Ein standardisiertes präanalytisches Flüssigbiopsieprotokoll für nachgeschaltete zirkulatorfreie DNA-Anwendungen

Dies ist ein Standardprotokoll für die Verarbeitung und Lagerung von Blutproben für nachgeschaltete Flüssigbiopsieanwendungen auf Basis zirkulierender freier DNA. Dies ist das erste veröffentlichte Standardprotokoll, obwohl die Technik seit einigen Jahren verwendet wird. Es ist leicht zu folgen mit Standardausrüstung, die in den meisten translationalen oder wissenschaftlichen Laboratorien verfügbar ist.

Das Protokoll kann von allen Labormitarbeitern durchgeführt werden. Das Protokoll hilft, die Art und Weise, wie wir Proben sammeln und lagern, zu standardisieren, was sich letztendlich auf die Klinik auswirkt und die Variabilität zwischen verschiedenen Zentren reduziert, die die gleiche oder eine ähnliche nachgelagerte Analyse durchführen, bei der Präzision von größter Bedeutung ist. Diese Methode ist besonders nützlich in der onkologischen Forschung und auch in klinischen Anwendungen.

Es kann jedoch auch bei anderen Nicht-Krebserkrankungen angewendet werden, bei denen auch die Flüssigbiopsie verwendet wird. Nachdem die Blutprobe zentrifugiert wurde, kann es schwierig sein zu wissen, wie viel Plasma oder Serum entfernt werden muss, aber die Einhaltung dieser spezifischen Richtlinien wird dabei helfen. Der Rest des Protokolls ist sehr einfach zu befolgen, mit begrenzter Erfahrung im Labor.

Jorge, ein Techniker aus unserem Labor, demonstriert das Verfahren. Um zu beginnen, zentrifugieren Sie das Röhrchen mit frischem Blut bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 1600 mal g, wobei die maximale Pause angewendet wird. Entfernen Sie das Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge.

Die obere Phase des Serumüberstands erscheint klar und gelblich. Überprüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist, und notieren Sie gegebenenfalls das Vorhandensein einer Hämolyse. In einer Biosicherheitswerkbank der Klasse II wird das Serum als 250-Mikroliter-Aliquots in Sammelröhrchen überführt.

Die Aliquots müssen korrekt gekennzeichnet sein. Gefrieren Sie das Serum sofort aufrecht in der Aufbewahrungsbox bei minus 80 Grad Celsius und notieren Sie den Zeitpunkt der Probenlagerung. Stellen Sie sicher, dass die Proben innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von vier Stunden verarbeitet wurden.

Zentrifugieren Sie das EDTA-Röhrchen bei Raumtemperatur für 10 Minuten bei 1600 mal g, wobei die maximale Pause angewendet wird. Nach der Zentrifugation erscheint der Plasmaüberstand klar und gelblich. Überprüfen Sie, ob die Probe Anzeichen einer Hämolyse aufweist, und übertragen Sie das Plasma mit einer serologischen Einwegpipette in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, ohne die Zellschicht zu stören.

Lassen Sie ein kleines Restvolumen an Plasma über der Zellschicht bei etwa fünf Millimetern. Wenn eine Hämolyse beobachtet wird, verwerfen Sie die Probe zur weiteren Analyse. Zentrifugieren Sie das Plasma und ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen, um alle verbleibenden intakten Blutzellen aus dem ersten Zentrifugationsschritt zu entfernen.

Entfernen Sie vorsichtig das Röhrchen aus der Zentrifuge, nicht das Zellpellet am Boden des Röhrchens, und übertragen Sie ein bis vier Milliliter Plasma mit einer serologischen Einwegpipette auf ein bis vier Milliliter Polypropylen-Kryobios oder Eppendorfs. Ein Restvolumen des Plasmas muss am Boden des Röhrchens belassen werden, um eine Verunreinigung des Plasmas mit Blutzellen zu vermeiden. Gefrieren Sie das Plasma sofort aufrecht in der Aufbewahrungsbox bei minus 80 Grad Celsius und notieren Sie den Zeitpunkt der Probenlagerung.

Stellen Sie sicher, dass die Proben korrekt gekennzeichnet sind und innerhalb des erforderlichen Zeitrahmens von vier Stunden verarbeitet wurden. Sammeln Sie die Zellschicht mit einem P1000 und einer gefilterten Spitze und übertragen Sie sie in ein Zwei-Milliliter-Röhrchen. Sofort einfrieren und bei minus 80 Grad Celsius lagern.

Ein Beispiel für eine qualitativ hochwertige cfDNA-Extraktion, die für nachgelagerte Anwendungen verwendet werden kann, wird hier gezeigt, während dieses grafische Bild ein Beispiel für eine ungeeignete Probe mit einem hohen Grad an genomischer Kontamination darstellt. Die Plasma- oder Serumfraktion muss eine gelbe Farbe haben. Dies kann je nach Probe variieren.

Proben mit Hämolyse sollten verworfen werden. Achten Sie darauf, beim Entfernen der Plasmafraktion kein Zellpellet zu entfernen. Dieses Protokoll kann auch für andere nukleinsäurebasierte und Proteinanwendungen verwendet werden, wie z.B. den Nachweis von nicht-kodierenden RNAs oder Proteinen in Serum- und Plasmaproben unter Verwendung von Immundetektionstechniken.

Dies ist eine sehr Standardtechnik, die in vielen Laboratorien verwendet wird. Dieses Protokoll hilft Forschern zu standardisieren, wie wir unsere Analysen durchführen, da dies ein entscheidender Aspekt ist, der für zukünftige klinische Anwendungen notwendig ist.