Name: Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-05-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Lernen Sie kostengünstige Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheit bei Caenorhabditis elegans. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern das Studium von Alterungsmechanismen mit einfachen Synchronisationstechniken.

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G.G. wird von T32AG052374 und R.H.S. von R00AG065200 vom National Institute on Aging unterstützt. Wir danken dem CGC (finanziert vom NIH Office of Research Infrastructure Program P40 OD010440) für die Belastungen.

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Die Lebensdauer, die am einfachsten als die Dauer des Lebens definiert wird, ist in den meisten Organismen ein klares binäres Phänomen - entweder lebt ein Organismus oder nicht. Die Langlebigkeit korreliert jedoch nicht immer mit der Gesundheit eines Organismus. Zum Beispiel gehören mitochondriale Hormesismodelle, bei denen die Exposition gegenüber mitochondrialem Stress die Lebensdauer dramatisch erhöht, im Allgemeinen zu den langlebigsten Tieren, zeigen jedoch ein verkümmertes Wachstum und eine verminderte Stoffwechselfunktion37,54. In ähnlicher Weise zeigen Tiere mit hyperaktiven endoplasmatischen Retikulum-Stressreaktionen auch bestimmte Verhaltensweisen und Phänotypen, die mit einer verminderten Gesundheit korreliert werden können, obwohl sie eine dramatisch verbesserte Proteinhomöostase und Lebensdaueraufweisen 36,49. Schließlich korrelieren viele Langlebigkeitsparadigmen in Modellorganismen, einschließlich erhöhter HSF-1-Funktion55, erhöhter XBP-1-Funktion 56 und veränderter FoxO-Signalgebung57, alle mit einem erhöhten Krebsrisiko, und es ist unbestreitbar, dass eine längere Lebensdauer nicht vorteilhaft ist, wenn sich ein Organismus in einem ständigen Kampf mit Krebs und anderen Gesundheitskrankheiten befindet. Daher kann die Langlebigkeit in der Alterungsbiologie kein eigenständiges Maß sein.
Daher ist das Konzept der Gesundheitsspanne ein wachsendes Feld in der alternden Biologie. Die Gesundheitsspanne, lose definiert als die Lebensphase, in der man gesund ist, ist schwieriger zu bestimmen als die Langlebigkeit. Im Gegensatz zur Langlebigkeit ist das Konzept der "Gesundheit" jedoch kompliziert, da es viele verschiedene Ablesungen der organismischen Gesundheit gibt: Auf der Ebene des Organismus gibt es Muskelfunktion / -stärke, neuronale / kognitive Funktion, reproduktive Gesundheit usw.; Auf zellulärer Ebene gibt es Proteinhomöostase, Lipidhomöostase, Glukosehomöostase, Stoffwechsel usw. Im Jahr 2014 haben alternde Biologen biologische Merkmale des Alterns definitiv mit der strukturierten Definition charakterisiert, dass es etwas sein muss, das während des Alterns natürlich zusammenbricht und experimentell so verändert werden kann, dass experimentelle Exazerbation das Altern beschleunigen und experimentelle Interventionen das Altern verlangsamen sollten. Zu diesen neun Merkmalen des Alterns gehören genomische Instabilität, Telomerabnutzung, epigenetische Veränderungen, Verlust der Proteinhomöostase (Proteostase), Stammzellerschöpfung, veränderte interzelluläre Signalgebung, mitochondriale Dysfunktion, deregulierte Nährstofferfassung und zelluläre Seneszenz58. Seitdem argumentieren zahlreiche Studien, dass andere Faktoren einbezogen werden sollten, einschließlich extrazellulärer Proteine und systemischer Physiologie wie Immunität und Entzündung59. Letztendlich schreibt die komplexe Definition der Gesundheitsspanne vor, dass die Gesundheit des Organismus mit mehreren verschiedenen Methoden gemessen wird.
Daher werden in diesem Manuskript mehrere Methoden vorgestellt, um verschiedene Aspekte der Gesundheitsspanne mit dem Nematodenmodell C. elegans zu messen. Wir untersuchen das Lokomotorverhalten mit Thrashing-Assays, die reproduktive Gesundheit anhand der Eierzahl und der Brutgröße sowie der Stressempfindlichkeit. Tatsächlich ist das Bewegungsverhalten eine Goldstandardmethode zur Messung der Gesundheitsspanne, da Organismen während des Alterns einen signifikanten Verlust an Motilität und Bewegung aufweisen51. Der Verlust des Bewegungsverhaltens kann auf mehrere Merkmale des Alterns zurückgeführt werden, da die Muskelfunktion bei C. elegans von der richtigen Proteostase 60, der mitochondrialen Dysfunktion61 und der Neuronen-Muskel-Signalgebung62 abhängt. Während sich dieses Manuskript auf eine Messung des Bewegungsverhaltens konzentriert, ist es wichtig zu beachten, dass viele andere Methoden existieren, einschließlich der Motilität von Tieren auf einer festen Agarplatte, der Reaktion auf Berührung51 und der Chemotaxis-Assays63. Diese Methoden erfordern jedoch im Allgemeinen ausgefeiltere Aufzeichnungsgeräte, die Verwendung von Wurmverfolgungssoftware oder die Verwendung teurer, gefährlicher oder flüchtiger Chemikalien, die in einigen Forschungsumgebungen unerschwinglich sein können.
Darüber hinaus werden Assays für Eierzahl und Brutgröße als Methode zur Messung der reproduktiven Gesundheit und als die einfachste Methode zur Messung der Zellteilung bei erwachsenen Würmern vorgestellt, da erwachsene Würmer postmitotisch sind und nur Keimzellen und Embryonen innerhalb eines erwachsenen Wurms eine Zellteilung durchlaufen64. Als Maß für die Zellteilung kann die reproduktive Gesundheit für die Alterungsmerkmale der zellulären Seneszenz und Stammzellerschöpfung relevant sein. Die reproduktive Gesundheit kann durch viele Faktoren beeinflusst werden, einschließlich pathogener Infektion65 oder Stressexposition49, obwohl es keine direkte Korrelation zwischen reproduktiver Gesundheit und Langlebigkeit gibt. Tatsächlich zeigen einige langlebige Tiere eine signifikante Abnahme der Brutgröße49, und es ist sogar möglich, dass es eine umgekehrte Korrelation zwischen Langlebigkeit und Brutgröße50 gibt. Dies ist kein spezifisches Phänomen von C. elegans, da bei Menschen 66, Begleithunden67 und Mäusen68 seit langem schädliche Auswirkungen der Fortpflanzung auf die Langlebigkeit beobachtet werden. Dennoch bieten wir Eierzahl und Brutgröße als zuverlässige und kostengünstige Methode zur Messung der reproduktiven Gesundheit mit dem Vorbehalt an, dass die reproduktive Gesundheit möglicherweise nicht mit der Langlebigkeit oder der Gesundheitsspanne korreliert.
Schließlich werden Überlebensassays als indirektes Maß für die Gesundheit des Organismus angeboten. Wichtig ist, dass zelluläre Stressreaktionen, einschließlich der Reaktion auf thermischen Stress69 und ER-Stress35, während des Alterungsprozesses schnell abnehmen und eine direkte Relevanz für das Alterungsmerkmal der Proteostase70,71 haben. Im Gegensatz dazu können hyperaktivierende Stressreaktionen die Lebensdauer signifikant verlängern, indem sie die Widerstandsfähigkeit gegen Stress fördern35,37,38. Während sich diese Studie auf die einfachsten und kostengünstigsten Methoden konzentriert, gibt es eine große Anzahl alternativer Methoden für Stressresilienz-Assays für Thermotoleranz41 und oxidativen Stress66, die jeweils unterschiedliche Geräte und Verbrauchsmaterialien erfordern. Über einfache Expositionsstudien gegenüber Stressoren hinaus können je nach Zugang zu Geräten andere physiologische Methoden durchgeführt werden. Zum Beispiel kann ein extrazellulärer Flussanalysator die mitochondriale Funktion und die Zellatmung überwachen73; Fluoreszenz-Dissektionsmikroskope ermöglichen Messungen von transkriptionellen Reportern zur Aktivierung der Stressantwort20; und hochauflösende zusammengesetzte oder konfokale Mikroskope können verwendet werden, um die Organellenmorphologie mit fluoreszierenden Sonden für Mitochondria74, das endoplasmatische Retikulum 75,76 und das Aktinzytoskelett 77 zu messen.
Als letzte warnende Geschichte für Messungen der Langlebigkeit, während chemische und genetische Methoden zur Sterilisation von Würmern angeboten werden, um die Kosten signifikant zu senken, ist es wichtig zu beachten, dass beide die Lebensdauer direkt beeinflussen können. Zum Beispiel wurde bereits berichtet, dass die Exposition gegenüber FUDR sowohl die Lebensdauer als auch die Thermotoleranz45 beeinflusst. Und während die glp-4 (bn2) -Mutante selbst keine direkten Auswirkungen auf die Lebensdauer hat, ist das Wachstum bei 25 ° C ein leichter Hitzestress33,34 und kann daher die Lebensdauerbeeinflussen 2. Es gibt andere Methoden zur Sterilisation von C. elegans, einschließlich auxinvermittelter Sterilität78 oder alternativer temperaturempfindlicher Spermienmangelmutanten79. Alle Methoden haben jedoch einige Vorbehalte, und es sollte darauf geachtet werden, den am wenigsten schädlichen Assay für die wissenschaftlichen Bedürfnisse jedes Labors zu verwenden. Eine letzte Einschränkung von Langlebigkeitsstudien ist die potenzielle Variabilität, die aufgrund niedriger Stichprobengrößen oder einfach durch einen objektiven Fehler des Prüfarztes auftreten kann. Dies kann umgangen werden, da neue Technologien in automatisierten Lebensdauertechnologien80 geboren werden, aber auch diese Systeme sind teuer und erfordern einige technische und rechnerische Geräte und Fähigkeiten. Letztendlich ist die Sammlung von Methoden, die hier zur Verfügung gestellt werden, ein zuverlässiger Satz von Werkzeugen, die in fast jeder Institution schnell angepasst und erlernt werden können und eine solide Grundlage für die alternde Biologie bieten.

Seit der Veröffentlichung von "The genetics of Caenorhabditis elegans", einem der einflussreichsten Artikel von Sydney Brenner im Jahr 1974, gilt dieser mikroskopisch kleine Wurm als herausragendes Modellsystem zur Untersuchung biologischer Geheimnisse1. Im Jahr 1977 veröffentlichte Michael R. Klass die Methode zur Messung der Lebensdauer von C. elegans und etablierte dieses Modellsystem, um das Altern zu untersuchen2. Die Untersuchung zum Verständnis der Beziehung zwischen Stress und Langlebigkeit begann mit der Identifizierung einer einzigen Mutation im Age-1-Gen, die zu einer Verlängerung der Lebensdauer von C. elegans3 führte. Darüber hinaus haben zeitgenössische Studien andere lebensdauerverlängernde Mutationen identifiziert, die langlebige mutierte Würmer zeigten, die eine erhöhte Resistenz gegen Stress aufweisen 4,5,6. Mit seinen vielen Vorteilen, einschließlich einer kurzen Lebensdauer, einer einfachen Wartung, einem vollständig sequenzierten Genom, das Homologie zu etwa zwei Dritteln aller menschlichen krankheitsverursachenden Gene enthält, der Verfügbarkeit und Leichtigkeit der Verwendung von RNA-Interferenzbibliotheken (RNAi) und physiologischer Ähnlichkeit mit Menschen 7,8,9, wurde C. elegans schnell als hervorragendes Modell für Stress- und Alterungsbiologie übernommen.
Die vielleicht größten Vorteile von C. elegans sind seine extrem niedrigen Wartungskosten, die Leichtigkeit des Experimentierens und die Vielfalt der genetischen Werkzeuge, die für Studien zur Verfügung stehen. C. elegans werden typischerweise auf einem festen Agarmedium mit einer E. coli-Nahrungsquelle angebaut. Zwei häufig verwendete E. coli-Stämme sind Standard-OP50, ein B-Stamm, der vielleicht der am häufigsten verwendete 10 ist, und HT115, ein K-12-Stamm, der hauptsächlich für RNAi-Experimente11,12 verwendet wird. Der HT115 K-12-Stamm trägt eine Deletion in der RNAIII-RNase, einer Mutation, die für RNAi-Methoden unerlässlich ist, bei denen Plasmide verwendet werden, die dsRNA exprimieren, die einzelnen C. elegans-Genen entspricht. Die dsRNA-Fütterungsvektoren ermöglichen einen robusten Knockdown von C. elegans-Genen ohne komplexe Kreuzungen oder Genom-Editierung, da Bakterien, die diese Plasmide tragen, direkt an Nematoden verfüttert werden können. Tausende dieser bakteriellen RNAi-Vektoren existieren im HT115-Hintergrund, darunter die beliebteste Vidal-RNAi-Bibliothek mit >19.000 einzelnen RNAi-Konstrukten13 und die Ahringer-RNAi-Bibliothek mit 16.757 RNAi-Konstrukten14. Die bakteriellen Diäten OP50 und HT115 weisen jedoch große Unterschiede im Stoffwechselprofil auf, einschließlich Unterschieden bei Vitamin B1215,16. Daher wird empfohlen, alle Experimente an einer einzigen Bakterienquelle durchzuführen, wenn möglich, um Gen-Diät-Wechselwirkungen zu vermeiden, die mehrere Störfaktoren wie zuvor beschrieben einführen können17,18,19. Aufgrund seiner Leichtigkeit werden die Tiere für alle hier beschriebenen Versuchsbedingungen auf OP50 gehalten, aber alle Experimente werden wie zuvor beschrieben auf HT115 durchgeführt20. Kurz gesagt, die Tiere werden bei OP50 gehalten und nach der Synchronisation (nach dem Bleichen) auf HT115 übertragen, um die Konsistenz zwischen RNAi- und Nicht-RNAi-Experimenten zu gewährleisten. Alternativ kann auch ein RNAi-kompetenter OP50-Stamm verwendet werden, der eine ähnliche Deletion von RNAIII-RNase trägt, die im E. coli K12 HT115-Stamm gefunden wurde21.
Vielleicht ist eine große Einschränkung für RNAi-Experimente in C. elegans die Sorge um die Knockdown-Effizienz. Während die Knockdown-Effizienz über qPCR oder Western Blotting validiert werden kann, erfordern diese teure Geräte und Reagenzien und beschränken sich auf die Massenanalyse. Dies ist umso besorgniserregender, wenn man sich bestimmte Zellen wie Neuronen ansieht, die gegenüber RNAi refraktär (weniger empfindlich) sind. Während die RNAi-Effizienz in bestimmten Zellen durch Überexpression von SID-1, dem für die dsRNA-Aufnahme essentiellen Transmembranprotein, verbessert werden kann22, ist dies immer noch auf die zelltypspezifischen Expressionsmuster der für diese Konstrukte verwendeten Promotoren beschränkt, und somit sind Gen-Knockouts und -Mutationen die narrensichersten Mittel, um Genfunktionen zu erschöpfen. Über den RNAi-vermittelten Knockdown hinaus sind C. elegans auch sehr anfällig für die Genom-Editierung mit CRISPR-basierten Strategien 23,24,25 und transgener Konstruktüberexpression durch Mikroinjektionen, mit der Option, transgene Konstrukte durch Bestrahlung oder Transposon-basierte Integration zu integrieren26,27,28,29 . Diese Methoden erfordern jedoch teure Mikroinjektionsgeräte, und die hohen Kosten für Leit-RNAs oder Cas9-Enzyme können diese Methoden in Institutionen mit begrenzter Finanzierung verbieten. Stattdessen sind Tausende von transgenen Linien und Mutanten sowohl im Caenorhabditis Genetics Center (CGC) als auch im National Bioresource Project (NBRP) für ein paar Dollar erhältlich. Das NBRP bietet isolierte Mutanten für eine große Anzahl von C. elegans-Genen, einschließlich veröffentlichter und daher verifizierter Mutantenstämme, Mutanten, die aus Pilotprojekten stammen, und Mutanten, die noch charakterisiert werden müssen. Im Gegensatz dazu ist CGC ein Depot von meist veröffentlichten und etablierten C. elegans-Linien aus der Forschungsgemeinschaft. Beide verschiffen Stämme weltweit zu sehr günstigen Preisen und bieten eine Vielzahl von Optionen für diejenigen mit begrenzter Kapazität, Stämme intern zu synthetisieren.
Hier wird eine kuratierte Methodensammlung angeboten, die wahrscheinlich die kostengünstigsten Methoden zur Bestimmung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung in C. elegans sind. Alle hier vorgestellten Methoden erfordern kostengünstige Ausrüstung und Zubehör und verwenden nur Stämme, die vom CGC leicht erhältlich sind. Vielleicht am unerschwinglichsten für Langlebigkeits- und Überlebensassays in C. elegans sind die Kosten für Nematode Growth Media (NGM) -Platten. Da C. elegans Hermaphroditen sind und sich selbst befruchten, erfordern Standard-Überlebenstests, dass erwachsene Tiere kontinuierlich von ihren Nachkommen entfernt werden, um eine Kontamination durch Nachkommen zu vermeiden. Dieser Prozess ist nicht nur zeitaufwändig, sondern kann auch teuer werden, da etwa 100 Platten pro Zustand erforderlich sind, um einen einzigen Lebensdauerassay durchzuführen. Hier stehen zwei Alternativen zur Verfügung: die Nutzung der temperaturempfindlichen keimbahnlosen Mutante glp-4(bn2) oder die chemische Sterilisation mit 5-Fluor-2'-Desoxyuridin (FUDR). glp-4 kodiert für eine Valylaminoacyl-tRNA-Synthetase, und die temperaturempfindlichen glp-4(bn2) weisen bei restriktiven Temperaturen aufgrund einer verminderten Proteintranslation einen reproduktiven Mangel auf30,31 auf. FUDR ist eine robuste Methode zur chemischen Sterilisation von C. elegans, indem die DNA-Replikation verhindert und somit die Fortpflanzung gehemmtwird 32. Obwohl FUDR für einige Labore unerschwinglich teuer sein kann, ist nur eine kleine Menge erforderlich, um Würmer chemisch zu sterilisieren, und seine Stabilität in Pulverform kann es für die meisten Gruppen machbar machen. Die Verwendung der temperaturempfindlichen glp-4 (bn2) -Mutante ist sicherlich die billigste Option, da die einzige Voraussetzung ein Inkubator ist, um die Tiere auf die restriktiven 25 ° C zu verlagern. Es ist jedoch zu beachten, dass Wachstum bei 25 °C leichten Hitzestress verursachen kann33,34. Unabhängig von der Methode kann die Verwendung steriler Tiere die Kosten für Verbrauchsmaterialien, die für altersbedingte Assays benötigt werden, erheblich senken.
Um das Altern zu untersuchen, sind Standard-Lebensdauer-Assays konventionell, da Paradigmen, die die Langlebigkeit verändern, direkte Auswirkungen auf das Altern haben. Messungen der Gesundheitsspanne und der Stresstoleranz liefern jedoch zusätzliche Informationen über die Gesundheit des Organismus. Hier werden mehrere Methoden zur Messung der Gesundheitsspanne angeboten: 1) Fruchtbarkeit als Maß für die reproduktive Gesundheit; 2) Brutgröße als Maß für die Entwicklungsgesundheit und Lebensfähigkeit der entlassenen Nachkommen; und 3) Bewegungsverhalten als Maß für Muskelfunktion und Motilität, die beide direkt mit dem Altern korrelieren. Darüber hinaus werden Assays zur Stresstoleranz angeboten: Überleben gegenüber ER-Stress, mitochondrialem / oxidativem Stress und Überleben von thermischem Stress. Tatsächlich weisen Tiere mit erhöhter Resistenz gegen ER-Stress 35,36, mitochondrialen Stress37 und thermischen Stress 38 eine erhöhte Lebensdauer auf. ER-Stress wird angewendet, indem C. elegans Tunicamycin ausgesetzt wird, das die N-verknüpfte Glykosylierung blockiert und die Ansammlung von fehlgefalteten Proteinenverursacht 39. Mitochondrialer/oxidativer Stress wird durch die Exposition gegenüber Paraquat induziert, das die Superoxidbildung speziell in den Mitochondrien40 induziert. Hitzestress wird durch die Inkubation von Tieren bei 34-37 °C33,41 angewendet. Alle hier beschriebenen Assays können mit minimaler Ausrüstung und Mitteln durchgeführt werden und bieten eine Vielzahl von Werkzeugen, um das Altern in verschiedenen Gruppen zu untersuchen.

<table><tbody><tr><td>APEX IPTG</td><td>Genesee</td><td>18-242</td><td>für RNAi</td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>VWR</td><td>90000-764</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Bacto Pepton</td><td>VWR</td><td>97064-330</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>VWR</td><td>97061-904</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Carbenicillin</td><td>VWR</td><td>76345-522</td><td>für RNAi</td></tr><tr><td>Cholesterin</td><td>VWR</td><td>80057-932</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>VWR</td><td>BDH1115-1LP</td><td>Lösungsmittel für Arzneimittel</td></tr><tr><td>LB Bouillon</td><td>VWR</td><td>95020-778</td><td>für LB</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>VWR</td><td>97062-132</td><td>für NGM-Platten M9</td></tr><tr><td>Paraquat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>36541</td><td>für oxidativen/mitochondrialen Stress</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>VWR</td><td>97061-566</td><td>für Bleichlösung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasig</td><td>VWR</td><td>EM-PX1570-2</td><td>für NGM-Platten</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>VWR</td><td>EM-PX1565-5</td><td>für M9</td></tr><tr><td>S7E Präparierfernrohr</td><td>Leica</td><td>10450840</td><td>Standard-Präpariermikroskop</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>VWR</td><td>EM-SX0420-5</td><td>für NGM-Platten, M9</td></tr><tr><td>Natriumhypochlorit</td><td>VWR</td><td>RC7495.7-32</td><td>für Bleichlösung</td></tr><tr><td>, Natriumphosphat, zweibasisch</td>, <td>VWR</td><td>71003-472</td><td>für M9</td></tr>, <tr><td>Tetracyclinhydrochlorid,</td><td>VWR</td><td>97061-638</td><td>für RNAi,</td></tr><tr><td>Tunicamycin</td>, <td>Sigma-Aldrich,</td><td>T7765-50MG</td><td>für ER-Stress</td></tr></tbody></table>

erhebung kostengünstiger methoden zur messung von lebensdauer und gesundheitserwartung bei caenorhabditis elegans

Surveying Low-Cost Methods to Measure Lifespan and Healthspan in Caenorhabditis elegans

Die Entdeckung und Entwicklung von Caenorhabditis elegans als Modellorganismus war einflussreich in der Biologie, insbesondere auf dem Gebiet des Alterns. Viele historische und zeitgenössische Studien haben Tausende von lebensdauerverändernden Paradigmen identifiziert, darunter genetische Mutationen, transgene Genexpression und Hormesis, eine vorteilhafte, minderwertige Exposition gegenüber Stress. Mit seinen vielen Vorteilen, darunter eine kurze Lebensdauer, eine einfache und kostengünstige Wartung und ein vollständig sequenziertes Genom mit Homologie zu fast zwei Dritteln aller menschlichen Gene, wurde C. elegans schnell als herausragendes Modell für Stress- und Alterungsbiologie übernommen. Hier werden mehrere standardisierte Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitsspanne untersucht, die leicht in fast jede Forschungsumgebung angepasst werden können, insbesondere in solche mit begrenzter Ausrüstung und Finanzierung. Der unglaubliche Nutzen von C. elegans wird hervorgehoben und unterstreicht die Fähigkeit, leistungsstarke genetische Analysen in der alternden Biologie durchzuführen, ohne dass eine umfangreiche Infrastruktur erforderlich ist. Schließlich werden die Grenzen jeder Analyse und alternative Ansätze diskutiert, um sie zu berücksichtigen.

C. elegans sind ein hervorragender Modellorganismus für die Alterungsforschung, da eine große Mehrheit der Alterungsmechanismen beim Menschen erhalten bleibt. Wichtig ist, dass sie sehr niedrige Kosten für Wartung und Experimente mit minimalen Anforderungen an Ausrüstung und Verbrauchsmaterialien haben, was sie zu einem begehrten Modellsystem für Institutionen mit begrenzten Mitteln macht. Darüber hinaus macht eine Fülle von einfachen Assays mit flachen Lernkurven sie zu einem ausgezeichneten System für den jüngsten Ermittler mit wenig bis gar keiner Erfahrung. All diese Faktoren in Kombination mit der leistungsstarken Genetik von C. elegans , einschließlich der Leichtigkeit der Genombearbeitung, Tausenden von verfügbaren Mutanten und transgenen Tieren zu nominalen Kosten und verfügbaren RNAi-Bibliotheken für den genetischen Knockdown von praktisch jedem Gen, machen sie zu einem idealen System für Studenteneinrichtungen. Hier werden einige der kostengünstigsten Methoden zur Untersuchung des Alterns bei C. elegans untersucht, wobei der Schwerpunkt in erster Linie auf Assays mit minimalen Ausrüstungs- und Verbrauchsmaterialkosten sowie flachen Lernkurven liegt. Tatsächlich wurden die gesamten Protokolle und die Datenerhebung von Nachwuchsforschern mit &lt; 5 Monaten Forschungserfahrung, meist Studenten, geschrieben / durchgeführt.
Langlebigkeitsstudien bei C. elegans sind aufgrund der kurzen Lebensdauer der Tiere, die zwischen 14 und 20 Tagen liegt, sehr einfach. Wichtig ist, dass die Lebensdauerassays hoch standardisiert sind und nur einen Inkubator, ein Standard-Dissektionsmikroskop, einen Standard-Wurmwähler und Verbrauchsmaterialien für die Herstellung von NGM-Agar-Platten erfordern. Der vielleicht kostenintensivste Aspekt von Lebensdauermessungen in C. elegans sind die erforderlichen Verbrauchsmaterialien. Dies liegt daran, dass C. elegans Hermaphroditen sind, die sich selbst befruchten; Daher müssen Erwachsene, die für Langlebigkeitstests verfolgt werden, täglich von den Nachkommen wegbewegt werden. Tiere können jedoch sterilisiert werden, indem sie FUDR ausgesetzt werden oder Mutanten verwenden, wie z. B. die temperaturempfindliche keimbahnlose glp-4 (bn2) -Mutante, die bei unerschwinglichen 25 ° C angebaut wird, um die Menge der erforderlichenVerbrauchsmaterialien um 30,31,32 zu reduzieren. Hier wurden Lebensdauer-Assays mit FUDR oder mit den keimbahnlosen Mutanten glp-4(bn2) durchgeführt, die ähnliche Ergebnisse zeigen wie Standardlebensdauern bei nicht sterilen Tieren. Während die Lebensspanne des Wildtyps aufgrund der Auswirkungen von FUDR45 oder Wachstum bei 25 °C auf die Lebensdauernicht identisch ist 2, zeigt das kurzlebige hsf-1-Knockdown-Tier zuverlässig eine signifikante Abnahme der Lebensdauer für alle Bedingungen (Abbildung 1). HSF-1 kodiert den Hitzeschockfaktor-1-Transkriptionsfaktor, der an der Regulation der thermischen Stressreaktion beteiligt ist, und sein Knockdown führt zu einer signifikanten Abnahme der Lebensdauer38,46.
Während die Langlebigkeit ein wichtiger Faktor ist, der in der Biologie des Alterns zu berücksichtigen ist, korreliert die Langlebigkeit oft nicht mit einer erhöhten Gesundheit, selbst bei C. elegans47. Daher bieten wir als komplementären Ansatz mehrere Methoden zur Messung der Gesundheit von Organismen an, einschließlich reproduktiver Gesundheit, Bewegungsverhalten und Stressresilienz. Die reproduktive Gesundheit kann auf zwei Arten gemessen werden. Erstens geben Messungen der Eierzahl eine direkte Messung davon, wie viele Eier von einem einzigen selbstbefruchtenden Hermaphroditen gelegt werden. Da Tiere jedoch mehr Eizellen als Spermien produzieren, werden auch einige unbefruchtete Eier gelegt, die niemals lebensfähige Nachkommen hervorbringen würden48. Um die wahre Fortpflanzungsfähigkeit eines Tieres besser zu verstehen, liefern Messungen der Brutgröße ein Maß dafür, wie viele lebensfähige Nachkommen produziert werden. Oft kann eine erhöhte Stressresilienz tatsächlich die Fortpflanzungsfähigkeit verringern, möglicherweise aufgrund der inhärenten Wirkung von wahrgenommenem Stress auf die Fortpflanzung49. In ähnlicher Weise wird bei hsf-1-Überexpressionstieren im Vergleich zu Wildtypkontrollen eine signifikante Abnahme sowohl der Anzahl der gelegten Eier als auch der Brutgröße festgestellt (Abbildung 2A, B). Tatsächlich weisen einige hsf-1-Überexpressionstiere eine vollständige Sterilität auf, was darauf hindeutet, dass die reproduktive Gesundheit umgekehrt mit der Langlebigkeit korreliert werden kann.
Während die reproduktive Gesundheit für das Verständnis der Keimbahngesundheit, der funktionellen Meiose und der Fortpflanzungsfähigkeit wichtig ist, gibt es im Allgemeinen keine direkte Korrelation zwischen Langlebigkeit und Brutgröße50. Somit wird als komplementärer Ansatz das Bewegungsverhalten als Goldstandardmethode zur Bestimmung der Lebensspanne von C. elegans im Altervon 51 Jahren angeboten. Es gibt viele Methoden, um das Bewegungsverhalten zu messen, aber die meisten Methoden erfordern ausgeklügelte Kameras, Tracking-Software oder teure Chemikalien. Im Gegensatz dazu erfordern Thrashing-Assays praktisch keine Ausrüstung, die über das hinausgeht, womit ein Standardlabor von C. elegans ausgestattet ist: Seziermikroskop, Wurmpicker, Pipette und Verbrauchsmaterialien zur Herstellung von NGM-Agar-Platten. Die Thrashing-Raten bieten eine zuverlässige Methode zur Messung der Gesundheitsspanne während des Alterns, gemessen an einer signifikanten Abnahme des Thrashings bei alten Tieren im Vergleich zu Jungtieren (Abbildung 2C).
Schließlich ist das Überleben von Stress-Assays eine zusätzliche physiologische Messung der Resilienz. Die Fähigkeit, Stressreaktionen zu aktivieren, nimmt im Allgemeinen während des Alterungsprozesses ab, wodurch Tiere weniger widerstandsfähig und anfälliger für Stress werden. So kann Stressresilienz als zuverlässiger Proxy für die Gesundheit des Organismus verwendet werden. Hier werden Methoden zur Messung der Empfindlichkeit gegenüber 1) ER-Stress als Reaktion auf die Tunicamycin-Exposition angeboten, ein chemischer Wirkstoff, der die N-verknüpfte Glykosylierung blockiert und zur Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen in der Notaufnahme führt; 2) mitochondrialer/oxidativer Stress durch Exposition gegenüber Paraquat, einem chemischen Mittel, das die Superoxidbildung in Mitochondrien induziert; und 3) thermische Belastung durch Einwirkung erhöhter Temperaturen. Bei Tunicamycin- und Paraquat-Assays wird das Medikament während der Plattenproduktion in die NGM-Agar-Platte eingearbeitet. Bei hohen Konzentrationen von Tunicamycin entwickeln sich Nachkommen im Allgemeinen nicht, und daher müssen keine Sterilisationstechniken verwendet werden. Das hier vorgestellte Protokoll empfiehlt 25 ng / μL als Endkonzentration von Tunicamycin, aber für diejenigen mit begrenzten Mitteln zeigen 10 ng / μL auch eine signifikante Verringerung des Überlebens (Abbildung 3A). Beide Konzentrationen begrenzen die Entwicklung von Nachkommen, und daher sind keine Sterilisationsmethoden erforderlich, obwohl die DMSO-Kontrolle eine Sterilisationstechnik oder die Bewegung von Tieren auf neue Platten erfordert. Dies liegt daran, dass die Tunicamycin-Toxizität die Entwicklung von Nachkommen verhindert, aber DMSO ist praktisch ungiftig, was es den Nachkommen ermöglicht, sich vollständig zu entwickeln, wenn sie auf Tunicamycin angebaut werden.
Für Paraquat-Assays ist entweder eine Sterilisationstechnik oder eine Bewegung von Tieren erforderlich, da die Paraquat-Behandlung nicht verhindert, dass sich Nachkommen bis ins Erwachsenenalter entwickeln. Hohe Paraquatspiegel (4 mM) verkürzen die Lebensdauer signifikant, während niedrige Paraquatspiegel (0,25 mM) die Lebensdauer aufgrund einer hormetischen Wirkung erhöhen (Abbildung 3B), was mit zuvor veröffentlichten Ergebnissenübereinstimmt 52. Schließlich erfordern Thermotoleranz-Assays nur einen Inkubator, der 30-37 °C erreichen kann, und es sind keine zusätzlichen Reagenzien erforderlich. Die Überexpression von hsf-1 erhöht die Thermotoleranz bei 37 °C (Abbildung 3C), wie zuvor veröffentlicht53. Wie andere jedoch bereits und aus den vorliegenden Daten gezeigt haben, ist das Hauptproblem bei Thermotoleranz-Assays ihre Variabilität. Viele Faktoren können zur Variabilität innerhalb von Thermotoleranztests beitragen, einschließlich der Unterschiede zwischen Inkubatoren und der Zeit, die Tiere außerhalb des Inkubators verbringen, während sie jede Stunde die Thermotoleranz bewerten. Eine ausführliche Richtlinie zur Thermotoleranz finden Sie in der Referenz 41.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig01.jpg"> Abbildung 1: Vergleich der Lebensdauermessungen mit und ohne Sterilisation. (A) Lebensdauer von Wildtyp-N2-Nematoden, die auf NGM-Agarplatten gezüchtet werden, die mit leeren Vektor- (ev) oder hsf-1-RNAi-Bakterien bei 20 °C ausgesät sind. Die Tiere wurden an den Tagen 1, 3, 5 und 7 des Erwachsenenalters von den Nachkommen weggebracht. (B) Lebensdauer von Wildtyp-N2-Nematoden, die auf NGM-Agar-FUDR-Platten gezüchtet werden, die mit leeren Vektor- (ev) oder hsf-1-RNAi-Bakterien bei 20 °C ausgesät sind. Die Tiere wurden auf Standard-EV- oder HSF-1-RNAi-Platten bis zum Erwachsenenalter gezüchtet und dann am Tag 1 des Erwachsenenalters auf FUDR-Platten umgestellt. (C) Lebensdauer von glp-4(bn2)-mutierten Tieren, die auf NGM-Agarplatten gezüchtet werden, die mit leerem Vektor (ev) oder hsf-1 RNAi bei 25 °C gesät sind. Unter allen Bedingungen wurden die Tiere alle 2 Tage für den Tod gewertet, bis alle Tiere als tot oder zensiert registriert wurden. Tiere mit Absackung, Vorsprung oder Explosion der Vulva oder solche, die an den Seiten der Platten krochen und ausgetrocknet waren, wurden zensiert. Alle Statistiken wurden mit Log-Rank Mantel-Cox-Tests durchgeführt und sind in Tabelle 2 zu finden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig02.jpg"> Abbildung 2: Eierzahl, Brutgröße und Thrashing als Messungen der Gesundheitsspanne . (A) Thrashing-Assays wurden an glp-4(bn2)- mutierten Tieren durchgeführt, die auf NGM-Agar-Platten gezüchtet wurden, die mit leerem Vektor bei 25 °C an Tag 1 (blau), Tag 4 (rot) und Tag 9 (grün) Tieren gesät wurden. Thrashing wurde bei Tieren in M9-Lösung auf einer NGM-Agar-Platte bewertet, Video mit einer Standard-Smartphone-Kamera aufgezeichnet, die auf einem Okular eines Standard-Sezierzielfernrohrs montiert war, und Thrashing wurde in Zeitlupe für Genauigkeit bewertet. n = 15 Tiere pro Zustand. (B) Die Eierzahl wurde bei Tieren des Wildtyps N2 (blau) und sur-5p::hsf-1 (rot) gemessen. Die Tiere wurden bei 20 ° C gezüchtet und auf frische Teller gebracht, und die Eier wurden alle 12 Stunden gezählt. Die Gesamtzahl der gelegten Eier wurde summiert. n = 7 Tiere für Wildtyp und 9 Tiere für sur-5p::hsf-1. (C) Brutuntersuchungen wurden an denselben Tieren gemessen wie (B), bei denen Eier 2 Tage lang bei 20 °C angebaut wurden, um das Schlüpfen zu ermöglichen, und alle geschlüpften Eier gezählt wurden. = p &lt; 0,001, berechnet mit nicht-parametrischen Mann-Whitney-Tests. Jeder Punkt repräsentiert ein einzelnes Tier, und Linien stellen den Median- und Interquartilsbereich dar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64091/64091fig03.jpg"> Abbildung 3: Stressresistenz als Stellvertreter für die Gesundheit des Organismus. (A) Überlebenstest von N2-Tieren, die auf dem leeren Vektor RNAi-Bakterien bei 20 °C gezüchtet wurden. Die Tiere wurden am 1. Tag des Erwachsenenalters auf Platten mit entweder 1% DMSO, 10 ng/μL Tunicamycin (TM) oder 25 ng/μL TM gebracht. (B) Überlebenstest von N2-Tieren, die auf dem leeren Vektor RNAi-Bakterien bei 20 °C gezüchtet wurden. Die Tiere wurden von der Luke an auf Platten gezüchtet, die entweder Wasser, 0,25 mM Paraquat (PQ) oder 4 mM PQ enthielten. Für A-B wurden alle 2 Tage Tiere für den Tod bewertet, bis alle Tiere als tot oder zensiert registriert wurden. Tiere mit Absackung, Vorsprung oder Explosion der Vulva oder solche, die an den Seiten der Platten krochen und ausgetrocknet waren, wurden zensiert. Alle Statistiken wurden mit Log-Rank Mantel-Cox-Tests durchgeführt (Tabelle 2). (C) Gepoolte Daten aller 37 °C Thermotoleranz-Assays für Wildtyp-N2-Tiere im Vergleich zur Überexpression von hsf-1 (sur-5p::hsf-1). Die Daten werden als Prozentsatz des Lebendigen zum Zeitpunkt = 9 h eines Thermotoleranztests dargestellt, wobei jede Zeile ein übereinstimmendes Experiment darstellt, das am selben Tag durchgeführt wurde. Die Tiere wurden auf dem leeren Vektor RNAi-Bakterien bei 20 ° C gezüchtet und am Tag 1 des Erwachsenenalters zur Untersuchung auf 37 ° C gebracht. n = 60 Tiere pro Stamm pro Replikat. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64091/64091fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Reagenz</td>
			<td colspan="3">Rezept</td>
		</tr><tr><td>Bleichmittellösung</td>
			<td colspan="3">1,8% (v/v) Natriumhypochlorit, 0,375 M KOH</td>
		</tr><tr><td>Carbenicillin</td>
			<td colspan="3">100 mg/ml Stammlösung (1000x) in Wasser. Bei 4 °C für bis zu 6 Monate oder -20 °C für Langzeitlagerung lagern</td>
		</tr><tr><td>FUDR</td>
			<td colspan="3">10 mg/ml Lösung in Wasser. Bei -20 °C lagern.</td>
		</tr><tr><td>IPTG</td>
			<td colspan="3">1 M Lösung in Wasser.</td>
		</tr><tr><td>Lysogenese Brühe (LB)</td>
			<td colspan="3">In diesem Protokoll wurde kommerzielles LB verwendet (siehe Tabelle der Materialien), aber alle Standard-LB-Hausrezepte mit Bacto-Trypton, Hefeextrakt und NaCl sind ausreichend.</td>
		</tr><tr><td>M9-Lösung</td>
			<td colspan="3">22 mM KH 2 PO 4 monobasic, 42,3 mM Na2HPO 4, 85,6 mM NaCl,1 mMMgSO 4</td>
		</tr><tr><td>Nematode Growth Media (NGM)</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/ml Cholesterin, 25 mM KPO 4 pH 6,0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) Agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi Platten</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/ml Cholesterin, 25 mM KPO 4 pH 6,0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) Agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml Carbenicillin/Ampicillin. Bis zu 3 Monate bei 4°C dunkel lagern</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi DMSO</td>
			<td colspan="3" rowspan="2">1 mM CaCl 2, 5 μg/ml Cholesterin, 25 mM KPO 4 pH 6,0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) Agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml Carbenicillin/Ampicillin; 1% DMSO</td>
		</tr><tr><td>(Kontrolle für Tunicamycin)</td>
		</tr><tr><td>NGM RNAi TM</td>
			<td colspan="3">1 mM CaCl 2, 5 μg/ml Cholesterin, 25 mM KPO 4 pH 6,0, 1 mM MgSO4,2% (w/v) Agar, 0,25% (w/v) Bacto-Pepton, 51,3 mM NaCl, 1 mM IPTG, 100 μg/ml Carbenicillin/Ampicillin; 1% DMSO, 25 ng/μL Tunicamycin</td>
		</tr><tr><td>Paraquat</td>
			<td colspan="3">400 mM Lösung in Wasser – sollte frisch zubereitet werden</td>
		</tr><tr><td>Tetracyclin</td>
			<td colspan="3">10 mg/ml Stammlösung (500x) in 100% Ethanol. Bei -20 °C lagern</td>
		</tr><tr><td>Tunicamycin</td>
			<td colspan="3">2,5 mg/ml Stammlösung in 100% DMSO. Zur Langzeitlagerung bei -80 °C lagern. Dies ist eine 100-fache Lösung (25 ng / μL Arbeitslösung)</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1. Rezepte für Reagenzien und Medien für Protokolle.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Entsprechendes Abbildungsfeld</td>
			<td colspan="2">Belastung, Behandlung</td>
			<td>Mediane Lebensdauer</td>
			<td># Todesfälle/# Insgesamt</td>
			<td>p-Wert (Log-Rang)</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1A</td>
			<td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C</td>
			<td>17</td>
			<td>74/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>65/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1B</td>
			<td colspan="2">N2, Vektor RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>120/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, hsf-1 RNAi, FUDR, 20 °C</td>
			<td>11</td>
			<td>116/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">1C</td>
			<td colspan="2">N2, glp-4(bn2), Vektor RNAi, 25 °C</td>
			<td>13</td>
			<td>115/121</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, glp-4(bn2), hsf-1 RNAi, 25 °C</td>
			<td>4</td>
			<td>120/120</td>
			<td>&lt; 0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2A</td>
			<td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C, 1% DMSO</td>
			<td>19</td>
			<td>85/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C, 10 ng/μL Tunicamycin</td>
			<td>15</td>
			<td>109/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C, 25 ng/μL Tunicamycin</td>
			<td>12</td>
			<td>117/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr><tr><td rowspan="3">2B</td>
			<td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C</td>
			<td>19</td>
			<td>84/120</td>
			<td>--</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C, 0,25 mM Paraquat</td>
			<td>24</td>
			<td>91/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr><tr><td colspan="2">N2, Vektor RNAi, 20 °C, 4 mM Paraquat</td>
			<td>6</td>
			<td>50/120</td>
			<td>&lt;0,001</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 2. Statistiken zur Lebensdauer und Stressresilienz.

Caenorhabditis elegans dienen als hervorragendes Modellsystem mit robusten und kostengünstigen Methoden zur Untersuchung von Gesundheit, Lebensdauer und Stressresistenz.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

The discovery and development of Caenorhabditis elegans as a model organism was influential in biology, particularly in the field of aging. Many ...

Dieses Protokoll stellt die niedrigsten Kosten und die niedrigsten technischen Methoden für die Alterung in Meereseleganen dar. Ein einflussreicher Modellorganismus in der Alterungsbiologie. Der größte Vorteil dieser Methoden ist die einfache Implementierung mit kostengünstigen Geräten und Materialien.Sie für jeden Forscher zugänglich zu machen, unabhängig von Erfahrung oder verfügbaren Finanzmitteln. Wie eine alte Alterungsstudie gibt es natürliche Variabilität in der Gesundheit innerhalb der Populationen. Daher ist es wichtig, dass Experimente an gesunden, gut gefütterten und eng synchronisierten Tieren durchgeführt werden.Um eine Reißbehinderung zu gewährleisten, beginnen Sie mit der Vorbereitung von einem Liter Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM-Schneckenplatte. 2,5 Gramm Pepton, 3,0 Gramm Natriumchlorid und 20 Gramm Schnecke in einen Ein-Liter-Kolben mit einem Rührriegel geben und destilliertes Wasser zu einem Endvolumen von 970 Milliliter hinzufügen. Sterilisieren Sie die NGM-Schneckenlösung in einem Ein-Liter-Kolben mit einem Standardautoklaven oder Mediensterilisator.Und lassen Sie die Lösung rühren, bis sie auf 60 bis 75 Grad Celsius abgekühlt ist. Während die Lösung abkühlt, erhitzen Sie ein Perlenbad auf 65 bis 70 Grad Celsius. Sobald die NGM-Schneckenlösung auf 60 bis 75 Grad Celsius abgekühlt ist.Fügen Sie die flüssigen Additive hinzu und lassen Sie die Lösung fünf Minuten lang vollständig mischen. Anschließend tauchen Sie den Kolben in ein Perlenbad bei 65 bis 70 Grad Celsius, um zu verhindern, dass das Medium beim Eingießen in die Platte erstarrt. Neun bis 11 Milliliter der Lösung in jede 60-Milliliter-Platte pipettieren.Wenn Sie fertig sind, legen Sie die Pipette wieder in die erhitzte Lösung, um die Temperatur zu halten und zu verhindern, dass Medien in der Pipette erstarren. Wiederholen Sie den Vorgang für alle Platten und lassen Sie NGM a-Platten über Nacht erstarren. Einmal verfestigt, verwenden Sie sie zum Aussäen von Platten mit Bakterien oder lagern Sie die Platten in verschlossenen Behältern für bis zu drei Monate bei vier Grad Celsius, um die Würmer durch Bleichen zu synchronisieren.Sammeln Sie die Nematoden, indem Sie eine kleine Menge M9-Lösung auf eine Platte gießen, die die Würmer enthält, ohne die Petrischale zu überfüllen. Anschließend die Mnine-Lösung vorsichtig schwenken, um Würmer von den Bakterienrasen zu lösen. Als nächstes sammeln Sie adulte Gravidenwürmer in einem 15-Milliliter-Röhrchen mit einer serologischen Pipette.Vermeiden Sie es, die Schnecke mit der Pipettenspitze zu durchstechen. Die Tiere 30 Sekunden lang bei 1100 mal G zentrieren und den Überstand absaugen. Fügen Sie fünf Milliliter der frisch zubereiteten Bleichlösung zum Wurmpellet hinzu und überprüfen Sie die Würmer alle paar Minuten unter einem Seziermikroskop zusammen mit intermittierendem kräftigem Schütteln, bis alle erwachsenen Wurmkörper aufgelöst sind und nur Eier in der Mischung übrig sind.Als nächstes pelletieren Sie die Eier, indem Sie die Eierbleichmischung für 30 Sekunden bei 1100 mal G herunterdrehen und die Bleichlösung absaugen. Dann waschen Sie die pelletierten Eier, indem Sie bis zu 15 Milliliter M9-Lösung hinzufügen und das Röhrchen vier- oder fünfmal umkehren, um die Eier und die Lösung zu dispergieren. Zentrifugieren Sie das Röhrchen erneut für 30 Sekunden bei 1100 mal G, um die Eier zu pelletieren und die M9-Lösung abzusaugen.Führen Sie die Wäsche viermal durch, um Bleichmittel aus der Eimischung zu entfernen. Nach der vierten Waschzentrifusion saugen Sie die M9-Lösung von 100 Mikrolitern auf zwei Milliliter ab, abhängig von der Gesamtzahl der gebleichten Würmer. Schütteln Sie die Eier gründlich, um die Klumpen aufzubrechen, und stellen Sie sicher, dass die Eier in der M9-Lösung vollständig resuspendiert sind.Alternativ können Tiere für eine engere zeitliche Synchronisation eins gehalten werden, indem 10 bis 12 Milliliter M9-Lösung in einem 15-Milliliter-Chronikröhrchen zum Eipellet gegeben werden. Lassen Sie die Würmer bis zu 24 Stunden in einem Rotator bei 20 Grad Celsius drehen. Um das Ei oder L anzunähern, pipette man vier Mikroliter der Eimischung auf eine mit Bakterien sitzende NGM-Platte.Dann zählen und berechnen Sie die vorhandenen Eier pro Mikroliter Medien. Wiederholen Sie die Zählung drei- oder viermal, um die Näherung zu verbessern, basierend auf der Näherungsplatte, der entsprechenden Anzahl von Eiern oder L eins festgenommenen Tieren auf der NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien ihrer Wahl ausgesät ist. Zur Messung des Bewegungsverhaltens der Würmer mittels Thrashing.Bewegen Sie eine kleine Anzahl von adulten Würmern des ersten Tages von einer NGM-Schneckenplatte auf 10 bis 20 Mikroliter M9-Lösung unter einem Sezierfernrohr. Konzentrieren Sie sich dann auf jeweils einen Wurm und zählen Sie, wie oft die Probe in 15 Sekunden von einer konkaven zu einer konvexen Bildung wechselt. Verwenden Sie einen Handzähler und einen Timer und wiederholen Sie den Vorgang für 10 bis 15 Würmer.Altern Sie die Würmer auf das gewünschte Alter und wiederholen Sie die Prügelmessungen in allen gewünschten Altersstufen. Wie visualisiert, schlagen ältere Würmer mit deutlich langsameren Geschwindigkeiten. Für Mengen- und Fruchtbarkeitsmessungen.Bei 10 bis 15 Caenorhabditis elegans-Würmern wählen Sie L vier Würmer in eine separate NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien Ihrer Wahl gesät ist. Lassen Sie die Tiere über Nacht bei 20 Grad Celsius wachsen und stellen Sie sicher, dass eine neu ausgesäte Charge Teller für den nächsten Tag bereit ist. Um die Menge der von Caenorhabditis elegans gelegten Eier zu messen, übertragen Sie die erwachsenen Würmer alle 12 bis 24 Stunden für sieben bis acht Tage oder bis die Eier nicht mehr sichtbar sind, in eine frische NGM-Schneckenklinge, die mit diesen geplünderten Bakterien besät ist, und zählen Sie die Anzahl der Eier, die auf die Teller gelegt werden.Um die Brutgröße von Caenorhabditis elegans zu messen Übertragen Sie die erwachsenen Würmer alle 12 bis 24 Stunden oder sieben bis acht Tage oder bis die Nachkommen nicht mehr sichtbar sind, auf eine frische NGM-Schneckenplatte, die mit Bakterien besät ist. Halten Sie alle Teller mit Eiern bei 20 Grad Celsius. Zwei Tage nach der Übertragung von Würmern.Zählen Sie die entwickelten Nachkommen auf dem Teller. Zählen Sie alle lebenden und sich entwickelnden Würmer im L-Vier-Stadium oder früher, um sicherzustellen, dass die F-Zwei-Generation die Ergebnisse nicht verwirrt. Entfernen Sie alle Würmer von der Platte, während sie gezählt werden.Bewahren Sie die Platten für weitere ein bis zwei Tage auf, bevor Sie sie erneut ritzen, um sicherzustellen, dass Tiere mit verzögertem Schlüpfen oder Entwicklung nicht übersehen werden. Die Wirkung der Sterilisationsmethode auf die Lebensdauer der Wildtyp-N2-Nematoden zeigte, dass die Veränderungen in der Lebensdauer der auf den NGM-Schneckenplatten gezüchteten Würmer denen der auf den NGM-Schneckenschneckenplatten gezüchteten Würmer oder der glp vier BN2-mutierten Tiere, die auf den NGM-Schneckenplatten gezüchtet wurden, ähnlich waren. Das kurzlebige HSF-Ein-Knockdown-Tier zeigte eine signifikante Verringerung der Lebensdauer für alle Bedingungen.Eine signifikante Abnahme der Anzahl der gelegten Eier und der Brutgröße wurde bei den HSF-Überexpressionstieren im Vergleich zu den Wildtypkontrollen festgestellt. Einige HSF-Tiere zeigten volle Sterilität, was darauf hindeutet, dass die reproduktive Gesundheit umgekehrt mit der Langlebigkeit korreliert werden kann. Die Prügelrate bot eine zuverlässige Methode zur Messung der Gesundheit während des Alterns, gemessen an einer signifikanten Abnahme der Prügel bei alten Tieren im Vergleich zu den jungen.Survival to Stress sind zuverlässige Assays zur Messung der Gesundheit des Organismus, Tunicamycin, das Retikulum-Stress verursacht, führte zu einer reduzierten Lebensdauer unabhängig von der Konzentration im Vergleich zur DMSO-Kontrolle. Die hohen Paraquat-Konzentrationen verkürzten die Lebensdauer signifikant, während niedrige Paraquat-Konzentrationen die Lebensdauer aufgrund der hormetischen Wirkung erhöhten. In den Thermotoleranz-Assays erhöhte die Überexpression von HSF die Thermotoleranz bei 37 Grad Celsius Für alle Lebensdauer- und Alterungsexperimente.Es ist wichtig, sich daran zu erinnern, dass Sterilisationstechniken eine pleiotrope Wirkung auf die Gesundheit des Organismus haben können, was sich auf die Ergebnisse auswirkt. Es gibt viele zusätzliche und komplementäre Ansätze zur Messung der Gesundheitsspanne, wenn Ausrüstung und Infrastruktur verfügbar sind, einschließlich Messungen der Transkription, Translationsproteinaggregation, Organelle, Morphologie und Stoffwechselfunktionen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

In diesem Artikel präsentieren wir ein allgemeines Protokoll zur Messung der Lebensdauer von Nematoden auf festen Medien mit UV-getötet bakterielle Lebensmittel erhalten.

Messung Caenorhabditis elegans Life Span auf festen Medien

In diesem Protokoll wird eine Methode zur...

Messung Caenorhabditis elegans Life Span in 96 Well Mikrotiterplatten

Dieses Video beschreibt eine traditionelle, plattenbasierte Methode zur Messung der Lebensdauer von C. elegans. Das Beispielprotokoll misst die Lebensdauer von Würmern, die mit RNAi behandelt wurden.

Lebensdaueranalyse: Messung der Langlebigkeit von C. elegans

Hier beschreiben wir die Replikatgruppe Methode, Vorgehensweise quantitativ Messen C. Elegans Lebensdauer/überleben und Healthspan in hohem Durchsatz und robuste Art und Weise, so dass Screening von vielen Bedingungen ohne Einbußen bei der Qualität der Daten. Dieses Protokoll beschreibt die Strategie und bietet ein Software-Tool für die Analyse der Replikatgruppe Daten.

Die Replica-Set-Methode: Eine Hochdurchsatz-Ansatz zu quantitativ Messen Caenorhabditis Elegans Lebensdauer

Darmmikroben können die Gesundheit ihres Wirts über spezifische oder konservierte Mechanismen positiv oder negativ beeinflussen. Caenorhabditis elegans ist eine bequeme Plattform, um nach solchen Mikroben zu suchen. Das vorliegende Protokoll beschreibt das Hochdurchsatz-Screening von 48 Bakterienisolaten auf Auswirkungen auf die Nematoden-Stressresistenz, die als Proxy für die Gesundheit von Würmern verwendet werden.

Hochdurchsatz-Screening mikrobieller Isolate mit Auswirkungen auf die Gesundheit von Caenorhabditis elegans

Hier wird ein optimiertes Protokoll für die Kultivierung isolierter einzelner Nematoden auf festen Medien in mikrofabrizierten Multi-Well-Bauelementen vorgestellt. Dieser Ansatz ermöglicht es, einzelne Tiere ihr ganzes Leben lang auf eine Vielzahl von Phänotypen im Zusammenhang mit dem Altern und der Gesundheit zu überwachen, einschließlich Aktivität, Körpergröße und -form, Bewegungsgeometrie und Überleben.

Langzeitkultur und Monitoring von isolierten Caenorhabditis elegans auf festen Medien in Multi-Well-Geräten

Die Bildgebungsplattform "The Lifespan Machine" automatisiert die lebenslange Beobachtung großer Populationen. Wir zeigen die Schritte, die erforderlich sind, um Lebensdauer-, Stressresistenz-, Pathogenese- und Verhaltensalterungstests durchzuführen. Die Qualität und der Umfang der Daten ermöglichen es den Forschern, Interventionen beim Altern trotz des Vorhandenseins biologischer und umweltbedingter Variationen zu untersuchen.

Hochdurchsatz-Behavioralitäts- und Lifespan-Assays mit der Lifespan Machine

Wir beschreiben ein kostengünstiges, konfigurierbares Morbidostat, das die Charakterisierung von Antibiotikaresistenzen durch dynamische Anpassung der Wirkstoffkonzentration ermöglicht. Das Gerät kann mit einer gemultiplexten mikrofluidischen Plattform integriert werden. Der Ansatz kann für Laborstudien zur Antibiotikaresistenz skaliert werden.

Design und die Verwendung eines Low Cost, Automatisierte Morbidostat für Adaptive Evolution der Bakterien unter Antibiotikums Selection

Genetisch kodierte Histon-miniSOG induziert genomweite vererbbare Mutationen in einem blauen Licht abhängig. Diese Mutagenese-Methode ist einfach, schnell, frei von giftigen Chemikalien und gut geeignet für vorwärts genetisches Screening und Transgen-Integration.

Optogenetische Zufallsmutagenese Mit Histon-miniSOG in<em&gt; C. elegans</em

Hier präsentieren wir Ihnen einen Rahmen für die breite Palette diätetische Einschränkung auf Genexpression und Lebensdauer zu beziehen. Wir beschreiben Protokolle für die breite Palette diätetische Einschränkung und quantitative Bildgebung der Genexpression unter diesem Paradigma. Wir skizzieren weitere numerische Analysen zu offenbaren zugrunde liegenden Informationen Bearbeitungsfunktionen der genetischen Schaltungen in Essen-sensing beteiligt.

Quantifizierung der Information kodiert durch Gene Expression Ebenen während der Lebensdauer Modulation unter breiter Palette diätetische Einschränkung in C. elegans

Lernen Sie kostengünstige Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheit bei Caenorhabditis elegans. Dieses Protokoll ermöglicht Forschern das Studium von Alterungsmechanismen mit einfachen Synchronisationstechniken.

Erhebung kostengünstiger Methoden zur Messung von Lebensdauer und Gesundheitserwartung bei Caenorhabditis elegans

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