Name: Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T12:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 41 s
Description: Erfahren Sie die PET-Bildgebung von CD19+ B-Zellen im ZNS eines EAE-Mausmodells. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung und Visualisierung von B-Zell-Dynamiken bei neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Wir sind dankbar für die Unterstützung durch die SCi3-Kleintier-Bildgebungseinrichtung in Stanford und Dr. Frezghi Habte für seine technische Unterstützung beim PET/CT. LC-MS wird von den Kernmitarbeitern der Stanford University Mass Spectrometry (SUMS) Core Facility durchgeführt, und wir danken den Mitarbeitern für diese Dienstleistung. Wir danken Horizon Therapeutics für die freundliche Bereitstellung des hCD19-mAb und insbesondere Jodi Karnell für ihre technische Anleitung und Unterstützung. Diese Arbeit wurde vom NIH NINDS finanziert (1 R01 NS114220-01A1).

<ol><li>Dobson, R., Giovannoni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+sclerosis+-+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Neurology%22%5BJournal%5D)">Multiple sclerosis - a review.</a> European Journal of Neurology. 26 (1), 27-40 (2019).</li>
<li>Karussis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+diagnosis+of+multiple+sclerosis+and+the+various+related+demyelinating+syndromes%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Autoimmunity%22%5BJournal%5D)">The diagnosis of multiple sclerosis and the various related demyelinating syndromes: A critical review.</a> Journal of Autoimmunity. 48-49, 134-142 (2014).</li>
<li>Hauser, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B-cell+depletion+with+Rituximab+in+relapsing-remitting+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22The+New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">B-cell depletion with Rituximab in relapsing-remitting multiple sclerosis.</a> The New England Journal of Medicine. 358 (7), 676-688 (2008).</li>
<li>Chen, D., Gallagher, S., Monson, N. L., Herbst, R., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inebilizumab%2C+a+B+cell-depleting+anti-CD19+antibody+for+the+treatment+of+autoimmune+neurological+diseases%3A+Insights+from+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Inebilizumab, a B cell-depleting anti-CD19 antibody for the treatment of autoimmune neurological diseases: Insights from preclinical studies.</a> Journal of Clinical Medicine. 5 (12), 107(2016).</li>
<li>Stevens, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+CD19+PET+tracer+for+detecting+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Development of a CD19 PET tracer for detecting B cells in a mouse model of multiple sclerosis.</a> Journal of Neuroinflammation. 17 (1), 275(2020).</li>
<li>Chaney, A. M., Johnson, E. M., Cropper, H. C., James, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PET+imaging+of+neuroinflammation+using+%5B11C%5DDPA-713+in+a+mouse+model+of+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">PET imaging of neuroinflammation using [11C]DPA-713 in a mouse model of ischemic stroke.</a> Journal of Visualized Experiments. (136), e57243(2018).</li>
<li>Lyons, J. -A., Ramsbottom, M. J., Cross, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+role+of+antigen-specific+antibody+in+experimental+autoimmune+encephalomyelitis+induced+by+recombinant+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Critical role of antigen-specific antibody in experimental autoimmune encephalomyelitis induced by recombinant myelin oligodendrocyte glycoprotein.</a> European Journal of Immunology. 32 (7), 1905-1913 (2002).</li>
<li>Haugen, M., Frederiksen, J. L., Degn, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cell+follicle-like+structures+in+multiple+sclerosis-With+focus+on+the+role+of+B+cell+activating+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroimmunology%22%5BJournal%5D)">cell follicle-like structures in multiple sclerosis-With focus on the role of B cell activating factor.</a> Journal of Neuroimmunology. 273 (1-2), 1-7 (2014).</li>
<li>James, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+B+cells+in+a+mouse+model+of+multiple+sclerosis+using+64Cu-Rituximab+PET%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nuclear+Medicine%22%5BJournal%5D)">Imaging B cells in a mouse model of multiple sclerosis using 64Cu-Rituximab PET.</a> Journal of Nuclear Medicine. 58 (11), 1845-1851 (2017).</li>
<li>Zeglis, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-mediated+methodology+for+the+site-specific+radiolabeling+of+antibodies+based+on+catalyst-free+click+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An enzyme-mediated methodology for the site-specific radiolabeling of antibodies based on catalyst-free click chemistry.</a> Bioconjugate Chemistry. 24 (6), 1057-1067 (2013).</li>
<li>Lyons, J. -A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((B+cells+are+critical+to+induction+of+experimental+allergic+encephalomyelitis+by+protein+but+not+by+a+short+encephalitogenic+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">B cells are critical to induction of experimental allergic encephalomyelitis by protein but not by a short encephalitogenic peptide.</a> European Journal of Immunology. 29 (11), 3432-3439 (1999).</li>
</ol>

Der CD19-Antikörper wurde von Horizon Therapeutics zur Verfügung gestellt.

Dieser Artikel beschreibt eine optimierte Methode zur Abbildung von humanen CD19+ B-Zellen in einem Mausmodell der MS unter Verwendung von CD19-PET. Aufgrund des heterogenen Erscheinungsbildes der MS und des unterschiedlichen Ansprechens auf die Behandlung kann das Management in der Klinik eine Herausforderung darstellen, und neue Ansätze für die Therapieauswahl und -überwachung sind dringend erforderlich. Die PET-Bildgebung könnte als leistungsfähiges Instrument zur Überwachung des Krankheitsverlaufs und des individuellen Ansprechens auf eine B-Zell-deplementierende Therapie dienen. Neben der MS könnte die CD19-PET-Bildgebung auch zur Überwachung der B-Zell-Depletion nach der Behandlung von Subtypen von Lymphomen und Leukämien oder anderen B-Zell-vermittelten Erkrankungen eingesetzt werden. Dieses Protokoll und repräsentative Daten zeigen den Nutzen der Bildgebung von B-Zellen bei neurologischen Erkrankungen.
Um humane CD19+ B-Zellen im Kontext von MS zu untersuchen, wählten wir das B-Zell-abhängige MOG1-125 EAE-Modell 7. Ähnlich wie andere EAE-Modelle zeigt sich dieses Modell mit Symptomen einer fortschreitenden Lähmung und Infiltration von Immunzellen in das ZNS. Das MOG1-125-Modell ist jedoch insofern einzigartig, als es sich um ein B-Zell-getriebenes Modell handelt: Mäuse enthalten eine unterschiedliche Anzahl von B-Zellen im Subarachnoidalraum in den Hirnhäuten, im Hirnstamm, im Parenchym und in den Ventrikeln. Diese Lymphozyten können in diesen Regionen spärlich verstreut sein und/oder follikelartige Strukturen bilden, die auch beim Menschen mit MS 8,9 beobachtet werden. Zusätzlich zur Verwendung naiver Mäuse als Kontrollen kann ein vollständiges Induktionskit verwendet werden, das nur für das Freund's Adjuvans (CFA) verwendet wird (d. h. eine identische Induktionsemulsion wie die, die EAE-Mäusen ohne das MOG-Protein verabreicht wird). Im EAE-Mausmodell ist die Blut-Hirn-Schranke (BHS) dysfunktional und ermöglicht es größeren Entitäten, wie z. B. Antikörpern, die Grenze zu überwinden. Der CD19-mAb-Radiotracer bindet und verbleibt nur dann im ZNS, wenn B-Zellen vorhanden sind; Der Tracer zirkuliert zurück in den Blutpool, wenn keine B-Zellen vorhanden sind. Wir haben dies mit Hilfe von Gammazählung und Ex-vivo-Autoradiographie von ZNS-Geweben nachgewiesen, indem wir vor der Messung der Radioaktivitätswerte in den Geweben perfundiert haben. Wir haben dies auch in früheren Publikationen gezeigt, in denen über die Verwendung von mAb-basierten PET-Radiotracern (d.h. immunPET-Bildgebungsansätzen) zum Nachweis von B-Zellen im ZNS berichtetwurde 1,2.
Der DOTA-Chelator wurde verwendet, da er in der klinischen PET-Bildgebung mit Kupfer-64-markierten Peptiden und Antikörpern verwendet wird, und wir wollen den hCD19-mAb für die klinische Bildgebung von MS-Patienten übersetzen. DOTA hat in vivo eine ausreichende Bindungsaffinität zu Kupfer-64. Die In-vivo-Stabilität ist sehr wichtig, da freies 64Cu in die Leber gelangt und das Signal des gebundenen Radiotracers verschleiern kann. Daher ist es wichtig, das Signal in der Leber zu messen, um das relative Signal im Vergleich zu anderen Organen zu berechnen. Der Muskel wird in der Regel als Kontrollgewebe verwendet, aber im Falle von EAE kann es zu einer Entzündung in den Muskeln kommen. Die Halbwertszeit von 64Cu beträgt 12,7 h, was dem DOTA-hCD19-mAb ausreichend Zeit gibt, um an sein Ziel zu binden und gleichzeitig sicherzustellen, dass das Signal mittels PET gemessen werden kann. Bei der Herstellung des Konjugats sollten Testreaktionen in kleinem Maßstab (75-125 μg) durchgeführt werden, um die Menge an DOTA zu bestimmen, die zu mAb hinzugefügt werden muss, um das gewünschte DOTA/mAb-Verhältnis zu erzeugen (z. B. kann eine Reaktion von 6-10-fachem Überschuss an DOTA-NHS-Ester pro mol mAb ein Konjugat von 1-2 DOTA/mAb ergeben). Auch die Reaktionszeit und -temperatur (z.B. 2-4 h oder über Nacht bei 4 °C oder Raumtemperatur) beeinflusst das DOTA/mAb-Verhältnis und sollte optimiert werden. Eine Titration mit nicht-radioaktivem Kupfer kann durchgeführt werden, um die Anzahl der DOTAs pro mAb zu berechnen; Wir empfehlen jedoch, MALDI-MS und/oder LC-MS durchzuführen, um zuverlässigere und genauere Ergebnisse zu erzielen.
Das berechnete DOTA/mAb-Verhältnis ist ein Durchschnittswert für eine bestimmte Probe, und es ist mit einer gewissen Abweichung zu rechnen. Für MALDI werden mehrere Aufnahmen pro Probe für die konjugierten und unkonjugierten mAbs gemacht. Anschließend berechnen wir das Verhältnis von konjugiert zu unkonjugiert, um die durchschnittliche Anzahl von DOTA/mAb zu bestimmen. Das DOTA/mAb-Verhältnis ist wichtig, da zu viele Chelatoren die Antikörperbindung stören und zu wenige zu einer inkonsistenten radioaktiven Markierung und einem niedrigen Signal führen. Das Verhältnis zwischen den Konjugatchargen sollte sehr eng sein, um eine konsistente Signalintensität und Bindungskinetik aufrechtzuerhalten. Im Idealfall sollte für alle Experimente innerhalb einer bestimmten Studie dieselbe Charge Konjugat verwendet werden. Eine vielversprechende Technik, um mögliche Auswirkungen auf die Immunreaktivität aufgrund einer möglichen Überkonjugation zu reduzieren, ist die Verwendung der ortsspezifischen Konjugation10 , wobei die Chelator-Konjugation ortsselektiv auf die schwerkettigen Glykane des Antikörpers ausgerichtet ist und somit die Zugabe von 1 Chelator pro mAb garantiert.
Die Reaktionsbedingungen für die radioaktive Markierung sollten optimiert werden, um die höchste Markierungseffizienz und -ausbeute zu gewährleisten, da sich unter anderem Unterschiede in der Antikörper-, DOTA/mAb-Ratio und der molaren Aktivität von 64Cu auf die radioaktive Markierung auswirken. Die Verwendung des optimalen Konjugatverhältnisses von 64Cu zu mAb kann es ermöglichen, den Radiotracer ohne Reinigung zu verwenden, wodurch die für die Radiomarkierung erforderliche Zeit und der Verlust aufgrund der Schwerkraftflusssäule und des radioaktiven Zerfalls reduziert werden. Eine konsistente und zuverlässige molare Aktivität kann auch erreicht werden, wenn das gleiche Konjugatverhältnis von 64Cu zu mAb verwendet wird, was besonders wichtig ist, wenn Ergebnisse über mehrere Kohorten von Mäusen oder bildgebende Studien hinweg verglichen werden. Die ITLC-Bedingungen können auch an jeden Benutzer angepasst werden. Wenn eine Aufreinigung erforderlich ist, sollte ein Aliquot für die HPLC- und/oder UV/Vis-Spektrophotometrie gespeichert werden, damit die molare Aktivität berechnet werden kann.
Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung radioaktiv markierter Antikörper für die Bildgebung eine Herausforderung darstellen kann. Es ist wichtig, dass der für den Radiotracer verwendete Antikörper biologisch inert ist, um keine physiologische Wirkung zu haben. Da Antikörper einen langen Blutaufenthalt haben, muss man außerdem lange genug auf die Zirkulation, Bindung und Clearance eines bestimmten mAb warten, um ein geeignetes Signal zum Hintergrund zu gewährleisten, ohne die Bildqualität zu beeinträchtigen. In der Regel ist es ausreichend, 20-48 Stunden auf einen 64 Cu-markierten mAb zu warten, aber man sollte bei der Beurteilung eines neuen mAb-PET-Tracers 2, 4, 6, 12, 24, 48 Stunden nach der Injektion eine Bildgebung durchführen, um den besten Zeitpunkt für die Bildgebung in einem bestimmten Nagetiermodell zu bestimmen. Das Gleiche gilt für die Aufnahme von ARG-Bildern mit dem höchsten Signal-zu-Hintergrund-Verhältnis. Die repräsentativen Bilder in diesem Protokoll wurden 18-20 Stunden nach der Injektion aufgenommen, obwohl je nach verwendetem Radioisotop auch andere Zeitpunkte verwendet werden können. Unterschiedliche Antikörper, die an verschiedene Epitope von CD19 binden, führen zu unterschiedlichen Ergebnissen und sollten streng charakterisiert werden.
Bei der Analyse des Rückenmarkssignals ist es wichtig, die Mäuse auf dem Rücken im Scanbett zu positionieren, um die durch die Atmung verursachten Bewegungen zu reduzieren. Darüber hinaus kann die Platzierung in Rückenlage dazu beitragen, die Wirbelsäule bei Mäusen zu begradigen, die aufgrund des Fortschreitens der EAE-Krankheit eine erhöhte Wirbelsäulenverkrümmung aufweisen. Ein weiterer wichtiger Aspekt, der bei der Detektion von Signalen in der Wirbelsäule und im Rückenmark zu berücksichtigen ist, ist die Vermeidung der Injektion von MOG1-125 in die Flanke, da die Injektionsstellen aufgrund der damit verbundenen Immunantwort in diesen Bereichen den Tracer binden können. Die unmittelbare Nähe der Injektionsstelle kann die Rückenmarksanalyse beeinträchtigen. Somit sind Injektionen in den Brustkorb für die hierin beschriebene Anwendung bevorzugt.
Die verwendeten Bildanalysetechniken sind spezifisch für die ZNS-Bildgebung. Ein Gehirnatlas innerhalb der Bildanalysesoftware liefert reproduzierbare und zuverlässige Ergebnisse, solange die Registrierung von PET und CT korrekt ist. Die Verwendung des halbautomatischen 3D-Gehirnatlas und dessen Anpassung an den Schädel jeder Maus ermöglicht konsistente ROIs zwischen den Tieren. Da es derzeit keinen automatisierten oder halbautomatischen Ansatz zur Analyse des Signals im Rückenmark gibt, müssen manuelle ROIs gezogen werden. Insbesondere bei der Quantifizierung von CD19+ B-Zellen (oder einem anderen Zelltyp, der sowohl im Knochenmark als auch im Rückenmark vorhanden ist) ist es wichtig, das Signal, das von der Wirbelsäule und dem Knochenmark ausgeht, so weit wie möglich zu eliminieren. Der Grund dafür ist, dass naive Mäuse bekanntermaßen mehr CD19+ B-Zellen in ihrem Knochenmark enthalten als EAE-Mäuse, bei denen B-Zellen die Peripherie verlassen, um das ZNS zu infiltrieren 5,11. Dieses Knochenmarksignal kann das wahre Signal im Rückenmark verschleiern.
Um das wahre Rückenmarkssignal abzugrenzen und gleichzeitig den Beitrag des Signals von der Wirbelsäule und dem Knochenmark zu minimieren, kann die Otsu-Schwelle des CT-Bildes verwendet werden, um einen unveränderlichen ROI für die Wirbelsäule zu erzielen. Ein separater Rückenmark-ROI kann dann einfach innerhalb der Wirbelsäule gezeichnet werden. Die gleiche Technik kann auch zur Messung des Knochenmarks im Oberschenkelknochen angewendet werden. Dies ist eine sehr nützliche Methode, um Einblicke in die Tracerbindung im Rückenmark zu gewinnen. Aufgrund der relativ geringen räumlichen Auflösung der PET und der Probleme im Zusammenhang mit dem partiellen Volumeneffekt beim Scannen kleiner anatomischer Regionen von Mäusen ermöglicht die Verwendung zusätzlicher ex vivo Bestätigungstechniken (z. B. Gamma-Zählung, ARG) die Validierung der Radiotracer-Bindung im Rückenmark ohne das Vorhandensein von Blut, Liquor oder Spillover-Signal von der Wirbelsäule.
Das Signal im zervikalen/thorakalen Rückenmark variiert bei den EAE-Mäusen tendenziell in Abhängigkeit von der Schwere der Erkrankung und davon, wie viele B-Zellen während der adaptiven Immunantwort infiltrieren. Diese Variation in der Anzahl der infiltrierten B-Zellen sowie die geringe Menge an B-Zellen im ZNS im Vergleich zu denen im Becken-/Rückenmarksknochenmark naiver Mäuse kann die In-vivo-Quantifizierung von Rückenmarksgewebe bei Mäusen schwierig machen. Aufgrund der räumlichen Auflösung der PET in der Bildgebung von Kleintieren kann das Signal aus dem Knochenmark auf das Rückenmarksignal übergreifen. Die hier durchgeführte Ex-vivo-Bioverteilung und Autoradiographie helfen bei der Validierung des PET-Signals der Wirbel im Vergleich zum Rückenmarksgewebe. Mäuse werden vor der Sektion perfundiert, um alle ungebundenen Tracer im Blutpool zu entfernen, so dass die Ergebnisse der Gammazählung und der Autoradiographie den Tracer widerspiegeln, der tatsächlich in jedem Organ gebunden ist, und nicht den Tracer, der sich im Blutpool in diesem Organ befindet.
Radiotracer zirkulieren durch das Blut, und insbesondere bei Antikörper-Tracern ist oft noch Wochen nach der ersten Injektion ungebundener Radiotracer im Blut vorhanden. Da wir das Gehirn und das Rückenmark abbilden, die viele Blutgefäße haben, ist es wichtig zu verstehen, welcher Teil des Signals wirklich auf die Tracerbindung im Gehirn/Gewebe von Interesse zurückzuführen ist, im Vergleich zu dem, der im Blutpool vorhanden ist. Es ist also notwendig, das Gehirnsignal durch das Signal im Herz-/Blutpool zu teilen. Im klinischen Umfeld können die gleichen Bildanalysetechniken wie die Otsu-Schwelle von Wirbeln und ROIs von Rückenmarksgeweben zur Quantifizierung verwendet werden. Angesichts der größeren Gewebevolumina beim Menschen im Vergleich zu Mäusen sollte es deutlich weniger Auswirkungen von Teilvolumeneffekten geben, was zu einer verbesserten Genauigkeit führt und die Notwendigkeit von Ex-vivo-Techniken zur Bestätigung von In-vivo-Befunden zunichte macht. Der Einsatz von PET in der Klinik wird es Ärzten ermöglichen, die Therapie für jeden Patienten in Abhängigkeit von seiner individuellen B-Zell-Belastung zu personalisieren.
ARG ist besonders nützlich für die Aufnahme hochauflösender Bilder, um eine genauere Abgrenzung der räumlichen Lage der Tracerbindung in kleinen Regionen wie Hirnstamm und Kleinhirn zu ermöglichen. Dieselben Abschnitte und/oder benachbarte Abschnitte können für immunhistochemische Färbungen aufbewahrt werden, um das Vorhandensein von B-Zellen zu bestätigen. Wir haben zuvor ZNS-Gewebe mit CD45R/B220 gefärbt (Ergänzende Abbildung S1), um die Anzahl der B-Zellen mit dem PET- und ARG-Signal 5,9 zu korrelieren. Die Färbung kann dann räumlich mit den ARG-Ergebnissen verglichen werden, um zu überprüfen, ob das Radiotracer-Signal mit dem Färbemuster übereinstimmt. B-Zellen können in Clustern oder diffus im gesamten Hirnstamm vorhanden sein; Die PET-Sensitivität ist hoch genug, um das Signal zu messen, was für die klinische Translation ermutigend ist. Bei der ARG des Rückenmarks wird durch die Entfernung des Rückenmarks aus den Wirbeln sichergestellt, dass das gemessene Signal auf eine Tracerbindung im Rückenmarksgewebe und nicht auf das Knochenmark und/oder Blut zurückzuführen ist, die PET-Bilder aufgrund von Teilvolumeneffekten verdecken können.
Ähnlich wie bei ARG ermöglicht die Ex-vivo-Gammazählung die Quantifizierung des radioaktiven Signals in einzelnen Organen. Für diese spezielle Technik ist es wichtig, das Nassgewicht des Gewebes zu messen und sicherzustellen, dass es sich am Boden der jeweiligen Röhrchen befindet, bevor die Röhrchen in den Gamma-Zähler eingesetzt werden. Die Röhrchen müssen mit der Mausnummer und dem Gewebe beschriftet sein, damit das richtige Röhrchen verwendet wird; Das Röhrchen wird dann auf einer kalibrierten Waage gewogen und die Organe werden auf das Zehntel Mikrogramm (0,0001 mg) genau eingeführt. Einige Gewebe sind extrem klein und der Unterschied in der Röhrchenmasse vorher und nachher liegt in der Größenordnung von 0,0001 mg. Das Gewebe sollte unmittelbar nach der Dissektion gewogen werden, um einen Feuchtigkeitsverlust zu vermeiden, der zu einer geringeren Masse führt. Nach dem Wiegen sollten die Hirn- und Rückenmarksröhrchen mit PBS gefüllt werden, um ein Austrocknen zu verhindern, bevor diese Gewebe für ARG eingefroren werden.

MS ist eine immunvermittelte neurologische Erkrankung; Das einzigartige Erscheinungsbild bei jedem Patienten kann das Management sowohl für Patienten als auch für Ärzte zu einer Herausforderung machen1. Die Krankheit selbst ist gekennzeichnet durch das Vorhandensein von demyelinisierenden Läsionen und die Infiltration von Immunzellen im Gehirn und Rückenmark, was zu körperlichen und kognitiven Beeinträchtigungen führt2. Das traditionelle Paradigma, dass MS eine T-Zell-vermittelte Erkrankung ist, wurde erstmals in einer wegweisenden klinischen Phase-II-Studie mit Rituximab3 in Frage gestellt, einer Therapie, die auf die CD20+ -Untergruppe der B-Zellen abzielt. Seitdem wurden weitere B-Zell-Therapien entwickelt, die auf CD194 abzielen, einen Pan-B-Zell-Biomarker, der auf einem breiteren Spektrum von B-Zellen exprimiert wird, was sowohl diagnostisch als auch therapeutisch vorteilhaft sein kann. Darüber hinaus bieten die bestehenden Methoden zur Beurteilung der Wirksamkeit der Behandlung (d. h. die Überwachung der Anzahl der Schübe und der Aktivität der Magnetresonanztomographie [MRT]) keine frühzeitigen Messungen des Ansprechens, wodurch die Patienten aufgrund einer suboptimalen Therapieauswahl und -optimierung einem erheblichen Risiko für ZNS-Schäden ausgesetzt sind. Daher besteht ein dringender Bedarf an Strategien zur Überwachung spezifischer Immunzellen, wie z. B. CD19+ B-Zellen, in Echtzeit im ZNS und in der Peripherie von MS-Patienten.
Die PET-Bildgebung ist ein robustes Bildgebungsverfahren , das eine In-vivo-Ganzkörpervisualisierung eines bestimmten Ziels von Interesse, wie z. B. CD19, ermöglicht. Während Blutentnahmen, Aufzeichnungen von Rückfallraten und die Überwachung von Läsionen mittels MRT Momentaufnahmen der Wirksamkeit der Behandlung liefern, kann die PET-Bildgebung es Forschern und Klinikern ermöglichen, die Wirksamkeit einer Therapie im gesamten Körper zu überwachen. Dieser proaktive Ansatz zur therapeutischen Überwachung ermöglicht es Ärzten, die Wirksamkeit von Medikamenten in Echtzeit zu beurteilen und bei Bedarf schnelle Anpassungen zu ermöglichen. Die Überwachung der Lokalisation und Dichte von Zellpopulationen, die mit einer Erkrankung assoziiert sind, ermöglicht auch eine longitudinale Beurteilung des Schweregrads anhand patientenspezifischer anatomischer Informationen. Daher ist es unerlässlich, reproduzierbare Analysemethoden zu etablieren, um das volle Potenzial der PET-Bildgebung im klinischen und präklinischen Umfeld zuverlässig auszuschöpfen.
In dieser Arbeit werden Methoden (Abbildung 1) zur Durchführung von PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gammazählung und Autoradiographie (ARG) von CD19+ B-Zellen mit einem 64 Cu-markierten monoklonalen anti-humanen CD19-Antikörper (mAb), bekannt als 16C4-TM (64Cu-hCD19-mAb), im experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE)-Mausmodell der MS beschrieben, das in transgenen Mäusen induziert wurde, die humanes CD19 (hCD19) unter Verwendung des humanen rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteins 1-125 (MOG1-125). Wir stellen auch Methoden zur Verfügung, um die Radiotracer-Bindung im Gehirn und Rückenmark genau und reproduzierbar zu beurteilen, beides kritische Orte der Pathogenese, die in diesem und anderen neurodegenerativen Modellen oft stark betroffen sind. Diese Techniken ermöglichen eine nicht-invasive Untersuchung der Rolle von B-Zellen in der Krankheitspathologie und haben das Potenzial, klinisch übertragen zu werden, um die Wirksamkeit von Anti-B-Zell-Therapien bei MS zu bewerten.

<table><tbody><tr><td>0,5 mL 50 kDa MWCO Zentrifugalfilter</td><td>MiliporeSigma</td><td>UFC505008</td><td>Zentrifugalfilter</td></tr><tr><td>64Cu-CuCl3</td><td>Washington University in St. Louis; Universität von Wisonsin, Madison; oder ein anderer Anbieter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AR-2000 Radio-TLC Imaging Scanner Eckert</td><td>& Ziegler</td><td>AR-2000</td><td></td></tr><tr><td>Autoradiographie-Kassette</td><td>Cole Palmer</td><td>EW-21700-34</td><td>Aluminium, 8" x 10"</td></tr> <tr><td>Autoradiographie-Film</td><td>&nbsp; GE Life Sciences</td><td>28-9564-78</td><td>Lagerung Phosphor Sieb BAS-IP SR 2025 E Super Resolution, 20 x 25 cm, nur Sieb</td></tr><tr><td>Schmetterling Nadelkatheter</td><td>SAI Infusion Technologies</td><td>BLF-24</td><td></td></tr><tr><td>DOTA-NHS-Ester</td><td>Makrozyklika</td><td>B-280</td><td></td></tr><tr><td>EAE Induktionskit</td><td>Hooke Laboratories</td><td>EK-2160</td><td></td></tr><tr><td>Geiger Zähler</td><td>Ludlum</td><td>14C</td><td></td></tr><tr><td>GNEXT PET/CT Scanner</td><td>Sofie</td><td>GNEXT</td><td></td></tr><tr><td>Hidex Automatischer Gamma-Zähler</td><td>Hidex</td><td>AMG</td><td></td></tr><tr><td>HPLC-Säule</td><td>Phenomenex</td><td>&nbsp; 00H-2146-K0</td><td>5 &mu; m SEC-s3000 400 &Aring;, 300 x 7,8 mm</td></tr><tr><td>Illustra NAP-5 Säule</td><td>Cytiva</td> 17085301 <td>DNA-Schwerkraftsäule</td><td></td></tr><tr><td>Bild J</td><td>NIH</td><td></td><td>ARG Analysesoftware</td></tr><tr><td>Entnahmeröhrchen mit geringer Proteinbindung (1,5 mL)</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI90410</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840281400</td><td>UV-Vis Mikro-/Nanospektralphotometer</td></tr><tr><td>PCR-Röhrchen 0,2 ml, für</td><td>Eppendorf</td><td>30124707</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon Phosphor Imager in DNA-Qualität 9410</td><td>GE Healthcare</td><td>8149-30-9410</td><td></td></tr><tr><td>VivoQuant</td><td>Invicro</td><td>Version 4 Patch 3</td><td>PET-Analysesoftware; muss erworben werden Gehirnatlas Add-on</td></tr><tr><td>Zeba Spin Entsalzungssäulen, 7 K MWCO, 0,5 mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>PI89882</td><td>Entsalzungssäule</td></tr></tbody></table>

bildgebung von cd19+ b-zellen in einem experimentellen autoimmunen enzephalomyelitis-mausmodell mit positronen-emissions-tomographie

Imaging CD19+ B Cells in an Experimental Autoimmune Encephalomyelitis Mouse Model using Positron Emission Tomography

Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste demyelinisierende Erkrankung des Zentralnervensystems (ZNS) bei jungen Erwachsenen, die im weiteren Verlauf der Erkrankung häufig zu neurologischen Defiziten und Behinderungen führt. B-Lymphozyten spielen eine komplexe und entscheidende Rolle in der MS-Pathologie und sind das Ziel mehrerer Therapeutika in klinischen Studien. Derzeit gibt es keine Möglichkeit, Patienten für spezifische Anti-B-Zell-Therapien genau auszuwählen oder die Auswirkungen dieser Behandlungen auf die B-Zell-Last im ZNS und in peripheren Organen nicht-invasiv zu quantifizieren. Die Bildgebung der Positronen-Emissions-Tomographie (PET) hat ein enormes Potenzial, hochspezifische, quantitative Informationen über die räumlich-zeitliche Verteilung und Belastung von B-Zellen in lebenden Probanden zu liefern.
Diese Arbeit berichtet über Methoden zur Synthese und Verwendung eines PET-Tracers, der spezifisch für humane CD19+ B-Zellen ist, in einem etablierten B-Zell-gesteuerten Mausmodell der MS, der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), die mit dem humanen rekombinanten Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein 1-125 induziert wird. Hier werden optimierte Techniken zum Nachweis und zur Quantifizierung von CD19+ B-Zellen im Gehirn und Rückenmark mittels In-vivo-PET-Bildgebung beschrieben. Darüber hinaus werden in dieser Arbeit optimierte Methoden für die ex vivo Gamma-Zählung von krankheitsrelevanten Organen, einschließlich Knochenmark, Rückenmark und Milz, zusammen mit einer hochauflösenden Autoradiographie der CD19-Tracerbindung in ZNS-Geweben vorgestellt.

Das hCD19-mAb wurde DOTA-konjugiert und mit 64Cu radioaktiv markiert, wie in Abbildung 2 dargestellt. EAE und naive Mäuse wurden 18-24 Stunden nach der Injektion mit 64Cu-DOTA-hCD19-mAb einer PET/CT-Untersuchung unterzogen (Abbildung 3). PET/CT-Bilder wurden mit der PET-Analysesoftware co-registriert, und das ZNS-Gewebe wurde mit manuellen ROIs oder einem halbautomatischen 3D-Gehirnatlas analysiert. Die Radiotracerbindung in ROIs (Abbildung 4) war bei EAE-Mäusen höher als bei naiven Mäusen. Ex vivo Gamma-Zählung und ARG zeigten eine erhöhte Bindung im Rückenmark (sowohl lumbale als auch zervikale Brustsegmente) und Gehirn (nur ARG) von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen (Abbildung 5 und Abbildung 6). Die Ex-vivo-Gammazählung von perfundierten Mäusen zeigte auch eine verminderte Radiotracerbindung in peripheren Organen, einschließlich Milz, Oberschenkelknochen und Knochenmark (Abbildung 5), was mit B-Zellen übereinstimmt, die in diesem EAE-Modell die Peripherie verlassen und das ZNS infiltrieren.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig02.jpg"> Abbildung 2: Konjugations- und Radiomarkierungsschema zur Generierung von 64 Cu-markierten humanspezifischen CD19-monoklonalen Antikörpern, 16C4-TM mAb (64Cu-DOTA-hCD19-mAb), zusätzlich zu Qualitätskontrolldaten. (A) Reaktion von DOTA-NHS-Ester mit monoklonalem hCD19-Antikörper zur Herstellung von hCD19-DOTA-Konjugat (nicht maßstabsgetreu) und radioaktive Markierung mit 64 Cu-CuCl3zur Herstellung von 64Cu-DOTA-hCD19-mAb. (B) Repräsentativer ITLC-Chromatograph. Der Peak bei 40-60 cm ist der radioaktiv markierte Antikörper; ungebunden 64Cu-CuCl3 reist mit der mobilen Phase und wäre von 200 bis 240 cm vorhanden. In diesem Chromatographen ist kein freies 64Cu-CuCl3 nachweisbar. (C) die Spezifikationen für die Qualitätskontrolle des radioaktiv markierten Antikörpers. Abkürzungen: DOTA-NHS-Ester = 1,4,7,10-Tetraazacyclododecan-1,4,7,10-tetraessigsäuremono-N-hydroxysuccinimidester; ITLC/HPLC = sofortige Dünnschichtchromatographie/Hochleistungsflüssigkeitschromatographie; MALDI/LC-MS = matrixgestützte Laserdesorption/Ionisation/Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie; CPM = Zählungen pro Minute. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig03.jpg"> Abbildung 3: Fotos, die zeigen, wie Mäuse in einem 3D-gedruckten Bett innerhalb des PET-Scanners gesichert werden, um eine qualitativ hochwertige Bildgebung des Rückenmarks und des Gehirns zu ermöglichen und gleichzeitig die Bewegung zu minimieren. (A) 3D-gedrucktes Vier-Maus-Scannerbett (auch bekannt als "Maushotel"), ausgestattet mit Heizelementen und Anästhesieschläuchen. (B) Anästhesierte Mäuse in Rückenlage, um die Geradheit der Wirbelsäule zu maximieren; Die Bettposition jeder Maus wird aufgezeichnet. (C) Mäuse, die sicher über ihren Kopf geklebt sind, um die Bewegung im Gehirn zu minimieren, und über den Bauch, um die Bewegung der Atmung zu minimieren, ohne die Atmung zu beeinträchtigen. (D) Das Mausbett befindet sich im Inneren des Scanners und ist mit Klebeband auf das Scanbett geklebt. Der Anästhesieschlauch wurde vom Scanner an das Bett angeschlossen und das Isofluran auf 2 % eingestellt. Die Atmung der Mäuse wurde überwacht, um einen angemessenen Isofluranspiegel zu gewährleisten, bevor die Scannertür geschlossen wurde. Abkürzung: PET = Positronen-Emissions-Tomographie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig04.jpg"> Abbildung 4: Rückenmarks- und Gehirnanalyse und Ergebnisse mit PET-Analysesoftware . (A) i) ROIs (rosa und hellbraun), die auf die Wirbelsäule gezeichnet werden, um die Lendenwirbel von den Brust- und Halswirbeln zu trennen und das Bild für die Otsu-Schwelle vorzubereiten. ii ) Wirbelsäulenwirbel (türkis und rot) wurden mit Otsu Thresholding segmentiert. iii ) Die Wirbel wurden dann im 3D-ROI-Menü unveränderlich gemacht und das Rückenmark in zervikale/thorakale (violett) und lumbale (marineblaue) ROIs unterteilt. iv) Der Wirbel-ROI wurde entfernt, so dass Rückenmark-ROIs und ein repräsentativer Hirnatlas angewendet wurden. (B) Repräsentative Analyse der PET-Ergebnisse aus verschiedenen ZNS-Regionen, dargestellt als %ID/g, normalisiert auf den ROI des Herzens bei jedem Tier. Bei der PET-Erfassung handelte es sich um einen 10-minütigen statischen Scan mittels PET/CT-Bildgebung. Quantifizierung der Hirnregionen mit einem halbautomatischen Gehirnatlas-Ansatz, dargestellt in Panel A. iv) Repräsentative Ergebnisse zeigen entweder eine Signifikanz oder einen Trend zu einem signifikanten Anstieg der Tracerbindung im Gehirn und im thorakalen Rückenmark. Statistiken, die mit dem t-Test des Schülers durchgeführt wurden (*: p &lt; 0,0332). Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; ROIs = Regionen von Interesse; ZNS = Zentrales Nervensystem; CT = Computertomographie; %ID/g = prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig05.jpg"> Abbildung 5: Repräsentative Quantifizierung der ex vivo Gammazählung in verschiedenen Organen bei EAE und naiven Mäusen, ausgedrückt als %ID/g. Nach dem PET-Scan wurden die Mäuse mit PBS perfundiert, um den im Blut vorhandenen Radiotracer zu entfernen, der entweder frei oder an im Blut ansässige CD19+ B-Zellen gebunden war, und die Organe wurden schnell präpariert und gewogen, um ein genaues Gewicht jedes Organs zu erhalten. Die Tracerbindung ist in Milz und Knochenmark bei EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen signifikant verringert. Eine erhöhte Radiotracerbindung wird sowohl in den lumbalen als auch in den zervikalen/thorakalen Rückenmarksegmenten von EAE-Mäusen beobachtet. Das Gehirn zeigt keinen signifikanten Anstieg des Radiotracer-Signals, obwohl es zu einem signifikanten Anstieg tendiert. Statistiken, die mit dem t-Test des Schülers durchgeführt wurden (*: p &lt; 0,0332; ****: p &lt; 0,0001). Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; %ID/g = prozentuale injizierte Dosis pro Gramm Gewebe; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64133/64133fig06.jpg"> Abbildung 6: Ex vivo ARG-Bilder zeigen 64Cu-DOTA-hCD19-mAb-Bindungen in sagittalen Hirnschnitten und ganzem Rückenmark von EAE im Vergleich zu naiven Mäusen. Digitale Phosphorspeicherfilme wurden mit einem Phosphor-Imager gescannt, nachdem sie für etwa 10 Halbwertszeiten (127 h oder 5 Tage) radioaktiven Gewebeproben ausgesetzt worden waren. Die resultierenden Bilder zeigen ein visuell höheres Signal im Gehirn von EAE-Mäusen im Vergleich zu Hirnschnitten von naiven Mäusen, was aufgrund der Regionen, von denen bekannt ist, dass sie in diesem Modell B-Zellen enthalten, zu erwartenist 5. Insbesondere gibt es ein erhöhtes Tracer-Signal im Hirnstamm, im Kleinhirn und in den Ventrikeln von EAE-Maus-Hirnabschnitten. Dieser Anstieg des Signals für EAE-Maus-Hirnschnitte spiegelt das wider, was in der oben beschriebenen PET-Quantifizierung des gesamten Gehirns gefunden wurde. In ähnlicher Weise gibt es eine Zunahme der Radiotracer-Bindung sowohl im zervikalen/thorakalen als auch im lumbalen Rückenmarksegment im Vergleich zum naiven Rückenmark, was die Ergebnisse der Ex-vivo-Gammazählung widerspiegelt. Abkürzungen: PET = Positronen-Emissions-Tomographie; EAE = experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis; Vent = Ventrikel; Cb = Kleinhirn; BS = Hirnstamm; TSc = Brust- und Halswirbelsäule kombiniert; LSc = lumbales Rückenmark. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/64133fig06large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Abbildung S1: Färbung von ZNS-Geweben von naivem und EAE-Maushirngewebe mit CD45R/B220. B-Zellen werden im Hirnstamm, in der Hirnhaut und in der weißen Substanz von EAE-Mäusen beobachtet (n = 7 EAE, n = 5 naive Mäuse, durchschnittlich vier Scheiben pro Tier). Diese Zahl stammt von 5. Maßstabsbalken = 5 mm (geringe Vergrößerung [1x]) in sagittalen Hirnbildern, 100 μm (hohe Vergrößerung [20x]) im Hirnstamm, in den Hirnhäuten und in der weißen Kleinhirnsubstanz. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64133/Suppl%20Fig%201.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

In diesem Artikel wird die Methodik zur radioaktiven Markierung eines humanspezifischen monoklonalen Anti-CD19-Antikörpers beschrieben und erläutert, wie er zur Quantifizierung von B-Zellen im zentralen Nervensystem und in peripheren Geweben eines Mausmodells für Multiple Sklerose unter Verwendung von In-vivo-PET-Bildgebung, Ex-vivo-Gamma-Zählung und Autoradiographie-Ansätzen verwendet werden kann.

Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie

Multiple sclerosis (MS) is the most common demyelinating central nervous system (CNS) disease affecting young adults, often resulting in neurological ...

Diese Technik nutzt die PET-Bildgebung, um die In-vivo-Verteilung und -Dynamik von B-Zellen im zentralen Nervensystem aufzuklären. Unser Ansatz ist vorteilhaft für die Untersuchung neurologischer Erkrankungen, bei denen das betroffene Rückenmark die Analyse erschwert. Es gibt also ein paar Hauptvorteile unserer Technik.Zunächst haben wir ein neues Werkzeug entwickelt, um einen Pan-B-Zell-Biomarker zu verfolgen, der es uns ermöglicht, eine Reihe von B-Zell-Untergruppen zu erfassen und in vivo zu visualisieren. Zweitens ermöglicht unsere Methode der Rückenmarksanalyse eine hochgenaue und reproduzierbare Quantifizierung von PET-Signalen in dieser Region. Das Tolle an unserer Technik ist, dass sie krankheitsunabhängig ist.Es kann von der präklinischen bis zur klinischen PET-Bildgebung in jedem Szenario eingesetzt werden, in dem B-Zellen und/oder das Rückenmark von Interesse sind. 18 bis 24 Stunden nach der radioaktiven Markierung und Injektion des Antikörpers in die Maus bereiten Sie die Maus auf das Scannen vor, indem Sie Augengel auf die Augen auftragen. Stellen Sie sicher, dass das Scan-Bett für vier Mäuse mit einem Heizkissen ausgestattet ist, dessen Isofluran von 1,5 bis 2 % eingestellt ist. Legen Sie die Maus in Rückenlage auf das Scan-Bett und ziehen Sie vorsichtig am Mausschwanz, um die Wirbelsäule zu begradigen.Sobald sich die Maus in Rückenlage befindet, kleben Sie sie mit weichem Mikroskopband über Kopf und Bauch, um die Atembewegung zu minimieren. Notieren Sie sich die Scanposition für jede Maus in einem Labornotizbuch. Nachdem Sie die erste Gruppe gesichert haben, schließen Sie das Bett und überprüfen Sie die Platzierung des Bettes, indem Sie einen CT-Scan durchführen.Klicken Sie auf CT Center View Field of View, und sobald das Bett in Position ist, führen Sie den CT-Testscan durch, um sicherzustellen, dass die Platzierung korrekt ist. Wiederholen Sie den Vorgang, bis die Bettposition zufriedenstellend ist. Legen Sie ein kleines weißes Klebeband auf das Scannerbett, um die richtige Platzierung des Bettes für den Rest der Studie zu markieren.Öffnen Sie das Motion-Controller-Menü und klicken Sie auf PET Center Field of View, um die Mäuse in den PET-Ring zu verschieben. Sobald sich das Bett im PET-Ring befindet, starten Sie die Scansequenz, indem Sie auf Ausführen klicken, und warten Sie, bis der Scanner den PET-Scan automatisch abgeschlossen hat, und wechseln Sie vom PET-Ring zum CT für die CT-Aufnahme. Seit der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) haben Mäuse aufgrund des Fortschreitens der Krankheit eine ausgeprägte Krümmung der Wirbelsäule, das Scannen auf dem Rücken hilft, die Wirbelsäule aufzurichten.Machen Sie einen Schnitt entlang der Rückenseite des Tieres und entfernen Sie die Haut und das Fell, um die Wirbelsäule freizulegen. Schneiden Sie entlang von drei Querebenen durch die Wirbelsäule am Hals, direkt unter dem Brustkorb und an der Oberseite des Beckens, um die Lendenwirbelsäule von den Hals- und Brustregionen zu trennen. Entfernen Sie vorsichtig die segmentierte Wirbelsäule, um zwei Teile zu erhalten, eine Lendenwirbelsäule und eine Halswirbelsäule.Isolieren Sie dann die Lendenwirbelsäule, indem Sie die Wirbelsäule vorsichtig vom Beckenende aus kürzen, bis das lumbale Rückenmark sichtbar ist. Um das lumbale Rückenmark auszustoßen, verwenden Sie eine mit PBS gefüllte Slip-Tip-Spritze und schaffen Sie mit Daumen und Zeigefinger eine Abdichtung zwischen der Spritze und der Wirbelsäule. Schieben Sie das PBS vorsichtig durch die Spritze, um das Rückenmark auf eine saugfähige Unterlage zu stoßen, und wiederholen Sie den Vorgang für das zervikale thorakale Rückenmark, indem Sie die Spritze von der zervikalen Seite aus einführen.Legen Sie das Rückenmarksgewebe in ein Gamma-Zählröhrchen. Notieren Sie das Trockengewicht und fügen Sie PBS hinzu, um sicherzustellen, dass sich das Gewebe am Boden des Röhrchens befindet, um ein Austrocknen zu vermeiden. Lege das Röhrchen auf Eis, bis es zum Zählen bereit ist.Um mit der Analyse von Interessenbereichen im Rückenmark zu beginnen, öffnen Sie das Werkzeug "3D-Interessenbereich" über das Menü "Navigation". Verwenden Sie unter der Überschrift "Regions of Interest" das Pluszeichen am unteren Rand des Menüs, um sechs Regions of Interest zu erstellen: Lendenwirbelsäule, zervikale Brustregion von Interesse, Lendenskelett, Brustskelett, lumbales Rückenmark, thorakales Rückenmark. Um visuelle Störungen durch das PET-Signal zu vermeiden, klicken Sie auf F3, um das PET auszuschalten.Gehen Sie zum oberen Rand des 3D-Werkzeugoperators für die Interessenregion und klicken Sie auf den durchgezogenen Punkt rechts neben dem Cursorsymbol, um den 3D-Malmodus und das Menü Erodieren/Erweitern zu öffnen. Wählen Sie Kugel aus, und ändern Sie die Größe auf 20 Pixel. Stellen Sie die Erweiterung ebenfalls auf plus fünf ein.Bevor Sie fortfahren, gehen Sie zum Ende des Menüs und stellen Sie sicher, dass der gewünschte Lendenwirbelbereich ausgewählt ist. Auf dem CT finden Sie den L6-Wirbel der Wirbelsäule. Beginnen Sie mit einem Wirbel oberhalb von L6 und zeichnen Sie eine grobe Lendenwirbelregion über die fünf Wirbel über den Hüften.Wechseln Sie dann zur zervikalen Brustregion und verfolgen Sie den Rest der Wirbelsäule bis zur Schädelbasis. Nachdem Sie die generalisierten Interessenbereiche gezeichnet haben, gehen Sie zum Anfang des Operators und wählen Sie das Menü Segmentierungsalgorithmen aus. Wählen Sie im Dropdown-Menü die Option Otsu-Schwellenwert aus, wählen Sie dann die interessierende Lendenwirbelsäule für die Eingabe aus und stellen Sie sicher, dass unten im Menü das Lendenskelett ausgewählt ist.Vergewissern Sie sich, dass im Dropdown-Menü neben Bild der CT-Scan ausgewählt ist, der hier durch die Zahl Null gekennzeichnet ist. Klicken Sie auf Anwenden und wiederholen Sie den Vorgang für die zervikale Brustregion und das Brustskelett. Nachdem Sie die Otsu-Schwellenwerte verwendet haben, um die interessierenden Skelettbereiche zu erstellen, kehren Sie zum Navigationsmenü zurück, und löschen Sie den Interessenbereich, oder aktivieren Sie die Spalte H für die groben lumbalen und zervikalen Brustregionen, um sie auszublenden.Aktivieren Sie die Spalte I für beide Skelettbereiche von Interesse, damit sie nicht bearbeitet werden können. Kehren Sie abschließend zum Anfang des 3D-Bereich-of-Interest-Tool-Operators zurück, und wechseln Sie zum Menü 3D-Malen, um die relevanten Rückenmarksregionen zu zeichnen. Wählen Sie das Kugelwerkzeug erneut aus und zeichnen Sie das Rückenmark innerhalb des Skeletts sowohl für die Lendenwirbelsäule als auch für den Brustkorb nach, wobei Sie sicherstellen müssen, dass die richtige Region von Interesse am unteren Rand des Menüs ausgewählt ist.Um einen gewünschten Bereich zu löschen, klicken Sie auf Befehl/Strg und zeichnen Sie über den zu löschenden Teil. Überprüfen Sie die interessierende Rückenmarksregion aus allen drei Ebenen, um sicherzustellen, dass keine interessierende Region außerhalb der Wirbelsäule gezeichnet wird. Wenn das PET-Signal ausgeschaltet wurde, drücken Sie F3, nachdem die relevanten Rückenmarksregionen gezeichnet wurden, um die PET wieder einzuschalten, oder wählen Sie den visuellen Controller aus, und klicken Sie auf die PET-Leiste.Kehren Sie zum Navigationsmenü zurück. Klicken Sie auf das Rastersymbol, um die Tabelle anzuzeigen. Kopieren Sie die Tabelle in eine Tabellenkalkulationssoftware und speichern Sie die Datei.Die PET-Bildgebung zeigte eine erhöhte Radiotracer-Bindung im Gehirn und im thorakalen Rückenmark von EAE-Mäusen im Vergleich zu den naiven Mäusen. Die Ex-vivo-Gammazählung zeigte eine erhöhte Bindung sowohl in den lumbalen als auch in den zervikalen thorakalen Wirbelsäulensegmenten und im Gehirn von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen. Ex-vivo-Autoradiographie-Aufnahmen zeigten eine erhöhte Radiotracerbindung in sagittalen Hirnschnitten, insbesondere im Hirnstamm, Kleinhirn und in den Ventrikeln von EAE-Mäusen im Vergleich zu naiven Mäusen.In ähnlicher Weise wurde eine erhöhte Radiotracerbindung sowohl in den zervikalen thorakalen als auch in den lumbalen Rückenmarksegmenten von EAE-Mäusen im Vergleich zu naivem Rückenmark beobachtet. Nach der PET-Bildgebung und der Gamma-Zählung können wir die Beziehung zwischen dem PET-Signal und dem interessierenden Ziel durch molekularbiologische Techniken wie Durchflusszytometrie und Immunhistochemie untersuchen. Unsere Technik hat Forschern den Weg geebnet, Fragen zur In-vivo-Rolle von B-Zellen in verschiedenen Krankheitsbereichen zu stellen, darunter Schlaganfall, Multiple Sklerose, andere Autoimmunerkrankungen und Krebs.

imaging-cd19-b-cells-an-experimental-autoimmune-encephalomyelitis

Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt die Methode zur Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) durch Injektion von Myelin-abgeleiteten Peptiden mit einem Adjuvans, um autoreaktive T-Zellen zu aktivieren, die ins Gehirn wandern. Pertussis-Toxin wird verabreicht, um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass diese T-Zellen und andere Immunzellen in das Gehirn eindringen können. Diese Immunzellen verursachen eine Demyelinisierung, die zu einer gestörten...

Generierung einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Dieses Manuskript beschreibt die Methoden zur Induktion und Bewertung des experimentellen Modells der autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE), zusammen mit der Beurteilung der Immunzellverteilung und der mRNA-Zytokinspiegel in Lymphknoten, Milz, Blut und Rückenmark mittels Durchflusszytometrie bzw. quantitativer PCR in verschiedenen Krankheitsstadien.

Die Induktion der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis bei Mäusen und die Auswertung des Krankheitsabhängige Verteilung von Immunzellen in verschiedenen Geweben

Wir zeigen eine Technik für die in vivo lebenden Biolumineszenz und Nahinfrarot-Bildgebung von Optikusneuritis und Enzephalitis in der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) -Modell für Multiple Sklerose in SJL / J - Mäusen.

Biolumineszenz und Nah-Infrarot-Imaging von Neuritis und Gehirnentzündung im EAE-Modell der Multiplen Sklerose in Mäusen

Hier präsentieren wir Ihnen Protokolle, um die Beeinträchtigung der neurovaskuläre Einheit während experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis in vivo zu untersuchen. Wir gezielt auf Durchlässigkeit der Blut - Hirn-Schranke und Gelatinase Tätigkeit in Leukozyte Migration über die Glia Limitans ermitteln.

Beeinträchtigung der Endothelzellen und glialen Barrieren des Referats neurovaskuläre während experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis In Vivo Visualisierung

Dieses Manuskript stellt ein Protokoll zur Induzieren von aktiver experimenteller Autoimmunenzephalomyelitis (EAE) bei Mäusen dar. Eine Methode zur Isolierung und Charakterisierung der infiltrierten Lymphozyten im Zentralnervensystem (ZNS) wird ebenfalls vorgestellt, um zu zeigen, wie Lymphozyten an der Entwicklung einer CNS-Autoimmunerkrankung beteiligt sind.

Flow Cytometric Analyse der Lymphozyteninfiltration im Zentralnervensystem während der experimentellen Autoimmunenzephalomyelitis

Dieses Protokoll hat das Ziel, in vivo Myelin-Änderungen (Demyelination und Remyelination) durch Positronen-Emissionstomographie (PET) Bildgebung in einem Tiermodell der Multiplen Sklerose zu überwachen.

Positronen-Emissionstomographie-Bildgebung zur In-Vivo-Messung des Myelingehalts im Lysolecithin-Rattenmodell der Multiplen Sklerose

Dieses Protokoll beschreibt die Methodik zur nicht-invasiven Verfolgung von T-Zellen, die genetisch so verändert wurden, dass sie chimäre Antigenrezeptoren in vivo mit einer klinisch verfügbaren Plattform exprimieren.

Dynamische Bildgebung von chimären Antigenrezeptor-T-Zellen mit [18F]Tetrafluoroborat-Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie

Das vorliegende Protokoll beschreibt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell unter Verwendung von Myelin-Oligodendrozyten-Glykoprotein und die Überwachung des Krankheitsprozesses mit einem klinischen Scoring-System. Experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis-bezogene Symptome werden mittels Mausfemur-Mikro-Computertomographie und Freilandtest analysiert, um den Krankheitsprozess umfassend zu beurteilen.

Induktion und diverse Bewertungsindikatoren der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis

Die experimentelle autoimmune Enzephalomyelitis (EAE) ist ein Tiermodell für Multiple Sklerose (MS), das mit der menschlichen Krankheit eine robuste humorale Autoimmunreaktion teilt. In dieser Arbeit berichten wir über ein einfaches und flexibles ELISA-Protokoll zur Quantifizierung von Autoantikörpern im Serum von EAE-immunisierten Mäusen.

Quantifizierung autoreaktiver Antikörper in Mäusen nach experimenteller autoimmuner Enzephalomyelitis

Erfahren Sie die PET-Bildgebung von CD19+ B-Zellen im ZNS eines EAE-Mausmodells. Diese Methode ermöglicht präzise Quantifizierung und Visualisierung von B-Zell-Dynamiken bei neurologischen Erkrankungen wie Multipler Sklerose.

Bildgebung von CD19+ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie (Video) | JoVE Journal

Bildgebung von CD19⁺ B-Zellen in einem experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis-Mausmodell mit Positronen-Emissions-Tomographie

Weitere Videos entdecken