Die Peel-Blot-Technik: Eine Kryo-EM-Probenvorbereitungsmethode zur Trennung einzelner Schichten von mehrschichtigen oder konzentrierten biologischen Proben

Die Peel-Blot-Technik ermöglicht die Trennung von mehrschichtigen und konzentrierten biologischen Kryo-EM-Proben in einzelne Schichten, um die Dicke zu reduzieren, die Konzentration zu erhöhen und die Bildverarbeitung zu erleichtern. Die Probenkonzentrationen können vor der Gittervorbereitung erhöht werden, und der Peel-Blot kann so eingestellt werden, dass eine dichte Verteilung von einschichtigen Proben für eine hocheffiziente Datenerfassung entsteht. Um zu beginnen, stapeln Sie zwei Stücke 20-25 Mikrometer porengroßes Filterpapier und legen Sie eine lange Paraffinfolie daneben mit dem Papier nach oben.

Legen Sie ein Stück Submikron-Filterpapier auf zwei weitere Stücke Filterpapier. Positionieren Sie die Antikapillarzange mit dem gebeugten Bein nach oben und dem geraden Bein nach unten und wählen Sie ein 600-Mesh-Gitter mit der glatten oder glänzenden Seite nach oben. Legen Sie die Pinzette auf eine Petrischale oder eine andere erhöhte Oberfläche, um den Kontakt des sauberen Gitters mit anderen Gegenständen zu vermeiden.

Entfernen Sie das Papier von der Paraffinfolie und ziehen Sie an den Seiten, um einen kleinen Rand zu erzeugen. Pipetten zwei 150 Mikroliter Tropfen also 4%Trehalose-Lösung bei etwa ein bis zwei Zentimetern von einer kurzen Seite der Paraffinfolie. Die beiden Tropfen sollten etwa einen Zentimeter voneinander entfernt sein.

Als nächstes gießen Sie auf einer separaten Bank oder auf dem Boden flüssigen Stickstoff in einen kleinen Polystyrolschaumbehälter und legen Sie einen kleinen Kryo-EM-Gitterbehälter in den flüssigen Stickstoff. Decken Sie den Polystyrolschaumbehälter mit fusselfreien Tüchern ab. Um den Kohlenstofffilm aus dem Glimmer zu schwimmen, verwenden Sie Dumont 5 Pinzette und berühren Sie eine Seite des Glimmers in einem leichten Winkel nach unten auf einem der Tropfen Trehaloselösung.

Bewegen Sie den Glimmer nach unten, damit sich die Wasserspannung langsam vom Kohlenstofffilm abhebt. Geben Sie den Glimmer frei, sobald der Kohlenstofffilm auf der Oberfläche des Tröpfchens schwimmt. Untersuchen Sie den Kohlenstofffilm visuell, um die Verwendung von Kohlenstoff mit Schäden in Form von Brüchen zu vermeiden.

Führen Sie das von der Antikapillarzange gehaltene Gitter in einem Winkel von 20-30 Grad in einen Trehalose-Tropfen an einer benachbarten Position ein und zentrieren Sie dann das Gitter unter dem Kohlenstofffilm. Nehmen Sie den Kohlenstofffilm auf, halten Sie das Gitter in der gleichen Ausrichtung und senken Sie das Gitter langsam auf die Oberfläche des zweiten Tropfens Trehalose, ohne die Oberflächenspannung des Tropfens zu brechen. Dadurch wird unnötiger Kohlenstofffilm entfernt, der sich möglicherweise um den Rand des Gitters auf die raue Seite gewickelt hat.

Drehen Sie die Antikapillarzange und legen Sie sie auf eine Petrischale mit der Kohlenstoffseite des Gitters nach unten. Pipettieren Sie 1,3 Mikroliter der Probe in den leichten Trehalose-Meniskus oben auf dem Gitter. Dann pipettieren Sie die Lösung ungefähr 8-10 mal, um die Trehalose und die Probe auf beiden Seiten des Gitters zu mischen und zu verteilen.

Pipettieren Sie einen oder mehrere 1,7-Mikroliter-Tropfen Trehalose-Lösung auf die Paraffinfolie, während Sie die Trehalose-Probenlösung eine Minute lang auf dem Gitter inkubieren. Drehen Sie das Gitter mit dem Kohlenstofffilm nach oben zurück in seine ursprüngliche Position und drücken Sie das Gitter mit der Antikapillarzange auf das Submikron-Filterpapier. Sobald die Lösung vom Filterpapier absorbiert wurde und der Kohlenstofffilm flach liegt, warten Sie drei Sekunden, bevor Sie das Gitter anheben und senkrecht auf den 1,7 Mikroliter Tropfen Trehalose-Lösung bewegen.

Diese Schritte können je nach Probe zwischen ein und drei Wiederholungen oder mehr wiederholt werden. Tupfen Sie das Raster auf den beiden Filterpapierstücken ab und heben Sie dann das Raster vom Filterpapier ab. Nach ca. 13 Sekunden, abhängig von Feuchtigkeit und Probenpuffer, tauchen Sie das Gitter in den flüssigen Stickstoff im kleinen Styroporbehälter und legen Sie es in den Kryo-EM-Gitterbehälter oder übertragen Sie es direkt zum Kryo-EM-Screening oder zur Datenerfassung.

Eine 2D-Kristallprobe der humanen Leukotrien-C4-Synthase, die der Peel-Blot-Methode unterzogen wurde, ist hier gezeigt. Der Bereich links vom Pfeil wurde weitgehend auf einschichtige 2D-Kristalle in einem Kontaktbereich zwischen dem Kohlenstofffilm und dem Gitterbalken reduziert, der abgezogen und dann verschoben wurde. Der Bereich rechts vom Pfeil wurde vom Peel-Blot nicht beeinflusst.

Die untere Bildhälfte stellt die Regionen mit großen, meist einschichtigen Phospho-Lipid-Doppelschichten dar, die aus der Anwendung des Peel-Blots resultieren. Die obere Hälfte befand sich nicht in einer Kontaktzone zwischen dem Gitterbalken und dem Kohlenstofffilm und enthielt somit vollständige Liposomen mit zwei Phospholipiddoppelschichten. Das Rasterquadrat eines Rasters mit 400 Maschen zeigt die Grundfläche des Rasterbalkens und die resultierenden Peel-Blotted-Bereiche sowie die Bereiche, die nicht mit einem Gitterbalken in Kontakt standen oder weniger Peel-Blot-Iterationen unterzogen wurden.

Diese Bilder zeigten das Blotting eines EM-Gitters, das durch die Rückinjektion auf einem Submikron-Filterpapier unter Verwendung eines sehr dünnen Kohlenstofffilms hergestellt wurde. Die Bilder sind Einzelbilder beim ersten Kontakt mit der Membran, 1.000 Millisekunden nach dem Kontakt und 2.000 Millisekunden nach dem Kontakt. Der Pfeil zeigt Gitterquadrate, in denen der Kapillardruck den Kohlenstofffilm zerrissen hat.

Die Vermeidung von Brüchen im Kohlenstofffilm und die Kombination von Submikron-Filterpapier mit einem 1,7-Mikroliter-Trehalose-Tropfen zum Absaugen und anschließenden Trennen der Schichten sind wichtige Schritte. Die geschälten Proben werden für die hochauflösende Kryo-EM-Datenerfassung verwendet, gefolgt von der Bildverarbeitung für die Strukturbestimmung. Der Peel-Blot ermöglicht die strukturierte Bestimmung von einschichtigen Protein-2D-Kristallen, die bisher zu dick für Kryo-EM waren.

Darüber hinaus kann es verschiedene Proben zu einzelnen Schichten auf Kohlenstofffolie konzentrieren.