten bei 4 Grad Celsius.

Resuspendieren Sie die Zellen in 0,5 Milliliter 10% FBS RPMI 1640 Medium und zählen Sie die Gesamtzahl der Zellen vor der weiteren Analyse. Sammeln Sie die Milz oder die drainierenden Lymphknoten als Kontrollen für die Gating-Strategie von Immunzelluntergruppen durch Durchflusszytometrie-Analyse. Folgen Sie der im Textmanuskript beschriebenen Methode der Zellisolierung.

Ein sichtbarer schwarzer Punkt der implantierten B16-F10-Zellen wurde in der Regel etwa drei Tage nach der Tumorimplantation auf der Hautoberfläche beobachtet. Die Mäuse wurden drei, sechs und neun Tage nach dem Erreichen oder Überschreiten der Größe des Tumorknotens von zwei Millimetern mit einem Tumorimpfstoff behandelt. Eine signifikante Verringerung des Tumorwachstums wurde in der geimpften Mäusegruppe etwa zwei Wochen nach der Tumorimplantation beobachtet.

Zellen, die aus der Leukozytenschicht gesammelt wurden, enthielten viele Tumorzellen, was es schwierig machte, die Lymphozytenpopulation ohne weiteres zu definieren. Daher wurden Splenozyten parallel verwendet, um intratumorale Immunzelluntergruppen in der Durchflusszytometrie zu kontrollieren. Die Gating-Strategien von CD103 positiv, CD11C positiv DC, CD8 positiv, CD4 positiv und Treg wurden zusammen mit der Kompensationsmatrix dargestellt.

Repräsentative Daten der erworbenen Konten und der Häufigkeit jeder Bevölkerung wurden ebenfalls zur Verfügung gestellt. Intratumorale CD103-positive, CD11C-positive DC von geimpften Mäusen zeigten eine signifikant erhöhte Expression des kostimulatorischen Liganden CD86. Geimpfte Mäuse zeigten auch einen Anstieg der tumorinfiltrierenden CD8-positiven und CD4-positiven, Foxp3-negativen Zellen sowie der CD8-positiven Granzym-B-positiven und Interferon-gamma-positiven CTLs.

Halten Sie einen ausreichenden Abstand zwischen dem Primärtumor und dem Tumorimpfstoff. Diese physikalische Trennung ist entscheidend, um eine mögliche Fusion zwischen den beiden Tumorimplantaten zu vermeiden.