Embryo-Injektionstechnik zur Gen-Editierung bei der Schwarzbeinigen Zecke (Ixodes scapularis)

Dies ist das erste Embryo-Injektionsprotokoll für eine Chelicerata-Art. Die Fähigkeit, Zeckenembryonen zu injizieren, wird viele Forschungslinien eröffnen, insbesondere Studien zur Zeckengenfunktion und zu Interaktionen mit Zeckenpathogenen. Diese Technik ermöglicht zukünftige Arbeiten an funktionellen Studien von Zeckengenen und bietet eine Grundlage für die Kontrolle der Zeckenpopulation mithilfe von Gene-Drive-Systemen.

Diese Methode wird das Verständnis der Interaktion zwischen Zecken und den Krankheitserregern, die sie beherbergen, auf molekularer Ebene erleichtern. Damit können wir Proteine identifizieren, die für die Entwicklung von Impfstoffen gegen Borreliose und andere Krankheitserreger verwendet werden können. Mehrere Forschungsbereiche wie Zeckenpathogen-Interaktionen und die Übertragung von Erregern auf Wirte durch Zecken während der Fütterung werden von dieser Arbeit profitieren.

Grundlegendere Fragen wie zum Beispiel, wie Zecken der Immunantwort des Wirts entgehen, und Unterschiede in den DNA-Reparaturmechanismen können jetzt ebenfalls verstanden werden. Es gibt einige Aspekte der Zeckenbiologie, die vor der Durchführung dieses Verfahrens verstanden werden müssen. Der hohe Innendruck des Embryos führt bei Nadelberührung zum Platzen.

Es ist sehr wichtig, Embryonen für die Injektion vorzubereiten. Um zu beginnen, übertragen Sie Weibchen von vier Grad Celsius in einen 27 Grad Celsius Inkubator für die Einleitung der Eiablage eine Woche vor den Injektionen. Nach drei bis vier Tagen, wenn die Weibchen mit der Eiablage beginnen, entfernen Sie alle Eier mit einem feinen Pinsel, während Sie die Weibchen auf Genes Organablation vorbereiten.

Um die Drüse zu entleeren, ordnen Sie die gravide Zecke auf einem Glasobjektträger unter einem Mikroskop so an, dass Mundteile sowohl auf der ventralen als auch auf der dorsalen Seite sichtbar sind. Dann punktieren Sie vorsichtig den Bereich hinter den Mundteilen auf der dorsalen Seite und üben Sie Druck auf die ventrale Seite mit einer Pinzette aus. Legen Sie den Rand eines fusselfreien Tuchs und entfernen Sie das flüssige Wachs, das aus der Einstichstelle kommt.

Alternativ können anstelle der Entleerung der Drüse durch Dissektion Klebstoffe wie Gewebekleber um die Zeckenmundteile herum verwendet werden. Wenn die Weibchen wieder Eier legen, sammeln Sie mit einem feinen Pinsel frisch abgelegte Eier und legen Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie etwa 200 Mikroliter 5% Benzalkoniumchloridwasser in das Röhrchen mit null bis 18 Stunden alten Eiern hinzu.

Schwenken Sie die Eier vorsichtig mit dem Pinsel für fünf Minuten, um zu vermeiden, dass sich die Eier im Boden der Röhre absetzen, und entfernen Sie den Überstand mit einer Mikropipette, wobei die Eier in der Röhre zurückbleiben. Fügen Sie etwa 200 Mikroliter destilliertes Wasser in das Röhrchen mit den Eiern hinzu. Schwenken Sie mit einem Pinsel und entfernen Sie das Wasser mit einer Mikropipette aus dem Mikrozentrifugenrohr.

Nach dem Waschen mit destilliertem Wasser etwa 200 Mikroliter 5% Natriumchlorid hinzufügen und fünf Minuten lang vorsichtig mit einem Pinsel schwenken. Dann entfernen Sie die Lösung nach fünf Minuten aus dem Röhrchen und waschen Sie die Eier zweimal mit destilliertem Wasser. Als nächstes fügen Sie etwa 100 Mikroliter 1% Natriumchloridlösung in das Mikrozentrifugenröhrchen mit Eiern hinzu.

Kleben Sie zuerst zwei Glasmikroskop-Objektträger zusammen, lassen Sie einen Abstand von etwa 0,5 Zentimetern, um das Ausrichten der Eier mit einem doppelseitigen Klebeband zu unterstützen, und tragen Sie ein Stück transparenten Filmverband auf das doppelseitige Klebeband im Spalt zwischen den Objektträgern auf. Richten Sie dann acht bis 10 Eier gleichzeitig mit einem Pinsel auf der Folie aus. Legen Sie dann den Objektträger mit ausgerichteten Eiern auf den Tisch eines zusammengesetzten Mikroskops und entfernen Sie die 1% ige Natriumchloridlösung mit einem fusselfreien Wischtuch, in dem sie aufbewahrt werden.

Befestigen Sie die gefüllte Injektionsnadel an einem Mikroinjektor, der mit einem Mikromanipulator verbunden ist. Als nächstes öffnen Sie die Nadel, indem Sie sie vorsichtig gegen die Eioberfläche reiben, indem Sie eine hohe Druckeinstellung am Mikroinjektor verwenden. Nachdem die Nadel geöffnet wurde, reduzieren Sie den Druck des Mikroinjektors in Abhängigkeit von der Öffnung der Nadel.

Injizieren Sie dann so schnell wie möglich alle Eier auf den Objektträger in einem Winkel von 10 bis 15 Grad, drücken Sie schnell auf das Fußpedal und bewegen Sie den Objektträger sofort mit einem feuchten Papiertuch in einer Petrischale auf hohe Feuchtigkeitsbedingungen. Nachdem Sie den Objektträger mit den injizierten Embryonen fünf bis sechs Stunden in eine große Petrischale gelegt haben, die mit feuchtem Filterpapier ausgekleidet ist, geben Sie einen kleinen Tropfen destilliertes Wasser in den transparenten Filmverband mit injizierten Embryonen. Verschieben Sie die Eier dann vorsichtig mit einem Pinsel.

Als nächstes geben Sie die Eier in eine kleine Petrischale und tauchen sie in destilliertes Wasser. Halten Sie die Eier in Wasser getaucht, legen Sie die Petrischale in eine sechs Liter Kunststoffbox in einem Inkubator bei 27 Grad Celsius bei mehr als 90% relativer Luftfeuchtigkeit. Wenn die Larve 21 bis 25 Tage nach der Injektion aus den injizierten Embryonen zu schlüpfen beginnt, überprüfen Sie sie täglich und übertragen Sie alle geschlüpften Larven in Glasfläschchen mit einem Sieb oben.

Die Ergebnisse zeigten, dass die Injektion der Eizellen zu Beginn der Embryogenese im Alter von 12 bis 18 Stunden und die Ausrichtung der längeren Achse des Eies senkrecht zum Rand des Objektträgers zu einer höheren Überlebensrate der injizierten Eier führt. Von allen injizierten Eiern überlebten bis zu 8,5% und Larven schlüpften. Bevor Sie mit diesem Verfahren beginnen, ist es wichtig, sich an die Schritte 2.4 zu erinnern, die Entfernung des Wachses von der Mutterzecke und die Schritte 3.1 bis 3.4, die Erweichung des Chorions des Embryos mit Benzalkoniumchlorid und die Austrocknung des Embryos mit Natriumchloridlösungen, um eine erfolgreiche Embryoinjektion zu ermöglichen.

Diese Methode wurde in erster Linie für die Bearbeitung von Zeckengenen entwickelt, und dies wird es uns ermöglichen, Knockouts und Knock-Ins durchzuführen, die uns helfen, die Zeckengenfunktion zu verstehen. Diese Technik wird es ermöglichen, Gen-Editing-Tools zu verwenden, die für viele andere Organismen zur Verfügung stehen, um in der Zeckenforschung angewendet zu werden. Und das wird die molekularbiologische Forschung der Zecken beschleunigen.