Phospholipid-Mediator-induzierte Transformation in dreidimensionalen Kulturen

Unsere modifizierten 3D-Assay-Kulturen können verwendet werden, um die Rolle verschiedener Komponenten in einer Krebsmikroumgebung zu untersuchen, was zur Identifizierung neuer Biomarker und Wirkstoffziele führt. Diese Methode ermöglicht es, Veränderungen im zellulären Phänotyp und molekulare Signale zu untersuchen, die dem Immunsystem sehr ähnlich sind. Es kann auch modifiziert werden, um spezifische Anforderungen einer Studie zu erfüllen.

Diese Methode kann helfen, neue Biomarker zu identifizieren, die bei der Früherkennung von Brustkrebs helfen können. Molekulare Erkenntnisse können auch zur Identifizierung neuartiger Wirkstoffziele genutzt werden. Diese Methode kann verwendet werden, um sowohl die Tumorgenese als auch die Morphogenese nach Störungen von Genen oder Genen zu untersuchen, die Aufschluss über die Rolle des Gens oder der Gene geben können.

Trypsinisieren Sie zunächst die Zellen, indem Sie das Medium absaugen und mit 2 Milliliter PBS waschen. Fügen Sie 900 Mikroliter 0,05% Trypsin-EDTA hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für etwa 15 Minuten oder bis die Zellen vollständig trypsinisiert sind. Bereiten Sie ein Bett aus lrECM in acht Vertiefungen eines gekammerten Deckglasobjektträgers vor, indem Sie jede Vertiefung mit 60 Mikrolitern lrECM beschichten.

Stellen Sie es für maximal 15 Minuten in einen 37 Grad Celsius heißen Kohlendioxid-Inkubator. Um die Zellsuspension vorzubereiten, fügen Sie 5 Milliliter Resuspensionsmedium hinzu, um die Trypsinaktivität zu löschen, und drehen Sie die Zellen bei 112 mal g für 10 Minuten bei 25 Grad Celsius. Das verbrauchte Medium wird abgesaugt und die Zellen in 2 Milliliter Assaymedium wieder suspendiert.

Mischen Sie die Suspension gut, um die Bildung einer einzelligen Suspension sicherzustellen. Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer und berechnen Sie das Volumen der Zellsuspension, die benötigt wird, um 6.000 Zellen in jeder Vertiefung zu säen. Je nach Anzahl der erforderlichen Vertiefungen die Zellsuspension im Overlay-Medium verdünnen.

Fügen Sie 400 Mikroliter der verdünnten Zellsuspension in die vorbereiteten lrECM-Betten hinzu und achten Sie darauf, das lrECM-Bett nicht zu stören. Inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten 5% Kohlendioxid-Inkubator. Nach 3 Stunden fügen Sie 200 Nanomol PAF zu jeder Vertiefung hinzu.

Fügen Sie bei jedem Medienwechsel die gleiche Konzentration an PAF hinzu und füllen Sie die Zellen alle 4 Tage mit frischem Medium auf. Nach 20 Tagen Kultivierung pipetten Sie das Medium vorsichtig aus jeder Vertiefung und waschen Sie die Vertiefungen mit 400 Mikrolitern vorgewärmtem PBS. Fixieren Sie die Azinusstrukturen, indem Sie 400 Mikroliter frisch zubereitetes 4% Paraformaldehyd hinzufügen und 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Spülen Sie die Vertiefungen einmal mit eiskaltem PBS ab und permeabilisieren Sie mit PBS mit 0,5% Triton X-100 für 10 Minuten bei 4 Grad Celsius. Nach 10 Minuten die Triton X-100-Lösung vorsichtig herauspipetten und mit 400 Mikrolitern frisch zubereitetem PBS-Glycin abspülen. Fügen Sie 400 Mikroliter der primären Blockierungslösung mit 10% Ziegenserum in Immunfluoreszenzpuffer hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 60 Minuten.

Entfernen Sie die primäre Blockierungslösung, fügen Sie 200 Mikroliter 2% sekundären blockierenden Antikörper hinzu, der in der primären Blockierungslösung hergestellt wurde, und lassen Sie sie 45 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur stehen. Bereiten Sie den primären Antikörper in 2%iger sekundärer blockierender Antikörperlösung in einer Verdünnung von 1:100 vor. Entfernen Sie die sekundäre Blocklösung, fügen Sie den frisch zubereiteten Antikörper hinzu und inkubieren Sie über Nacht bei 4 Grad Celsius.

Pipetten Sie die primäre Antikörperlösung vorsichtig und waschen Sie sie dreimal mit 400 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer. Als nächstes wird eine 1:200-Verdünnung des fluorophorkonjugierten sekundären Antikörpers in der primären Blocklösung hergestellt und die Objektträger in der sekundären Antikörperlösung für 40 bis 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Spülen Sie die Objektträger mit 400 Mikrolitern Immunfluoreszenzpuffer für 20 Minuten, gefolgt von zwei Wäschen mit PBS für jeweils 10 Minuten.

Die Kerne mit PBS, das 0,5 Nanogramm pro Milliliter Kernfärbung enthält, für 5 bis 6 Minuten bei Raumtemperatur gegenfärben. Waschen Sie die Objektträger dreimal mit 400 Mikrolitern PBS, um den überschüssigen Fleck zu entfernen. Pipette vorsichtig das gesamte PBS heraus und stelle sicher, dass die Restlösung entfernt wird.

Dann einen Tropfen Montagereagenz in jede Vertiefung geben und über Nacht bei Raumtemperatur stehen lassen. Schließlich bilden Sie die Objektträger unter 40- oder 63-facher Vergrößerung auf einem konfokalen Mikroskop ab und nehmen optische Z-Schnitte von 0,6 Millimetern Schrittgröße auf. Die Bilder zeigen die Zellkerne in Acini, die mit einer Kernfärbung gefärbt sind.

Die 3D-Konstruktion der Acini und das Phasenkontrastbild von MCF10A-Acini, die 20 Tage lang auf lrECM gezüchtet wurden, werden hier gezeigt. Der mittlere Abschnitt zeigt das Vorhandensein eines hohlen Lumens. PAF stört die Polarität und induziert EMT-ähnliche Veränderungen in MCF10A Brustacini.

MCF10A-Zellen wurden als 3D-on-Top'-Kulturen in lrECM gezüchtet. Die Kulturen wurden am Tag 0, 4, 8, 12 und 16 mit PAF behandelt. Die Kulturen wurden 20 Tage lang gehalten und dann auf alpha6-Integrin und Kernfärbung, GM130, einen Marker für apikale Polarität, und Vimentin, einen EMT-Marker, immungefärbt.

Hier ist der mittigste Stapel der jeweiligen Acini dargestellt. Die repräsentativen Daten beziehen sich auf 40-50 Acini aus drei biologisch unabhängigen Experimenten. Das lrECM-Bett muss sorgfältig so gestaltet werden, dass es gleichmäßig und ohne Luftblasen verteilt wird.

Außerdem sollte die Zellsuspension gleichmäßig gemischt und langsam hinzugefügt werden, um ein Verklumpen zu vermeiden. Aus den 3D-Kulturen kann man Protein und RNA gewinnen, mit denen dann die verschiedenen molekularen Signalwege untersucht werden können.