Name: Entwicklung von Knock-out-Muskelzelllinien mittels Lentivirus-vermittelter CRISPR/Cas9-Gen-Editing (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 12 s
Description: Lernen Sie die Erstellung von Knock-out-Myoblasten mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing für die Muskelbiologie. Diese Methode ermöglicht effiziente Genfunktionsanalysen in menschlichen Muskelzellen.

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Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse der Association Française contre les myopathies (AFM-Téléthon) und der Region Auvergne-Rhône Alpes (AURA) finanziert.

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.

Ein wichtiger Schritt auf dem Weg zur Charakterisierung von Genen unbekannter Funktion, die an Pathologien beteiligt sind, ist die Entwicklung relevanter zellulärer Modelle, um die Funktion dieser Gene zu untersuchen. Der Einsatz von Gen-Editing mit CRISPR/Cas9 ist ein exponentiell wachsendes Forschungsgebiet, und die Entwicklung von Knock-out-Modellen, wie sie hier vorgestellt werden, gehört zu den am weitesten verbreiteten Anwendungen. In diesem Zusammenhang schlagen wir hier ein vielseitiges Protokoll vor, um einen me...

Mit dem Fortschritt der Gensequenzierung und der Identifizierung von Mutationen in Genen unbekannter Funktionen in einem bestimmten Gewebe stellt die Entwicklung relevanter zellulärer Modelle zum Verständnis der Funktion eines neuen Zielgens und zur Bestätigung seiner Beteiligung an den damit verbundenen pathophysiologischen Mechanismen ein wesentliches Werkzeug dar. Darüber hinaus sind diese Modelle von großer Bedeutung für zukünftige therapeutische Entwicklungen 1,2 und stellen eine interessante Alternative zur Entwicklung von Knock-out-Tiermodellen in direkter Linie mit den internationalen Empfehlungen zur Reduzierung des Einsatzes von Tieren in Experimenten dar. Die Genbearbeitung mit CRISPR/Cas9 gehört zu den leistungsfähigsten derzeit verfügbaren Werkzeugen, was die Entwicklung vieler Knock-out/Knock-in-Modelle ermöglicht hat, und die gezielte Genvalidierung mit CRISPR/Cas9 gehört zu den am weitesten verbreiteten Anwendungen von CRISPR/Cas93. Der Erfolg der Genbearbeitung hängt von der Fähigkeit ab, die CRISPR-Werkzeuge (die Leit-RNAs und die Nuklease Cas9) in das Zielzellmodell einzuführen, was in vielen schwer zu transfizierenden Zellen wie Muskelzellen eine Herausforderung darstellen kann4. Diese Herausforderung kann mit der Verwendung von Viren, in der Regel Lentivirus, überwunden werden, die den großen Vorteil haben, viele Zelltypen effizient zu transduzieren und ihr Transgen zu liefern. Sein Hauptnachteil ist jedoch die Integration des Transgens in das Genom der Wirtszelle, was zu einer möglichen Veränderung der an der Integrationsstelle lokalisierten Gene und zur dauerhaften Expression des Transgens führt, was im Falle der Nuklease Cas9 zu schädlichen Folgen führenwürde 5. Merienne und Kollegen6 haben eine intelligente Lösung vorgeschlagen, die darin besteht, eine Guide-RNA in die Zellen einzuführen, die auf das Cas9-Gen selbst abzielt und zu einer Inaktivierung von Cas9 führt. Eine Adaption dieser Strategie wird hier als benutzerfreundliches und vielseitiges Protokoll vorgestellt, das es ermöglicht, praktisch jedes Gen in schwer zu transfizierenden Zellen auszuschalten.
Ziel des hier vorgestellten Protokolls ist es, die Inaktivierung eines interessierenden Gens in immortalisierten Muskelzellen zu induzieren. Es kann verwendet werden, um jedes Gen von Interesse in verschiedenen Arten von unsterblichen Zellen auszuschalten. Das hier beschriebene Protokoll enthält Schritte zum Design der Leit-RNAs und ihrer Klonierung in lentivirale Plasmide, zur Herstellung der CRISPR-Werkzeuge in lentiviralen Vektoren, zur Transduzierung der Zellen mit den verschiedenen Lentiviren und zum Klonen der Zellen, um eine homogene editierte Zelllinie zu erzeugen.
Unter Verwendung dieses Protokolls wurden verewigte menschliche Skelettmuskelzellen mit Deletion des Typ-1-Ryanodinrezeptors (RyR1) entwickelt, einem essentiellen Kalziumkanal, der an der intrazellulären Kalziumfreisetzung und Muskelkontraktion beteiligt ist7. Der Knock-out (KO) des Gens wurde auf Proteinebene mit Western Blot und auf funktioneller Ebene mit Kalziumbildgebung bestätigt.

<table><tbody><tr><td>Anti-CACNA1S-Antikörper</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HPA048892</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>Blp I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0585S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>CalPhos Säugetier-Transfektionskit</td><td>Takara</td><td>631312&nbsp;</td><td>Transfektions-Kit</td></tr><tr><td>Easy Blot gegen Maus</td><td>IgG GeneTex</td><td>GTX221667-01</td><td>HRP Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Easy Blot gegen Kaninchen</td><td>IgG GeneTex</td><td>GTX221666</td><td>HRP Sekundärantikörper</td></tr><tr><td>Fluo-4 direkt</td><td>Molekulare Sonden</td><td>F10472</td><td>Calcium Imaging</td></tr><tr><td>GAPDH(14C10) Kaninchen mAb&nbsp;</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>#2118</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Fermentas</td><td>ER0501</td><td>Restriktionsenzym</td></tr><tr><td>InFusion HD Precision Plus</td><td>Takara</td><td>638920</td><td>Ligationskit</td></tr><tr><td>MasterMix Phusion High Fidelity mit GC</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F532L</td><td>Mix für PCR-Reaktionen mit High Fidelity Taq-Polymerase und dNTPs</td></tr><tr><td>Myosin-Schwerketten-Antikörper</td><td>DHSB</td><td>MF20</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>NucleoBond Xtra Maxi EF</td><td>Macherey-Nagel</td><td>REF&nbsp; 740424</td><td>Maxipreparation Kit für die Aufreinigung von Plasmiden</td></tr><tr><td>NucleoSpin Gel und PCR Clean-up</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740609</td><td>DNA-Aufreinigung</td></tr><tr><td>NucleoSpin Tissue</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740952 Kit für die DNA-Extraktion aus Zellen</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 Chemisch kompetent&nbsp;E. coli</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C737303</td><td>Chemisch kompetente Zellen</td></tr><tr><td>Plasmid #87904</td><td>Addgene</td><td>87904</td><td>Lentivirales Plasmid, das für das SpCas9 kodiert (für LV-Cas9)</td></tr><tr><td>Plasmid #87919</td><td>Addgene</td><td>87919</td><td>Lentivirales Rückgrat zum Einsetzen einer Kassette mit Führungen (für LV-guide-target)</td></tr><tr><td>Plasmid #12260</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td>Lentivirales Plasmid, das für lentivirale Verpackung kodiert GAG POL</td></tr><tr><td>Plasmid #8454</td><td>Addgene</td><td>8454</td><td>Lentivirales Plasmid-kodierendes Hüllprotein zur Herstellung von lentiviralen und MuLV-retroviralen Partikeln</td></tr><tr><td>V5 Tag Monoklonaler Antikörper</td><td>Invitrogen</td><td>R96025&nbsp;</td><td>Primärer Antikörper</td></tr><tr><td>XL10-Gold Ultracompetent Cells</td><td>Agilent</td><td>200317</td><td>Chemisch kompetente Zellen</td></tr><tr><td>Xma I</td><td>NE BioLabs</td><td>R0180S</td><td>Restriktionsenzym</td></tr></tbody></table>

entwicklung von knock-out-muskelzelllinien mittels lentivirus-vermittelter crispr/cas9-gen-editing

Development of Knock-Out Muscle Cell Lines using Lentivirus-Mediated CRISPR/Cas9 Gene Editing

Eine wichtige Anwendung von Clustered Regulatory Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR)/Cas 9 ist die Entwicklung von Knock-out-Zelllinien, insbesondere zur Untersuchung der Funktion neuer Gene / Proteine, die mit einer Krankheit assoziiert sind und während der genetischen Diagnose identifiziert wurden. Für die Entwicklung solcher Zelllinien müssen zwei Hauptprobleme entwirrt werden: das Einfügen der CRISPR-Werkzeuge (die Cas9- und die Guide-RNA) mit hoher Effizienz in die ausgewählten Zellen und die Beschränkung der Cas9-Aktivität auf die spezifische Deletion des ausgewählten Gens. Das hier beschriebene Protokoll widmet sich dem Einsetzen der CRISPR-Werkzeuge in schwer transfizierende Zellen, wie z.B. Muskelzellen. Dieses Protokoll basiert auf der Verwendung von Lentiviren, die mit öffentlich zugänglichen Plasmiden hergestellt werden und für die alle Klonierungsschritte beschrieben werden, um auf ein Gen von Interesse abzuzielen. Die Kontrolle der Cas9-Aktivität wurde unter Verwendung einer Adaption eines zuvor beschriebenen Systems namens KamiCas9 durchgeführt, bei dem die Transduktion der Zellen mit einem Lentivirus, das eine auf das Cas9 abzielende Leit-RNA kodiert, die schrittweise Abschaffung der Cas9-Expression ermöglicht. Dieses Protokoll wurde auf die Entwicklung einer RYR1-Knockout-Zelllinie für menschliche Muskeln angewendet, die auf Protein- und Funktionsebene weiter charakterisiert wurde, um den Knockout dieses wichtigen Kalziumkanals zu bestätigen, der an der intrazellulären Kalziumfreisetzung des Muskels und an der Erregungs-Kontraktionskopplung beteiligt ist. Das hier beschriebene Verfahren kann leicht auf andere Gene in Muskelzellen oder in anderen schwer zu transfektierenden Zellen angewendet werden und liefert wertvolle Werkzeuge, um diese Gene in menschlichen Zellen zu untersuchen.

Dieses Protokoll wurde auf immortalisierte Myoblasten eines gesunden Subjekts15 (sogenannte HM-Zellen, für menschliche Myoblasten) angewendet, in denen das RyR1 zuvor16 charakterisiert wurde, um das RYR1-Gen, das für das RyR1-Protein kodiert, auszuschalten. Das Design der Guides-RNA wurde vorgenommen, um die Sequenz zu löschen, die einen Teil des Exons 101 und das Intron 101 des Gens umfasst. Das Löschen eines Teils des Exon 101 wird voraussichtlich zu einer Störun...

Das Protokoll beschreibt, wie Knock-out-Myoblasten mit CRISPR/Cas9 erzeugt werden können, beginnend mit dem Design von Guide-RNAs bis hin zur zellulären Klonierung und Charakterisierung der Knock-out-Klone.

Entwicklung von Knock-out-Muskelzelllinien mittels Lentivirus-vermittelter CRISPR/Cas9-Gen-Editing

One important application of clustered regulatory interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas 9 is the development of knock-out cell lines, ...

Dieses Protokoll ermöglicht die Entwicklung von Muskelzell-Knockout in jedem Gen, um die Funktion dieses Gens im Muskel weiter zu untersuchen. Der Vorteil ist, dass es billig und schneller als die Entwicklung von Knock-out-Tieren ist, jedes Gen zu untersuchen. Diese Technik kann beispielsweise verwendet werden, um die Beteiligung eines neu identifizierten Gens an einer Myopathie zu untersuchen.Wenn die hier beschriebene Technik auf iPS-Zellen angewendet wird, kann dies zur Entwicklung von Knock-out-Zellen für jedes Gen in jeder Art von Zellen führen. Um mit geclusterten, regelmäßig interspaced kurzen palindromischen Wiederholungen oder CRISPR-vermittelter Gendeletion zu beginnen, verwenden Sie zunächst Genom-Browser-Tools wie ensembl. org, um das Zielgen zusammen mit den DNA-Sequenzen auf beiden Seiten zu identifizieren.Um die Liste der Gen-Exons zu erhalten, klicken Sie zuerst auf das Transkript der Proteinkodierungssequenz und dann auf Exons. Klicken Sie anschließend auf Sequenz herunterladen und wählen Sie nur Genomische Sequenz, um die vollständige Konsenssequenz des gesamten Gens herunterzuladen. Scrollen Sie durch die Liste der Exons und Introns des Gens, um die Zielversionen auszuwählen.Für das Design der Leit-RNA wählen Sie zunächst Nukleotidsequenzen der Introns unmittelbar vor und hinter der Zielsequenz aus. Dann gehen Sie zu einer Website wie crispr.tefor. und verwenden Sie die ausgewählten Sequenzen, um zwei Führungs-RNAs zu entwerfen, die jeweils 20 Nukleotide lang sind, ohne das Protospacer Adjacent Motif, getrennt durch einige hundert Basenpaare.Als nächstes bestimmen Sie die umgekehrte Komplementsequenz für jede Führungs-RNA und ordnen Sie die Primer an. Um Guide-RNA-Kassetten für die Plasmidklonierung zu konstruieren, führen Sie zuerst eine PCR mit einem Satz Primer unter Verwendung des im Text beschriebenen Rezepts und Programms durch und trennen Sie dann die PCR-Produkte in 1% Agarosegel mit Tris-Borat-EDTA-Puffer. Als nächstes entfernen Sie das 300-Basenpaar-Fragment und reinigen Sie es mit einem Kit.In ähnlicher Weise reinigen Sie nach dem Ausführen einer weiteren PCR mit dem anderen Primer-Set ein langes DNA-Fragment mit 400 Basen in 20 Mikroliter Elutionspuffer. Um die Leit-RNA-Kassetten in ein lentivirales Plasmid-Rückgrat einzuführen, wird zunächst eine doppelte Verdauungsreaktion des Plasmids mit den Restriktionsenzymen Xma1 und Blp 1 wie im Text beschrieben aufgebaut. Nachdem Sie das Reaktionsrohr bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubiert haben, inkubieren Sie es bei 65 Grad Celsius für 20 Minuten, lassen Sie dann das Verdauungsprodukt in einem 1% Agarose-Gel laufen und reinigen Sie das Plasmid von etwa 10 Kilobasenpaaren mit einem geeigneten Kit.Quantifizieren Sie auch das gereinigte Produkt, indem Sie die optische Dichte messen. Um die Leit-RNA-Kassette mit dem Plasmid zu ligrieren, bereiten Sie eine Reaktionsmischung mit der gereinigten Leit-RNA, der linearisierten Plasmid-DNA, dem Enzym und dem Wasser auf ein Endvolumen von 10 Mikrolitern vor und inkubieren Sie dann das Reaktionsrohr bei 50 Grad Celsius für 15 Minuten, um das endgültige Plasmid zu erzeugen, das als pGuide bezeichnet wird. Für die Lentivirus-Produktion saatieren Sie zuerst eine 145-Zentimeter-Platte mit 1 Million HEK 293-Zellen in DMEM mit hoher Glukose und Pyruvat, ergänzt durch 10% FBS und 1% Penicillin oder Streptomycin.Dann züchten Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für drei Tage in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator. Überprüfen Sie am vierten Tag die Zellen, um eine Konfluenz von 60 bis 65% sicherzustellen. Als nächstes bereiten Sie die Transfektionslösung vor, die aus dem interessierenden Plasmid, dem Plasmid, das für die Virushülle kodiert, dem lentiviralen Verpackungsplasmid psPAX2 und Calciumphosphat besteht.Stellen Sie das endgültige Volumen auf 1000 Mikroliter mit Wasser ein. Dann die Transfektionslösung tropfenweise auf einen Milliliter 2X HBS unter Rühren geben und bei Raumtemperatur für mindestens 10 Minuten inkubieren. Danach fügen Sie die Lösung dropwise zu den Zellen hinzu.Für eine homogene Verteilung der Transfektionslösung neigen Sie die Platte vorsichtig in alle Richtungen und inkubieren Sie dann die Zellen bei 37 Grad Celsius in einem 5% Kohlendioxid-Inkubator für mindestens fünf Stunden. Als nächstes entfernen Sie das Medium von den Platten und waschen Sie die Zellen mit PBS, um die Transfektionsreagenzien loszuwerden, und fügen Sie dann 12 Milliliter frisches Medium hinzu. Nach 48 Stunden Inkubation bei 37 Grad Celsius die Medien aus allen Platten in einem Rohr zusammenführen.Legen Sie das Rohr in einen versiegelten Eimer und zentrifugieren Sie bei 800 mal G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius, filtern Sie dann den Überstand mit einem 0,45-Mikrometer-Filter und zentrifugieren Sie das Filtrat bei 68, 300 mal G für zwei Stunden bei vier Grad Celsius mit einem schwingenden Eimerrotor. Nachdem Sie den Überstand entfernt haben, halten Sie die Schläuche fünf bis 10 Minuten lang auf einem Papiertuch in einem Sicherheitsschrank auf dem Kopf, um die Flüssigkeit aus den Pellets maximal zu entfernen. Fügen Sie 100 Mikroliter HEC-Proliferationsmedium hinzu und halten Sie die Röhrchen mindestens zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius.Dann suspendieren Sie das Pellet durch Pipettieren. Nachdem Sie alle suspendierten Pellets gesammelt haben, machen Sie Aliquots von 10 oder 25 Mikrolitern und lagern Sie die Aliquots nach dem Einfrieren in flüssigem Wasserstoff bei minus 80 Grad Celsius. Für die Myoblastentransduktion bestücken Sie zuerst jedes Well einer 96-Well-Platte mit 100 Mikrolitern Proliferationsmedium, das 10.000 Myoblastenzellen enthält.Fügen Sie am nächsten Tag vorberechnete Volumina von LV-Führungen und LV Cas9 zu den Zellen in einer Sicherheitswerkbank hinzu. Nach fünf Tagen Inkubation die Zellen aus dem Brunnen durch Zugabe von Trypsin freisetzen. Nachdem Sie die Zellzahlen gezählt haben, übertragen Sie die Zellen aus Vertiefungen mit 40 bis 50% Konfluenz auf eine neue Platte.Fügen Sie nach fünf Stunden Inkubation berechnete Mengen an LV-Killer bei einer Vielzahl von Infektionen von 20 hinzu und inkubieren Sie für fünf bis 10 Tage oder mindestens zwei Passagen dazwischen. Zur funktionellen Charakterisierung der geneditierten Klone mittels Calcium-Imaging werden 50.000 Zellen in der Mitte einer lamininbeschichteten 35-Millimeter-Schale plattiert. Um eine Differenzierung zu induzieren, fügen Sie das Differenzierungsmedium wie im Text beschrieben hinzu.Nehmen Sie nach sechs Tagen Inkubation das Kulturmedium ab und grenzen Sie die Zellen mit einem hydrophoben Pen ab. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Fluo-4 Direct, verdünnt eins zu eins in Differenzierungsmedium, zu den differenzierten Myotuben hinzu. Nachdem Sie das Geschirr 30 Minuten lang bei 37 Grad Celsius inkubiert haben, waschen Sie die Zellen zweimal mit Krebspuffer, ergänzt mit einem Milligramm pro Milliliter Glukose.Verwenden Sie als Nächstes ein inverses Fluoreszenzmikroskop oder ein konfokales Mikroskop mit einem 10-fachen Objektiv, um die Fluoreszenzvariationen mit einer Rate von einem Bild pro Sekunde für 90 Sekunden zu messen und wählen Sie ein Feld mit mindestens 10 Myoröhrchen. Nach dem Entfernen des zusätzlichen Krebspuffers stimulieren Sie die Zellen mit zwei Millilitern Kaliumchlorid zur Membrandepolarisation oder zwei Millilitern Florochloralmetakresol oder 4CmC oder RyR1 direkter Stimulation. Visualisieren Sie die Fluoreszenzvariation nach der Stimulation und quantifizieren Sie dann die Fluoreszenzvariation in jeder Myotube.Dieses Protokoll konnte erfolgreich verwendet werden, um das Gen RyR1 aus menschlichen Myoblasten auszuschalten, was zu einer kürzeren genomischen DNA in den Zellen führte. RyR1-Knock-out wurde auch auf Proteinebene bestätigt, da das RyR1-Protein in den Zielzellen durch Western Blotting nicht nachgewiesen werden konnte. Das Fehlen von RyR1-Aktivität in Myotuben, die sich von den RyR1-Knock-out-Zellen unterschieden, wurde durch Fluo-4-Calcium-Bildgebung nach direkter RyR1-Stimulation durch 4CmC oder indirekter Stimulation durch Kaliumchlorid-induzierte Membrandepolarisation weiter verifiziert.Die Sequenz, die gelöscht wird, sollte für die Vorhersage eines funktionellen Proteins erforderlich sein. Diese Technik ist ideal für die Entwicklung postgenomischer Werkzeuge, um die Beteiligung neuer Gene an Muskelerkrankungen zu untersuchen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Der CRISPR / Cas9 System bietet das Potenzial, um gezielte Genom Bearbeitung zugänglich und erschwinglich für die wissenschaftliche Gemeinschaft. Dieses Protokoll soll zeigen, wie Viren zu schaffen, die ein Gen von Interesse unter Verwendung des CRISPR / Cas9 System Knockout wird, und sie dann stereotaxically in die erwachsenen Maus Gehirn zu injizieren.

Planung, Verpackung und Lieferung von hohen Titern CRISPR Retro und Lentiviren über stereotaktische Injektion

Jüngste Fortschritte in der Fähigkeit, somatische Zelllinien genetisch zu manipulieren, haben großes Potenzial für grundlegende und angewandte Forschung. Hier präsentieren wir zwei Ansätze für CRISPR / Cas9-produzierte Knockout-Produktion und Screening in Säugetierzelllinien, mit und ohne Verwendung von selektierbaren Markern.

Selektionsabhängige und unabhängige Erzeugung von CRISPR / Cas9-vermittelten Gen-Knockouts in Säugetierzellen

Ein Protokoll für schnelle CRISPR/Cas9-vermittelte gen Störung bei Maus und humane primäre hämatopoetische Zellen wird in diesem Artikel beschrieben. Cas9-SgRNA Ribonucleoproteins sind über Elektroporation mit SgRNAs erzeugt durch in-vitro- Transkription und kommerzielle Cas9 eingeführt. Hohe Wirkungsgrade Bearbeitung werden mit wenig Zeit und finanziellem Aufwand erreicht.

Hocheffiziente gen Störung der murinen und menschlichen hämatopoetischen Vorläuferzellen von CRISPR/Cas9

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur primären oder erweiterten menschlichen natürlichen (NK) Killerzellen mit Cas9 Ribonucleoproteins (Cas9/RNPs) genetisch zu verändern. Mithilfe dieses Protokolls erzielten wir menschliche NK-Zellen für Umwandlung Wachstumsfaktor-b-Rezeptor 2 (TGFBR2) und Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase 1 (HPRT1) mangelhaft.

Generation von Knock-out-Grund- und erweiterten menschlichen NK-Zellen mit Cas9 Ribonucleoproteins

Beschrieben werden Protokolle für die hocheffiziente Genombearbeitung von murinen hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen (HSPC) durch das CRISPR/Cas9-System zur schnellen Entwicklung von Mausmodellsystemen mit hämatopoetischen systemspezifischen Genmodifikationen.

Lentiviral CRISPR/Cas9-Vermittelte Genombearbeitung zur Untersuchung hämatopoetischer Zellen in Krankheitsmodellen

Hier stellen wir ein Protokoll zur Entwicklung genetisch veränderter Mausmodelle mit embryonalen Stammzellen vor, insbesondere für große DNA-Knock-In (KI). Dieses Protokoll wird mithilfe der CRISPR/Cas9-Genom-Editierung optimiert, was zu einer signifikant verbesserten KI-Effizienz im Vergleich zur konventionellen homologen rekombinationsvermittelten linearisierten DNA-Targeting-Methode führt.

CRISPR/Cas9-vermitteltes hocheffizientes Gen-Targeting in embryonalen Stammzellen zur Entwicklung genmanipulierter Mausmodelle

Da CRISPR-bezogene Protokolle immer nützlicher und zugänglicher werden, können unter bestimmten experimentellen Bedingungen immer noch Komplikationen und Hindernisse auftreten. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer Rezeptor-interagierenden Serin/Threonin-Proteinkinase 1 (RIPK1/RIP1) Knockout-Zelllinie unter Verwendung von CRISPR/Cas9 und hebt mögliche Herausforderungen hervor, die während dieses Prozesses auftreten.

Generierung einer RIP1-Knockout-U937-Zelllinie mit dem CRISPR-Cas9-System

Die vorgestellte Methode beschreibt die Erzeugung eines CRISPR-vermittelten Gen-Knockouts in der humanen embryonalen Stammzelllinie (hESC) H9, die sgRNAs, die auf das L2HGDH-Gen abzielen, unter Verwendung eines hocheffizienten lentiviralen Gentransfersystems stabil exprimiert.

CRISPR-Cas9-vermittelte Gendeletion in humanen pluripotenten Stammzellen, die unter feederfreien Bedingungen kultiviert wurden

Die THP-1-Zelllinie wird häufig als Modell verwendet, um die Funktionen menschlicher Monozyten/Makrophagen in verschiedenen biologiebezogenen Forschungsbereichen zu untersuchen. Dieser Artikel beschreibt ein Protokoll für effizientes CRISPR-Cas9-basiertes Engineering und Einzelzell-Klonisolierung, das die Produktion robuster und reproduzierbarer phänotypischer Daten ermöglicht.

Elektroporationsbasierter CRISPR-Cas9-vermittelter Gen-Knockout in THP-1-Zellen und Einzelzell-Klonisolierung

Details werden dargelegt, wie die QTL-Kartierung mit einer genomalen Genomsequenz auf genetischer Weise zur Identifizierung eines Arzneimittelresistenzgens in Toxoplasma gondii verwendet werden kann und wie dies mit dem CRISPR / Cas9-System verifiziert werden kann, das ein genomisches Ziel effizient bearbeitet, in diesem Fall die Arzneimittelresistenzgen...

QTL Mapping und CRISPR / Cas9 Bearbeitung zur Identifizierung eines Drug Resistance Gen in<em&gt; Toxoplasma gondii</em

Lernen Sie die Erstellung von Knock-out-Myoblasten mittels CRISPR/Cas9-Gen-Editing für die Muskelbiologie. Diese Methode ermöglicht effiziente Genfunktionsanalysen in menschlichen Muskelzellen.

Entwicklung von Knock-out-Muskelzelllinien mittels Lentivirus-vermittelter CRISPR/Cas9-Gen-Editing

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