Name: Heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-23T14:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 44 s
Description: Erfahren Sie die heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten zur Verbesserung der Überlebensraten. Diese Methode ermöglicht laminaren Blutfluss und erleichtert die postoperative Überwachung sowie die Untersuchung immunologischer Reaktionen.

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DK wird von den National Institutes of Health Grants 1P01AI116501, R01HL094601, R01HL151078, Veterans Administration Merit Review Grant 1I01BX002730 und The Foundation for Barnes-Jewish Hospital unterstützt.

Alle Verfahren zur Handhabung von Tieren wurden in Übereinstimmung mit den NIH Care and Use of Laboratory Animals Richtlinien durchgeführt und vom Animal Studies Committee der Washington University School of Medicine genehmigt. Herzen von C57BL/6 (B6) und BALB/c Mäusen (mit einem Gewicht von 20-25 g) wurden in geschlechtsspezifische B6-Empfänger (6-8 Wochen alt) transplantiert. Die Mäuse wurden aus kommerziellen Quellen gewonnen (siehe Materialtabelle). Syngene Transplantate wurden durchgeführt, um zelluläre Reaktionen im Zusammenhang mit Ischämie-Reperfusionsschäden zu bewerten, und allogene Transplantationen wurden durchgeführt, um die Immunmechanismen zu untersuchen, die an der Transplantattoleranz und -abstoßung beteiligt sind. B6 Lysozym M-grün fluoreszierendes Protein (LysM-GFP) Reportermäuse17, die ursprünglich von Klaus Ley vom La Jolla Institute for Allergy and Immunology, La Jolla, CA, erhalten und anschließend in unserer Einrichtung gezüchtet wurden, wurden als Empfänger für ausgewählte Experimente verwendet, um die Infiltration von Neutrophilen in Herztransplantate sichtbar zu machen. Die Überlebenschirurgie wurde mit aseptischen Verfahren durchgeführt.
1. Spenderverfahren
<ol><li>Betäuben Sie die Mäuse, indem Sie Ketamin (80−100 mg/kg) und Xylazin (8−10 mg/kg) (siehe Materialtabelle) intraperitoneal in die Spendermaus injizieren. Bestätigen Sie die chirurgische Anästhesieebene mit Zehen- und Schwanzklemme.</li>
	<li>Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer von Brust und Bauch rasieren.</li>
	<li>Verabreichen Sie 100 Einheiten Heparin (siehe Materialtabelle) intravenös in die Penisvene (Männer) oder die äußere Halsvene (Männer oder Frauen).</li>
	<li>Setzen Sie die Mäuse in Rückenlage mit den Vorderbeinen darüber. Sichern Sie die Vorder- und Hinterbeine mit OP-Klebeband und desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Peelings aus 0,75% Jod und 70% Ethanol.</li>
	<li>Führen Sie einen Einschnitt, mediane Laparosternotomie, vom Nabel bis zum Sternalwinkel (3-4 cm) durch, gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie entlang jedes Rippenrandes (2 cm bilateral). Falten Sie die vordere Brustwand über den Hals, um das Mediastinum vollständig freizulegen.</li>
	<li>Schneiden Sie den Thymus heraus und legen Sie die intrathorakale Vena cava inferior frei.</li>
	<li>Transekt über die Breite der Bauchaorta zur Entblutung.</li>
	<li>Für eine retrograde Perfusion injizieren Sie 1,5 ml 4 °C Kochsalzlösung in die intrathorakale Vena cava inferior, wobei die Nadel überlegen auf das Transplantat ausgerichtet ist, wie zuvor beschrieben13.</li>
	<li>Ligate die obere Hohlvene mit einem 8-0 Seidennaht und distal teilen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die retrograde Perfusion, indem Sie weitere 1,5 ml 4 °C Kochsalzlösung über die Vena cava inferior injizieren.</li>
	<li>Ligieren Sie die untere Hohlvene mit einem 8-0 Seidennaht und distal teilen.</li>
	<li>Sezieren Sie den Aortenbogen und den Lungenarterienstamm für die Transplantaternte und transektieren Sie beide distal. Ligieren Sie die Lungenvenen auf der hinteren Oberfläche des Herzens mit einer 6-0-Seidennaht und teilen Sie distal.</li>
	<li>Führen Sie die Transplantatvorbereitung durch, indem Sie das Spenderherz aus der Brusthöhle entfernen. Das herausgeschnittene Herz für 1-2 min in einen mit 4 °C heparinisierter Kochsalzlösung gefüllten Kunststoffbehälter geben. Übertragen Sie das Transplantat auf einen sterilen Kunststoffkolben, der zur Platzierung der Manschette mit Eis gefüllt ist (Abbildung 1A). HINWEIS: Das Herztransplantat muss ca. 5 Minuten auf dem Kolben bleiben, um die Lungenarterienmanschette des Spenders zu platzieren.</li>
	<li>Legen Sie eine 1 mm lange 20 G Angiokathetermanschette (siehe Materialtabelle) über die Lungenarterie für die Spendermanschette. Falten Sie die Ränder der Arterie mit einer feinen Pinzette vorsichtig über die Manschette zurück. Befestigen Sie das gefaltete Gefäß mit einer 10-0-Nylonbinderung an der Manschette, wie zuvorbeschrieben 18 (Abbildung 1B, C).</li>
	<li>Lagern Sie das Spenderherz in heparinisierter Kochsalzlösung oder einer anderen Konservierungslösung bei 4 °C. HINWEIS: Während einige bestimmte Konservierungslösungen (z. B. die Lösung der University of Wisconsin) für eine längere ischämische Konservierung bevorzugen, kann dies kostspielig sein19. Kochsalzlösung kann eine geeignete Alternative für kurze Ischämieperioden sein (<1 h)20. Letztlich hängt die Wahl der Konservierungslösung vom Versuchsplan21 ab.</li>
</ol>2. Verfahren des Empfängers
<ol><li>Injizieren Sie Ketamin (80-100 mg / kg) und Xylazin (8-10 mg / kg) intraperitoneal in die Empfängermaus zur Anästhesie. Injizieren Sie Buprenorphin mit verzögerter Freisetzung (0,5-1,0 mg/kg) subkutan zur Analgesie. Bestätigen Sie die chirurgische Anästhesieebene mit Zehen- und Schwanzklemme.</li>
	<li>Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer aus dem Halsbereich rasieren. Tragen Sie sterile, nicht medikamentöse Augensalbe auf die Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.</li>
	<li>Stellen Sie das Tier in Rückenlage, wobei die Vorderbeine neben dem Körper liegen und der Kopf leicht nach links gedreht ist. Sichern Sie die Vorder- und Hinterbeine mit chirurgischem Klebeband. Desinfizieren Sie die Haut mit drei abwechselnden Peelings von 0,75% Jod und 70% Ethanol.</li>
	<li>Machen Sie einen Mittellinienschnitt des Gebärmutterhalses vom unteren Unterkiefer bis zum Brustbein.</li>
	<li>Transektieren Sie den rechten Musculus sternocleidomastoideus. Schneiden Sie den rechten Lappen der Unterkieferdrüse heraus, um Platz für die Transplantatimplantation zu schaffen.</li>
	<li>Binden Sie einen Slipknot über die proximale äußere Halsvene mit einer 6-0-Seidennaht. Ligieren Sie die distale äußere Jugularvene und die angrenzenden Äste mit einem 8-0 Seidennaht. Machen Sie einen Querschnitt über die Vorderwand der äußeren Halsvene.</li>
	<li>Platzieren Sie eine 10-0-Nylonnaht durch den Rand der proximalen äußeren Jugularvene und das darunter liegende Gewebe, um die Vene während des Einführens der Manschette zu sichern (Abbildung 1D).</li>
	<li>Ligieren Sie die distale rechte Halsschlagader mit einem 8-0 Seidennaht knapp schlechter als die Karotisbifurkation. Binden Sie einen Slipknot über die proximale gemeinsame Halsschlagader mit einer 6-0-Seidennaht. Transektieren Sie die Arterie distal zwischen den Nähten.</li>
	<li>Legen Sie ähnlich wie bei der Spendermanschette eine 0,6 mm lange 24 G Angiokathetermanschette über die rechte gemeinsame Halsschlagader des Empfängers. Falten Sie die Ränder der Arterie mit einer feinen Pinzette vorsichtig über die Manschette zurück. Befestigen Sie das gefaltete Gefäß mit einer 10-0-Nylonbinde an der Manschette.</li>
	<li>Platzieren Sie das Spenderherz oberhalb des rechten Halsbereichs.</li>
	<li>Tropfen Sie während der Implantation alle paar Minuten kalte Kochsalzlösung auf das Herztransplantat.</li>
	<li>Platzieren Sie eine 10-0-Nylonnaht durch den Rand der Spenderaorta und durch einen oberflächlichen Biss des darunter liegenden Gewebes, um das Transplantat an Ort und Stelle zu sichern (Abbildung 1E).</li>
	<li>Spülen Sie die Spenderaorta mit 0,5 ml 0,9% heparinisierter Kochsalzlösung.</li>
	<li>Führen Sie die allgemeine Halsschlagadermanschette des Empfängers in die Spenderaorta ein. Sichern Sie die Anastomose mit einem 8-0 Seidenkrawatte (Abbildung 1F). Entfernen Sie die Aortenankernaht.</li>
	<li>Entlüften Sie die äußere Jugularvene, indem Sie die äußere Jugularvene des Empfängers mit 0,5 ml 0,9% heparinisierter Kochsalzlösung spülen.</li>
	<li>Führen Sie eine Lungenarterienanastomose durch, indem Sie die Lungenarterienmanschette des Spenders in die äußere Halsvene des Empfängers einführen und mit einem 8-0 sichern Seidenkrawatte (Abbildung 1G). Entfernen Sie die äußere Jugularvenesankernaht und transektieren Sie die verbleibende hintere Wand der äußeren Jugularvene, um das Transplantat aus dem darunter liegenden Gewebe zu befreien. Stellen Sie sicher, dass das Transplantat richtig ausgerichtet ist, ohne die Anastomosen zu verknicken oder zu verdrehen.</li>
	<li>Lösen Sie die Slipknots an der äußeren Halsvene des Empfängers, gefolgt von der gemeinsamen Halsschlagader, um die Reperfusion des Herztransplantats einzuleiten (Abbildung 1H).</li>
	<li>Schließen Sie den zervikalen Hautschnitt mit einer unterbrochenen 6-0-Nylonnaht.</li>
</ol>3. Nachsorge
<ol><li>Setzen Sie den Empfänger unmittelbar nach der Operation in eine warme Aufwachkammer und überwachen Sie ihn genau, bis er sich vollständig von der Narkose erholt hat (ca. 1 h).</li>
	<li>Überwachen Sie das Tier weiterhin (alle 6-8 Stunden) mindestens 72 Stunden nach der Operation auf Anzeichen von abnormalem Verhalten wie Lethargie, Zittern, schneller Atmung oder Anorexie.</li>
	<li>Zur Schmerzkontrolle injizieren Sie Carprofen (5 mg/kg) subkutan alle 8-12 h zur Analgesie, zusätzlich zu subkutanem Buprenorphin (0,05 mg/kg) alle 8-12 h für 24-48 h ab Ende der Operation.</li>
</ol>4. Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung des Leukozytentransports im Herztransplantat
<ol><li>Injizieren Sie Ketamin (80-100 mg/kg) und Xylazin (8-10 mg/kg) intraperitoneal in eine B6 LysM-GFP-Empfängermaus17 2 h nach der Transplantatreperfusion zur Anästhesie.</li>
	<li>Führen Sie eine orotracheale Intubation mit einem 20-G-Angiokatheter durch, wie zuvor beschrieben18.</li>
	<li>Verbinden Sie den Angiokatheter mit einem Schläuch eines mechanischen Mausbeatmungsgeräts und lüften Sie mit Raumluft mit einer Rate von 120 Atemzügen / min und einem Tidalvolumen von 0,5 ml18.</li>
	<li>Injizieren Sie 12 μL 655 nm nicht-zielgerichtete Quantenpunkte (siehe Tabelle der Materialien), suspendiert in 50 μL PBS intravenös, wie zuvorbeschrieben 13.</li>
	<li>Öffnen Sie den Halsschnitt erneut, um das Herztransplantat freizulegen. Setzen Sie die Maus in eine Stabilisierungskammer.</li>
	<li>Sichern Sie einen Teil der freien Wand des linken Ventrikels mit einem dünnen Ring aus Gewebekleber (siehe Materialtabelle), der auf ein Glasdeckglas aufgetragen wird, das an der oberen Kammerplatte befestigt ist.</li>
	<li>Platzieren Sie die Kammer unter dem Zwei-Photonen-Mikroskop-Objektiv, um Bilder und Videos aufzunehmen, wie zuvorbeschrieben 13.</li>
</ol>

<ol><li>Abbott, C. P., Lindsey, E. S., Creech, O., Dewitt, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+technique+for+heart+transplantation+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22The+Archives+of+Surgery%22%5BJournal%5D)">A technique for heart transplantation in the rat.</a> The Archives of Surgery. 89, 645-652 (1964).</li>
<li>Ono, K., Lindsey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+technique+of+heart+transplantation+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Thoracic+and+Cardiovascular+Surgery%22%5BJournal%5D)">Improved technique of heart transplantation in rats.</a> The Journal of Thoracic and Cardiovascular Surgery. 57 (2), 225-229 (1969).</li>
<li>Corry, R. J., Winn, H. J., Russell, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heart+transplantation+in+congenic+strains+of+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Transplantation+Proceedings%22%5BJournal%5D)">Heart transplantation in congenic strains of mice.</a> Transplantation Proceedings. 5 (1), 733-735 (1973).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mit dieser Technik kann die heterotope zervikale Herztransplantation der Maus in weniger als 40 Minuten von einem erfahrenen Mikrochirurgen und in etwa 60 Minuten von einem Einsteiger-Mikrochirurgen durchgeführt werden. Während die zervikale Herztransplantation in zahlreichen Tiermodellen untersucht wurde, bleibt ein Mausmodell aufgrund mehrerer gut definierter genetischer Stämme, genetischer Veränderungsfähigkeiten und der Verfügbarkeit zahlreicher Reagenzien, einschließlich monoklonaler Antikörper, der Goldstandard.<su...

Abbott et al. veröffentlichten 1964 die erste Beschreibung der heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Ratten. Diese Operationstechniken wurden 1969 von Ono et al. verfeinert und vereinfacht2. Corry et al. beschrieben erstmals 1973 eine Methode zur heterotopen abdominalen Herztransplantation bei Mäusen; Ähnlich wie bei den zuvor berichteten Rattenmodellen beinhaltete dies eine Anpflanzung in den Bauch des Wirts mit Revaskularisierung durch End-to-Side-Anastomosen der Lungenarterie des Spenders und aufsteigende Aorta zur unteren Vena cava bzw. Bauchaorta des Empfängers3. Die heterotope zervikale Herztransplantation bei Ratten wurde 1971 von Heron unter Verwendung von Teflonmanschetten aus 16 G (1,6 mm Außendurchmesser) intravenösen Kathetern beschrieben4. Chen5 und Matsuura et al.6 berichteten 1991 über eine heterotope zervikale Herztransplantation bei Mäusen, deren Techniken sich hauptsächlich in ihrer Methode der Re-Anastomose unterschieden. Chens Ansatz beinhaltete Nähte von Anastomosen der aufsteigenden Aorta des Spenders an die Halsschlagader des Empfängers und die Lungenarterie des Spenders an die äußere Halsvene des Empfängers5. Aufgrund der fortgeschrittenen technischen Fähigkeiten, die für diese mikrochirurgischen Nahtanastomosen erforderlich sind, war ein erheblicher Zeit- und Erfahrungsaufwand erforderlich, um eine hohe Erfolgsquote zu erzielen. Matsuura et al. beschrieben eine Methode, die eine nicht nahtlose Manschettentechnik verwendet, ähnlich der von Heron, die End-to-End-Anastomosen mit der extra-luminalen Platzierung von Manschetten beinhaltete. Er fertigte Teflonmanschetten aus 22 G (0,8 mm Außendurchmesser) und 24 G (0,67 mm Außendurchmesser) intravenösen Kathetern und platzierte sie über der äußeren Halsschlagader des Empfängers bzw.der Arteria carotis communis 6. Diese Manschetten wurden dann in die Lungenarterie und Aorta des Spenders gelegt und durch Binden einer Nahtligatur um die Verbindung gesichert. Dieser Ansatz führte zu einer verbesserten Erfolgsquote. Am wichtigsten war, dass es zu einer Verkürzung der Zeit führte, die benötigt wurde, um beide zervikalen Anastomosen zu vervollständigen, wodurch die warme ischämische Zeit des Transplantats auf weniger als ein Drittel derjenigen mit der Bauchnahtmethode reduziert wurde. Da die Manschetten um die äußere Oberfläche des Gefäßes gelegt werden, ist außerdem kein Fremdkörper dem Gefäßlumen ausgesetzt, was die Möglichkeit einer Thrombose nach der Operation weitgehend reduziert7. In der Zwischenzeit bietet die Verwendung der Manschettentechnik Unterstützung um die Gefäße an der Stelle der Anastomose, ohne dass eine Naht erforderlich ist, was das Risiko von Blutungen nach der Revaskularisation verringert6.
Zahlreiche Überarbeitungen dieser Technik wurden vorgeschlagen. Um der kurzen Länge der gewöhnlichen Halsschlagader der Maus (ca. 5 mm) gerecht zu werden, entwickelten Tomita et al.8 eine Modifikation dieser Technik mit einer kleineren arteriellen Manschette (0,6 mm Außendurchmesser), wobei auf Haltenähte verzichtet wurde und die Arterie stattdessen mit einer feinen Pinzette direkt durch die Manschette gezogen wurde. Wang et al. vereinfachten diesen Ansatz weiter, indem sie 22 G- und 24 G-Manschetten auf die rechte Lungenarterie des Spenders bzw. die rechte gemeinsame Halsschlagader des Empfängers legten9. Verschiedene Berichte haben Änderungen an diesen Ansätzen beschrieben, einschließlich der Verwendung von speziellen Manschetten, mikrochirurgischen Klemmen, Gefäßdilatatoren und Kardioplegie10,11,12. Bemerkenswerterweise beinhalten alle diese Methoden die retrograde Zirkulation von Blut durch das Herz, wobei Blut von der gemeinsamen Halsschlagader des Empfängers zur Spenderaorta, den Koronararterien und dem Koronarsinus fließt, sich dann in den rechten Vorhof entleert und aus der Lungenarterie in die externe Jugularvene des Empfängers austritt.
Im Vergleich zur Anpflanzung im Bauchraum bietet die zervikale Herztransplantation mehrere Vorteile. Wie bereits erwähnt, ermöglicht die zervikale Exposition eine schnellere Revaskularisation und kürzere warme ischämische Zeiten6. Die zervikale Methode ist auch weniger invasiv und ist mit kürzeren postoperativen Erholungszeiten verbunden, da sie eine Laparotomie vermeidet6. Wichtig ist, dass End-to-End-Anastomosen mit Manschetten anstelle von Ende-zu-Seite-Anastomen durchgeführt werden können, was das Risiko von Komplikationen wie anastomotischen Blutungen verringert. Der abdominale Ansatz stellt auch ein erhöhtes Risiko für thrombotische Komplikationen in der Bauchaorta oder der unteren Hohlvene dar, was zu Rückenmarksischämie und Hintergliedmaßenlähmung führt. Die oberflächliche zervikale Lage des Transplantats ermöglicht einen einfachen Zugang zur Beurteilung der Transplantatlebensfähigkeit durch Palpation, Elektrokardiographie und invasive oder nicht-invasive Bildgebung. Obwohl die zervikalen Transplantate nach der Reperfusion die spontane Herzaktivität wieder aufnehmen, haben sie keinen signifikanten Einfluss auf die systolischen und diastolischen Parameter des Empfängers. Dieses Modell liefert wertvolle Erkenntnisse für die Untersuchung zellulärer Reaktionen nach Transplantationen, wie Ischämie-Reperfusionsverletzungen und Transplantatabstoßung. Darüber hinaus bietet dieses Modell einen idealen Ansatz für die Bildgebung nach der Transplantation, wie intravitale Zwei-Photonen-Mikroskopie oder Positronen-Emissions-Tomographie (PET). Zu diesem Zweck hat unser Labor zuvor Methoden zur Abbildung von bewegten Geweben und Organen in der Maus berichtet, einschließlich schlagender Mausherzen und Aortenbogentransplantate nach heterotoper zervikaler Transplantation, um den Leukozytentransport während einer Ischämie-Reperfusionsverletzung und innerhalb atherosklerotischer Plaques zu visualisieren 13,14,15 . Darüber hinaus eignet sich dieses Modell aufgrund seiner oberflächlichen Lage und leichten Exposition für die kardiale Retransplantation16.
Dieser Bericht beschreibt eine Technik, die einen laminaren Blutfluss mit der äußeren Platzierung der Gefäßmanschetten an den Gefäßen ermöglicht, aus denen der Blutfluss stammt. Dies ermöglicht einen reibungslosen Übergang des Blutflusses von einem Gefäß zum nächsten und vermeidet die Freilegung des distalen Gefäßrandes in das Gefäßlumen. Darüber hinaus verwendet die Technik eine größere 20-G-Manschette anstelle der zuvor verwendeten 22-G-Manschetten für die Spenderpulmonalarterie, um eine ausreichende Rückkehr des Blutflusses zum Empfänger zu gewährleisten.

<table><tbody><tr><td>6-0 geflochtene Seidenkrawatten</td><td>Henry Schein Inc</td><td>7718729</td><td></td></tr><tr><td>0,75% ProProviden-Iosin-Peeling</td><td>Priority Care Inc</td><td>NDC 57319-327-0</td><td></td></tr><tr><td>10-0 Nylon-Naht</td><td>Surgical Specialties Corporation</td><td>AK-0106</td><td></td></tr><tr><td>655-nm nicht zielgerichtete Q-Dots</td><td>Invitrogen</td><td>Q21021MP</td><td></td></tr><tr><td>70% Ethanol</td><td>Pharmco Products Inc</td><td>111000140</td><td></td></tr><tr><td>8-0 geflochtene Seidenkrawatten</td><td>Henry Schein Inc</td><td>1005597</td><td></td></tr><tr><td>Adson-Zange</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91127-12</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c und C57BL/6 Mäuse (6-8 Wochen)</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bipolarer Gerinnungskoagulator</td><td>Valleylab Inc</td><td>SurgII-20, E6008/E6008B</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl) Injektion</td><td>Transpharm</td><td>35844</td><td></td></tr><tr><td>Carprofen (Rimadyl) Kautablette zum Einnehmen</td><td>Transpharm</td><td>38995/37919</td><td></td></tr><tr><td>Speziell angefertigtes 2P-Mikroskop mit ImageWarp-Erfassungssoftware</td><td>A& B Software</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dumont Nr. 5 Pinzette</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Feine Federschere im Vannas-Stil</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 5.0</td><td>Sun Microsystems Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Halsey Nadelhalter</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91201-13</td><td></td></tr><tr><td>Halsted-Moskito-Klemme gebogene Spitze</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>91309-12</td><td></td></tr><tr><td>Harvard Apparatus Maus Beatmungsgerät Modell 687</td><td>Harvard Apparatus</td><td>MA1 55-0001</td><td></td></tr><tr><td>Heparinlösung (100 U/ml)</td><td>Abraxis Pharmaceutical Products</td><td>504031</td><td></td></tr><tr><td>Imaris</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ketamin (50 mg/kg)</td><td>Wyeth</td><td>206205-01</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop&mdash; Leica Wild M651 & Zeiten; 6&ndash; 40 Vergrößerung</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Moria extra feine Federschere</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>15396-00</td><td></td></tr><tr><td>Ohio Isofluran Verdampfer</td><td>Parkland Scientific</td><td>V3000i</td><td></td></tr><tr><td>Qdots</td><td>ThermoFisher</td><td>1604036</td><td></td></tr><tr><td>S& T SuperGrip Pinzette mit abgewinkelter</td><td>Spitze Fine Science Tools Inc</td><td>00649-11</td><td></td></tr><tr><td>S& S & T SuperGrip Pinzette mit gerader Spitze</td><td>Fine Science Tools Inc</td><td>00632-11</td><td></td></tr><tr><td>Sterile normale Kochsalzlösung (0,9 % (wt/vol) Natriumchlorid</td><td>Hospira Inc</td><td>NDC 0409-4888-20</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Wattestäbchen (konische Mini-Wattespitze 3-Zoll-Applikatoren)</td><td>Puritan Medical Company LLC</td><td>823-WC</td><td></td></tr><tr><td>Surflow 20 Gauge 1/4-Zoll Teflon-Angiokatheter</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>SR-OX2032CA</td><td></td></tr><tr><td>Surflow 24 Gauge 3/4-Zoll Teflon-Angiokatheter</td><td>Terumo Medical Corporation</td><td>R-OX2419CA</td><td></td></tr><tr><td>ThermoCare Kleintier-Intensivstation (Erholungseinstellungen 3 L/min O2, 80 &deg; C, 40% Luftfeuchtigkeit)</td><td>Thermocare Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VetBond</td><td>Santa Cruz Biotechnology SC361931</td><td>NC0846393</td><td></td></tr><tr><td>Xylazin (10 mg/kg)</td><td>Lloyd Laboratories</td><td>139-236</td><td></td></tr></tbody></table>

heterotope zervikale herztransplantation der maus mit gefäßmanschetten

Mouse Heterotopic Cervical Cardiac Transplantation Utilizing Vascular Cuffs

Murine Modelle der Herztransplantation werden häufig verwendet, um Ischämie-Reperfusionsverletzungen, angeborene und adaptive Immunantworten nach Transplantation und den Einfluss immunmodulatorischer Therapien auf die Transplantatabstoßung zu untersuchen. Die heterotope zervikale Herztransplantation bei Mäusen wurde erstmals 1991 mit genähten Anastomosen beschrieben und anschließend modifiziert, um Manschettentechniken einzubeziehen. Diese Änderung ermöglichte verbesserte Erfolgsquoten, und seitdem gab es mehrere Berichte, die weitere technische Verbesserungen vorgeschlagen haben. Die Translation in eine breitere Anwendung bleibt jedoch aufgrund der technischen Schwierigkeiten im Zusammenhang mit Transplantatanastomosen begrenzt, die Präzision erfordern, um eine angemessene Länge und ein angemessenes Kaliber der Manschetten zu erreichen, um vaskuläre anastomotische Verdrehungen oder übermäßige Spannungen zu vermeiden, die zu Schäden am Transplantat führen können. Das vorliegende Protokoll beschreibt eine modifizierte Technik zur Durchführung einer heterotopen zervikalen Herztransplantation bei Mäusen, bei der Manschetten an der gemeinsamen Halsschlagader des Empfängers und der Lungenarterie des Spenders in Übereinstimmung mit der Richtung des Blutflusses platziert werden.

Dieses heterotopische Herztransplantationsmodell der Maus wurde verwendet, um über 1.000 Transplantationen in unserem Labor mit einer Überlebensrate von etwa 97% durchzuführen. Die Erfolgsrate ist etwas höher als frühere Berichte mit anderen zervikalen heterotopen Herztransplantationstechniken bei Mäusen10,11,20. Dies könnte möglicherweise auf die größere 20-G-Manschette zurückzuführen sein, die an der Spenderpulmonalarterie pla...

Maus-Herztransplantationsmodelle stellen wertvolle Forschungswerkzeuge für die Untersuchung der Transplantationsimmunologie dar. Das vorliegende Protokoll beschreibt die heterotope zervikale Herztransplantation der Maus, bei der Manschetten auf die gemeinsame Halsschlagader des Empfängers und den Lungenarterienstamm des Spenders gelegt werden, um einen laminaren Blutfluss zu ermöglichen.

Heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten

Murine models of cardiac transplantation are frequently utilized to study ischemia-reperfusion injury, innate and adaptive immune responses after ...

Unsere Gefäßmanschette ermöglicht einen laminaren Blutfluss und wir verwenden eine größere Manschette für die Spenderpulmonalarterie, um eine ausreichende Blutrückführung zu den Empfängern zu gewährleisten. Diese in diesem Protokoll verwendeten Modifikationen verringern die Wahrscheinlichkeit eines turbulenten Blutflusses und der Thrombusbildung und führen zu verbesserten Überlebensraten. Diese Methode liefert wertvolle Erkenntnisse für die Untersuchung von Immunantworten nach Transplantationen wie Ischämie-Reperfusionsverletzungen und Transplantatabstoßung.Darüber hinaus ermöglicht unsere Technik eine einfachere Überwachung oder Retransplantation nach der Transplantation. Dieses Verfahren wird von Dr. Wen Jun Li demonstriert, einem erfahrenen Mikrochirurgen in unserem Labor, der diese Technik entwickelt hat. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer von Brust und Bauch rasieren.Verabreichen Sie 100 Einheiten Heparin intravenös in die Penisvene für Männer oder externe Jugularvene für Männer und Frauen. Setzen Sie die Mäuse in Rückenlage mit den Vorderbeinen darüber. Sichern Sie die Vorder- und Hinterbeine mit chirurgischem Klebeband und desinfizieren Sie die Haut mit 0,75% Jod und 70% Ethanol.Führen Sie einen Schnitt für die mediane Laparosternotomie vom Nabel bis zum Sternalwinkel durch, gefolgt von einer bilateralen Thorakotomie entlang jedes Rippenrands. Falten Sie die vordere Brustwand über den Hals, um das Mediastinum vollständig freizulegen. Schneiden Sie den Thymus heraus und legen Sie die intrathorakale Vena cava inferior frei.Für eine retrograde Perfusion injizieren Sie 1,5 Milliliter von vier Grad Celsius Kochsalzlösung in die intrathorakale untere Hohlvene, wobei die Nadel überlegen auf das Transplantat ausgerichtet ist. Ligate die obere Hohlvene mit einem 8-0 Seidennaht und distal teilen. Wiederholen Sie die retrograde Perfusion, indem Sie weitere 1,5 Milliliter vier Grad Celsius Kochsalzlösung über die untere Hohlvene injizieren.Ligieren Sie die untere Hohlvene mit einem 8-0 Seidennaht und distal teilen. Sezieren Sie den Aortenbogen und den Lungenarterienstamm für die Transplantaternte und transektieren Sie beide distal. Ligieren Sie die Lungenvenen auf der hinteren Oberfläche des Herzens mit einer 6-0-Seidennaht und teilen Sie distal.Führen Sie die Transplantatvorbereitung durch, indem Sie das Spenderherz aus der Brusthöhle entfernen. Legen Sie das herausgeschnittene Herz für ein bis zwei Minuten in einen Plastikbehälter, der mit vier Grad Celsius heparinisierter Kochsalzlösung gefüllt ist. Übertragen Sie das Transplantat auf einen sterilen Kunststoffkolben, der zur Platzierung der Manschette mit Eis gefüllt ist.Legen Sie eine einen Millimeter lange 20-Gauge-Angiokathetermanschette über die Lungenarterie für die Spendermanschette. Falten Sie die Ränder der Arterie mit einer feinen Pinzette vorsichtig über die Manschette zurück. Befestigen Sie das gefaltete Gefäß mit einer 10-0-Nylonbinde an der Manschette.Lagern Sie das Spenderherz in heparinisierter Kochsalzlösung oder einer anderen Konservierungslösung bei vier Grad Celsius. Bereiten Sie den Operationsbereich vor, indem Sie die Haare mit einem elektrischen Rasierer aus dem Halsbereich rasieren. Tragen Sie sterile, nicht medikamentöse Augensalbe auf die Augen auf, um das Austrocknen der Hornhaut zu verhindern.Stellen Sie das Tier in Rückenlage, wobei die Vorderbeine neben dem Körper liegen und der Kopf leicht nach links gedreht ist. Sichern Sie die Vorder- und Hinterbeine mit chirurgischem Klebeband. Desinfizieren Sie die Haut mit 0,75% Jod und 70% Ethanol.Nach einem Mittellinienschnitt des Gebärmutterhalses vom unteren Unterkiefer zum Brustbein transektieren Sie den rechten Musculus sternocleidomastoideus. Schneiden Sie den rechten Lappen der Unterkieferdrüse heraus, um Platz für die Transplantatimplantation zu schaffen. Binden Sie einen Slipknot über die proximale äußere Halsvene mit einer 6-0-Seidennaht.Ligieren Sie die distale äußere Jugularvene und die angrenzenden Äste mit einem 8-0 Seidennaht. Vernähen Sie unter der Vene und bedecken Sie sie mit Gaze. Machen Sie einen Querschnitt über die Vorderwand der äußeren Halsvene.Legen Sie eine 10-0-Nylonnaht durch den Rand der proximalen äußeren Jugularvene und das darunter liegende Gewebe, um die Vene während des Einführens der Manschette zu sichern. Ligieren Sie die distale rechte Halsschlagader mit einem 8-0 Seidennaht knapp schlechter als die Karotisbifurkation. Binden Sie einen Slipknot über die proximale gemeinsame Halsschlagader mit einer 6-0-Seidennaht.Transektieren Sie die Arterie distal zwischen den Nähten. Legen Sie dann eine 0,6 Milliliter lange 24-Gauge-Angiokathetermanschette über die rechte Halsschlagader des Empfängers. Falten Sie die Ränder der Arterie mit einer feinen Pinzette vorsichtig über die Manschette zurück.Befestigen Sie das gefaltete Gefäß mit einer 10-0-Nylonbinde an der Manschette. Platzieren Sie das Spenderherz oberhalb des rechten Halsbereichs. Tropfen Sie während der Implantation alle paar Minuten kalte Kochsalzlösung auf das Herztransplantat.Legen Sie eine 10-0-Nylonnaht durch den Rand der Spenderaorta und durch einen oberflächlichen Biss des darunter liegenden Gewebes, um das Transplantat an Ort und Stelle zu sichern. Spülen Sie die Spenderaorta mit 0,5 Milliliter 0,9% heparinisierter Kochsalzlösung. Führen Sie die allgemeine Halsschlagadermanschette des Empfängers in die Spenderaorta ein.Sichern Sie die Anastomose mit einem 8-0 Seidenkrawatte. Entfernen Sie die Aortenankernaht. Entlüften Sie die äußere Halsvene, indem Sie die äußere Halsvene des Empfängers mit 0,5 Milliliter 0,9% heparinisierter Kochsalzlösung spülen.Führen Sie eine Lungenarterienanastomose durch, indem Sie die Lungenarterienmanschette des Spenders in die äußere Halsvene des Empfängers einführen und mit einem 8-0 sichern Seidenkrawatte. Entfernen Sie die äußere Jugularvenesankernaht und transektieren Sie die verbleibende hintere Wand der äußeren Jugularvene, um das Transplantat aus dem darunter liegenden Gewebe zu befreien. Stellen Sie sicher, dass das Transplantat richtig ausgerichtet ist, ohne die Anastomose zu verknicken oder zu verdrehen.Lösen Sie die Slipknots an der äußeren Halsvene des Empfängers, gefolgt von der gemeinsamen Halsschlagader, um die Reperfusion des Herztransplantats einzuleiten. Die in diesem Protokoll demonstrierte Technik zeigte eine Überlebensrate von etwa 97%Dies könnte möglicherweise auf die größere 20-Gauge-Manschette zurückzuführen sein, die an der Spenderpulmonalarterie platziert wurde, um eine ausreichende Rückkehr des Blutflusses zum Empfänger zu gewährleisten. Darüber hinaus minimiert die Ausrichtung des Blutflusses auf die Manschettenplatzierung in der vorliegenden Technik das Risiko von Thrombosen und anastomotischen Turbulenz.Die mittlere Empfängeroperationszeit betrug etwa 37 Minuten mit einer durchschnittlichen Erkältungsischämiezeit von 20 Minuten. Für Überlebensstudien wurden Herztransplantate täglich durch direkte Visualisierung und digitale Palpation des Herzschlags beurteilt. Intravitale Zwei-Photonen-Bildgebung wurde früh nach der Transplantation durchgeführt, um den Leukozytentransport zu bewerten.Es ist wichtig zu überprüfen, ob das Transplantat vor dem Hautverschluss richtig positioniert und ausgerichtet ist, um ein Verdrehen zu vermeiden. Diese Methode kann in Retransplantationsmodellen verwendet werden, um residente Immunzellen in transplantierten Transplantaten zu identifizieren, die alloimmune Reaktionen vermitteln.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Die murine Gebärmutterhalskrebs Herztransplantation Modell ist für immunologische sowie Ischämie Reperfusionsschaden Studien gut geeignet. Wir modifizierten das Verfahren mit einem nicht-Nahttechnik und Manschette durchgeführt mehr als 1.000 erfolgreiche Transplantationen mit diesem Ansatz.  Hier stellen wir weitere Einzelheiten dieser Technik, um das Video zu ergänzen.

Murine Cervical Herztransplantation Modell mithilfe eines modifizierten Cuff-Technik

Die Manschettentechnik verkürzt und erleichtert das Modell der heterotopen zervikalen Herztransplantation bei Mäusen, indem technisch anspruchsvolle Nahtanastomosen kleiner Gefäße vermieden werden. Die technischen Details, die in diesem Videopapier gezeigt werden, sollten es Forschern ermöglichen, dieses Modell in ihren Labors zu etablieren.

Heterotope Cervical Herztransplantation bei Mäusen

Hier stellen wir ein Protokoll der heterotopischen Aortentransplantation bei Mäusen mit der Nicht-Naht-Manschettentechnik in einem zervikalen Murin-Modell vor. Dieses Modell kann verwendet werden, um die zugrunde liegende Pathologie der chronischen Allograft-Vaskulopathie (CAV) zu untersuchen und kann helfen, neue therapeutische Wirkstoffe zu bewerten, um ihre Bildung zu verhindern.

Murine Cervical Aortic Transplantation Modell mit einer modifizierten Non-Suture Manschettentechnik

Wir führen einen inneren Röhrenansatz zur Manschettentechnik für die heterotopische Herztransplantation der Maus ein, um das Gefäß über die Manschette zu bringen. Wir stellten fest, dass die Zusammenarbeit zwischen zwei erfahrenen Chirurgen die Operationszeit deutlich verkürzt.

Optimierung der Manschettentechnik für DieMurine Heart Transplantation

Im vorliegenden Protokoll wird ein Maus-Herztransplantationsmodell verwendet, um den Mechanismus der kardialen Allotransplantatabstoßung zu untersuchen. In diesem heterotopen Herztransplantationsmodell wird die Operationseffizienz verbessert und das Überleben von Herztransplantaten durch eine zervikale End-to-End-Anastomose der Herzimplantation unter Verwendung einer modifizierten Manschettentechnik sichergestellt.

Eine modifizierte Manschettentechnik für das zervikale heterotope Herztransplantationsmodell der Maus

Dieses Protokoll enthält technische Informationen für die Gefäßrekonstruktion mit der Manschettentechnik bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus.

Gefäßrekonstruktion mit der Manschettentechnik bei der orthotopen Lebertransplantation der Maus

Dieses Protokoll stellt eine manschettenfreie, nahtbasierte heterotope zervikale Herztransplantationstechnik bei Mäusen vor, die darauf ausgelegt ist, die zuverlässige Platzierung eines zweiten heterotopen Herztransplantats zur Bewertung der donorspezifischen Immuntoleranz unter physiologischen Bedingungen mit minimaler Interferenz durch Fremdmaterial zu ermöglichen.

Manschettenfreies, nahtbasiertes zervikales Modell für sekundäre heterotopische Herztransplantation zur Bewertung der spenderspezifischen Immuntoleranz bei Mäusen

Dieses Protokoll präsentiert eine vereinfachte, end-zu-seitige Nahtanastomose-Technik für die Zervikalherztransplantation der Maus und bietet ein robustes und reproduzierbares Modell zur Untersuchung der Transplantationsimmunologie.

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Hier beschreiben wir die orthotopen Ratten-Hinterteil des Körpers Transplantation Verfahren, das an den Goldstandard zu sein...

Orthotopen Hind-Limb Transplantation in Ratten

Diese Methode zur Isolierung von funktionellen Immunzellen aus dem Herzen stellt eine Alternative zu den herkömmlichen Methoden der Kollagenaseverdau, die unerwünschten Immun-Zell-Aktivierung verursacht, was zu einer verminderten Reaktionsfähigkeit dieser Zellen. Unsere Methode der Isolierung ergibt funktionelle Herz-Immunzellen durch die Vermeidung von Problemen mit enzymatische Verdauung.

Isolierung von Functional Cardiac Immune Cells

Erfahren Sie die heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten zur Verbesserung der Überlebensraten. Diese Methode ermöglicht laminaren Blutfluss und erleichtert die postoperative Überwachung sowie die Untersuchung immunologischer Reaktionen.

Heterotope zervikale Herztransplantation der Maus mit Gefäßmanschetten

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