Rekonstitution von Septin-Assemblierungen an Membranen zur Untersuchung biophysikalischer Eigenschaften und Funktionen

Dieses Protokoll wird denjenigen, die an membranbindenden Proteinen arbeiten, helfen, zu bestimmen, wie die Membranform eine Rolle bei der Organisation von Proteinanordnungen spielt. Der Hauptvorteil dieser Technik ist ihre Vielseitigkeit für Proteintyp, Membranzusammensetzung und Membrangeometrie. Es ermöglicht auch die Frage, wie eine Lipiddoppelschicht die Eigenschaften assoziierter Proteine verändern kann.

Um eine gute Membran für das Experiment zu identifizieren, schlagen wir vor, eine Checkliste zu erstellen, die die Lipiddiffusionsraten, die Mobilität des interessierenden Proteins und die Frage, ob ungeplatzte Liposomen oder verschmolzene Liposomen an der Oberfläche haften, enthalten könnte. Um mit der Plasmareinigung der Objektträger zu beginnen, reinigen Sie den Plasmareiniger fünf Minuten lang mit Sauerstoff, um Luft aus den Leitungen und der Kammer zu entfernen. Ordnen Sie die Objektträger aus trockenem Deckglas in einer Keramikwiege an.

Strömen Sie während des Spülens ein Inertgas über die Mikrodeckglasobjektträger, um Staub und Partikel zu entfernen. Platzieren Sie die Wiege an der Rückseite der Plasmakammer so, dass die Deckgläser parallel zum langen Rand der Kammer sind. Lassen Sie den Plasmareiniger 15 Minuten lang mit Sauerstoff bei maximaler Leistung laufen.

Für die Kammervorbereitung schneiden Sie die Kappe knapp unter dem mattierten Teil eines 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchens ab. Bemalen Sie den Rand der PCR-Röhre mit UV-aktiviertem Klebstoff, um das Innere des Röhrchens zu vermeiden. Legen Sie den PCR-Röhrchenkleber vorsichtig in die Mitte eines plasmagereinigten Deckglases und stellen Sie die Kammer dann fünf bis sieben Minuten lang unter langwelliges UV-Licht, um den Klebstoff auszuhärten.

Um eine Doppelschicht zu bilden, fügen Sie die Reagenzien in die Vertiefung hinzu. Schütteln Sie die Kammern vorsichtig von einer Seite zur anderen, um die SUVs zu stören, und inkubieren Sie dann 20 Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Nach der Inkubation spülen Sie die Doppelschicht sechsmal mit 150 Mikrolitern SLBB durch Pipettieren, um überschüssige Lipide wegzuwaschen, dann waschen Sie die Doppelschicht sechsmal mit 150 Mikrolitern Reaktionspuffer, bevor Sie mit den Septinen inkubieren.

Entfernen Sie im letzten Waschschritt den Reaktionspuffer und lassen Sie 75 Mikroliter im Bohrloch. Fügen Sie 25 Mikroliter Septine in SSB verdünnt hinzu und Bild durch TIRF-Mikroskopie. Zuerst die Flasche mit Siliziumdioxid-Mikrosphären für 15 Sekunden vorstruken, dann eine Minute lang beschallen und erneut 15 Sekunden lang wirbeln, um alle Cluster zu brechen.

Mischen Sie die Perlen mit SLBB und 10 Mikrolitern von fünf Millimolar-SUVs in einem Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Adhäsion. Inkubieren Sie die Perllipidmischung für eine Stunde bei Raumtemperatur auf einem Shaker, um eine Sedimentation zu verhindern. In der Zwischenzeit tauen Sie ein pegyliertes Deckglas auf und kleben ein geschnittenes 0,2-Milliliter-PCR-Röhrchen darauf.

Nach der Inkubation zentrifugieren Sie die Perlen für 30 Sekunden am vorgesehenen RCF. Nach dem ersten Spin 50 Mikroliter Überstand entfernen, dann 200 Mikroliter PRB hinzufügen und durch kräftiges Pipettieren mischen. Für die nächsten Runden 200 Mikroliter PRB entfernen und nach dem zweiten und dritten Spin weitere 200 Mikroliter und nach dem vierten Spin 220 Mikroliter PRB hinzufügen.

Wenn Sie einen Wettkampftest mit mehreren Kugelgrößen durchführen, bereiten Sie die Reaktion vor, indem Sie gleiche Volumina jeder Kugelgröße mischen und 29 Mikroliter dieser Perlenmischung mit 721 Mikrolitern Reaktionspuffer verdünnen, dann 75 Mikroliter verdünnte Kügelchen und 25 Mikroliter des in SSB verdünnten Proteins in die Vertiefungen geben und mischen. Wenn Sie Septine im stationären Zustand messen, inkubieren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur und nehmen Sie dann entweder in der Nähe von TIRF oder konfokale Mikroskopie ab. TIRF-Mikroskopaufnahmen von planaren SLBs, die mit grün dargestellten Septinen inkubiert wurden, zeigten eine homogene Proteinverteilung.

SLBs aus schlecht gereinigten Glasdeckgläsern zeigten Löcher oder Lücken in der Doppelschicht in Regionen mit niedrigem Septin. Nicht geplatzte und tubulierte Liposomen können sich auf der Oberfläche ansammeln, wenn alte Liposomen verwendet werden oder wenn die Waschungen nicht streng sind. In Mikroskopaufnahmen von lipidbeschichteten Mikrokugeln, die mit Rhodamin visualisiert wurden, zeigte PE eine glatte Doppelschichtabscheidung.

Die kugelförmigen Stützen waren gleichmäßig von der Membran bedeckt und es gab nur wenige Perlencluster. Unzureichendes Waschen von überschüssigen Lipiden verursachte eine ungleichmäßige Membranbeschichtung, wie sie von Lipidklumpen beobachtet wurde, und unsachgemäße Handhabung verursachte Lücken in der Doppelschicht. Unzureichendes Mischen von Perlen verursachte Verklumpungen, was für die Messung der gesamten Proteinabsorption nicht ideal ist.

Mit den hier vorgestellten unterstützten Lipiddoppelschichten können andere Methoden wie die Fluoreszenzlebensdauer-Bildgebungsmikroskopie, die Massenzytometrie von Membranen und die Hochgeschwindigkeits-Rasterkraftmikroskopie durchgeführt werden, um verschiedene Protein-Protein- oder Protein-Membran-Dynamiken zu untersuchen.