Name: Schonende Isolierung von Kernen aus dem Hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein natürlich kurzlebiges Modell für die Alternsforschung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
Description: Lernen Sie die schonende Isolierung von Kernen aus dem Gehirn des afrikanischen türkisfarbenen Killifischs für Einzelkern-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen des zellulären Alterns im Gehirn.

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Einige Panels wurden mit BioRender.com generiert. Diese Arbeit in unserem Labor wurde durch das NIA T32 AG052374 Postdoctoral Training Grant an B.T., ein Stipendium der Simons Foundation im Rahmen der Simons Collaboration for Plasticity in the Aging Brain, ein Pilotstipendium der Navigage Foundation und ein Hanson-Thorell Family Award an B.A.B.

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</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Mit dem hier vorgestellten Protokoll lassen sich hochwertige Kerne aus Killifischhirnen reproduzierbar erzeugen. Dieses Protokoll musste speziell für das Killifisch-Gehirn entwickelt werden, da typische Säugetier-basierte Gehirnkern-Isolationsprotokolle, die auf Killifisch-Gehirne angewendet wurden, durchweg zu einer schlechten Kernqualität in unseren Händen führten. Wir vermuten, dass dies auf den geringeren relativen Myelingehalt des Killifisch-Gehirns im Vergleich zu ihren Säugetier-Gegenstücken zurückzuführen ist, die als Reaktion auf die rauen Bedingungen, die für die Lyse von Säugetier-Gehirnzellen erforderlich sind, lysieren und verklumpen würden. Dieses Protokoll ist ein Fortschritt in den Bereichen Alterung und Killifische, da es die Erforschung der Gehirnalterung auf Einzelzellebene in einem kostengünstigen und zeiteffektiven Modell der Gehirnalterung von Wirbeltieren erleichtert. 
Dieses Protokoll ist robust gegenüber frischen oder gefrorenen Proben, obwohl man bei der Verwendung von frischem oder gefrorenem Gewebe die nachgeschalteten Anwendungen berücksichtigen muss. Gefrorenes Gewebe ist oft praktisch, da es monatelang gesammelt und gelagert werden kann, während Proben gesammelt werden. Solche Proben können sicher für Anwendungen wie snRNA-seq verwendet werden. Das Einfrieren von Proben kann jedoch die Kernstruktur und damit die Fähigkeit zur genauen Messung der Chromatinlandschaft durch ATAC-seq21 stören. Daher wird für nachgelagerte Anwendungen wie Bulk-ATAC-seq oder snATAC-seq empfohlen, frisch sezierte Gehirne anstelle von gefrorenen Gehirnen zu verwenden. Da alle Schritte nach der Gehirnhomogenisierung parallel durchgeführt werden können, ist dieses Protokoll außerdem für den Betrieb mehrerer Proben in einem angemessenen Zeitrahmen geeignet, wodurch der RNA-Abbau durch längere Inkubation auf Eis begrenzt wird.
Darüber hinaus ist es unerlässlich, Puffer frisch (innerhalb von Stunden) nach der Kernextraktion vorzubereiten. Wir haben festgestellt, dass sowohl Reinigungsmittel als auch BSA unmittelbar vor Beginn des Protokolls zu den Puffern hinzugefügt werden müssen. Puffer, die nur Salze (PBS, NaCl usw.) enthalten, können als Konzentrate hergestellt, sterilisiert (0,22 μm) und unbegrenzt bei Raumtemperatur gelagert werden. BSA-Stammlösungen können innerhalb weniger Tage nach der Kernextraktion (wenn sie aus einem Pulver hergestellt werden) hergestellt, sterilisiert und bei 4 °C gelagert werden, sollten jedoch den in diesem Protokoll verwendeten Puffern immer unmittelbar vor der Durchführung des Protokolls zugesetzt werden. Wir empfehlen jedoch, BSA-Lösungen am Tag des Protokolls vorzubereiten. Wenn Sie vorgefertigte BSA-Lösungen von Drittanbietern verwenden, wird empfohlen, frische, ungeöffnete Flaschen zu verwenden. Die Verwendung von frischem BSA führt im Allgemeinen zu einem geringeren Schmutzgehalt in den Zellkernvorbereitungen.
Unabhängig davon, ob frische oder gefrorene Proben als Input verwendet werden, ist es wichtig, die Kernqualität nach der Kernisolierung zu beurteilen. Obwohl dieses Protokoll speziell entwickelt wurde, um Überlyse zu vermeiden, ist dies die häufigste Ursache für den Verlust der Kernqualität. Die Überlyse kann durch zu viel Zeit im Lysepuffer, eine zu raue Handhabung der Kerne wie übermäßiges Pipettieren mit einer Standardpipettenspitze oder eine übermäßige Zeitspanne zwischen der Kernisolierung und nachgeschalteten Anwendungen (>1 h) entstehen. Überlysierte Kerne haben oft beschädigte Kernperipherien, die DNA austreten und Verklumpungen verursachen (Abbildung 2B). Dies wird zu einer erhöhten Anzahl von Multiplets führen und Hintergrundnukleinsäuren beitragen, die nachgelagerte Anwendungen, insbesondere snRNA-seq, stören. Beide Eigenschaften können nach Kernisolierung mikroskopisch beurteilt werden. Wenn eine übermäßige Kernverklumpung beobachtet wird, empfehlen wir, die Inkubation im Lyseschritt zu verkürzen, um die Wahrscheinlichkeit einer Überlyse zu verringern. Als alternative Methode zur Erhöhung der Nuklei-Singlets kann die fluoreszenzunterstützte Zellsortierung (FACS) verwendet werden, um Singlets stromabwärts dieses Protokolls anzureichern. Wir stellen jedoch fest, dass bei der Arbeit mit bereits fragilen Kernen aus gefrorenem Gewebe die während der Sortierung auftretende Scherspannung zu einem erhöhten Kernbruch und damit zu einer erhöhten Umgebungs-RNA / DNA führen kann. Darüber hinaus stellen wir fest, dass die Zeit, die benötigt wird, um eine FACS-Ertragssortierung für Kerne durchzuführen, wenn mehrere Proben verarbeitet werden, erfordern würde, dass alle Kernproben stundenlang auf Eis bleiben, während andere Proben sortiert werden. Daher könnten längere Wartezeiten bei der parallelen Verarbeitung mehrerer Proben mit dem FACS-Ansatz wahrscheinlich auch zu einer insgesamt reduzierten Kernqualität führen und das Risiko eines RNA-Abbaus erhöhen. Wenn also FACS für eine reduzierte Doublet-Rate gewünscht wird, empfehlen wir, den Schmutzgehalt nach der Ausbeutesortierung erneut zu überprüfen und eine mögliche reduzierte RNA-Qualität für Einzelzell-RNA-seq-Anwendungen als möglichen Vorbehalt zu berücksichtigen. 
Eine genaue Schätzung der Kernzahl und des Singulettanteils ist für fast alle nachgeschalteten "Omics"-Anwendungen unerlässlich und von größter Bedeutung. Aufgrund der Fähigkeit, Kerne einfach nach Größe zu toren und zu zählen, ist die Durchflusszytometrie die genaueste Methode zum Zählen von Kernen, die wir bewertet haben. Alternativ kann man Zellzähler mit Zellzählern wie Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter oder dem DeNovix CellDrop Automated Cell Counter quantifizieren. Zu beachten ist, dass Invitrogens Countess 2 FL Automated Cell Counter und in viel geringerem Maße der DeNovix dazu neigen, die Anzahl der Kerne zu überschätzen, indem sie Trümmer als Kerne zählen, was bedeutet, dass ein manuelles Größengating erforderlich sein kann. Darüber hinaus ermöglicht das Durchflusszytometer eine einfache Beurteilung der Reinheit der Kerne. Man kann das relative Verhältnis von Singulett- und Multipletkernen auf eine quantitative Weise erkennen, die durch Mikroskopie schwierig ist. Dies ist für snRNA-seq und snATAC-seq von entscheidender Bedeutung, da diese Protokolle unter einem Überschuss an Multiplet-Proben leiden, die von nachgelagerten Analysen ausgeschlossen werden müssen. Neben Multipleten kann der relative Anteil von "Trümmern" (fragmentierte Kerne, Zelltrümmer) durch Durchflusszytometrie quantifiziert werden und muss relativ gering sein, da dieses Material oft kontaminierende Nukleinsäuren enthält, die ein Hintergrundsignal und korrumpierende Einzelkern-"Omics"-Daten beitragen können. 
Wie bei zuvor beschriebenen Kernisolierungsprotokollen können die Anteile der Zelltypen im ursprünglichen Gewebe in der Zellkernvorbereitung19 nicht originalgetreu rekapituliert werden und sollten daher mit Vorsicht interpretiert werden. Wie alle Teleosts haben afrikanische türkisfarbene Killifische kernhaltige Erythrozyten, von denen erwartet wird, dass sie auch in der Kernvorbereitung vertreten sind. Diese Kerne können in snRNA-seq- und snATAC-seq-Datensätzen durch die höhere Expression/Zugänglichkeit von Hämoglobingenen identifiziert und rechnerisch ausgeschlossen werden, falls gewünscht.

Das Verständnis der Mechanismen der Alterung des Gehirns von Wirbeltieren ist entscheidend für die Behandlung altersbedingter neurodegenerativer Erkrankungen wie Alzheimer und Demenz1. Der Afrikanische Türkis-Killifisch (Nothobranchus furzeri) ist das kurzlebigste Wirbeltier, das in Gefangenschaft gezüchtet werden kann, und aufgrund seiner kurzen Lebensdauer und altersbedingten kognitiven Beeinträchtigung ist es ein ausgezeichnetes Gehirnalterungsmodell 2,3,4,5. In jüngster Zeit hat das Aufkommen von Einzelzell-"Omics" -Technologien, wie Single Nuclei RNA-seq (snRNA-seq) und Single Nuclei Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (snATAC-seq), es Forschern ermöglicht, das alternde Gehirn mit einer beispiellosen Auflösung zu befragen 6,7,8. Diese Methoden beruhen auf der Isolierung von Kernen, da die Wiederherstellung von Gehirnzellen wie Neuronen oft zu schwierig ist, um 6,7,8,9,10 zu isolieren. Die meisten veröffentlichten Kernisolierungsprotokolle sind jedoch für Säugetiermodellorganismen 11,12,13,14,15 optimiert. Da also derzeit ein ungedeckter Bedarf besteht, Hirnkerne im Killifisch als aufstrebenden neuen Modellorganismus im Bereich der Alternsforschung2 zu isolieren, ist das Ziel dieses Protokolls, eine Methode zur Isolierung hochwertiger Kerne aus gefrorenem Hirnkillifischgewebe zu etablieren.
Hier wird ein optimierter und robuster Workflow etabliert, der allgemein verfügbare Materialien verwendet, um hochwertige Kerne aus Killifischhirnen zu isolieren. Dieses Protokoll wurde von einem 10-fachen Genomik-Protokoll für Mausgehirne modifiziert, um den Gehirnen mit niedrigerem Myelingehalt von afrikanischen türkisfarbenen Killifischen Rechnung zu tragen, der Zerbrechlichkeit von gefrorenem Gewebe und der Notwendigkeit, den Gehalt an Umgebungsschmutz für sequenzierungsbezogene Anwendungen zu reduzieren16. Tatsächlich führen zuvor optimierte Protokolle für Säugetierhirngewebe17,18 zu schlechter Kernqualität (d.h. Überlyse) und/oder hohem Trümmergehalt, wenn sie auf gefrorenen Killifischen verwendet werden, was sie für die Verwendung mit snRNA-seq gemäß den Empfehlungen für Einzelkern-RNA-seq unter Verwendung von Mikrofluidik ungeeignet macht (ergänzende Abbildung 1).
Neben der Kernisolierung zeigen wir, wie die Qualität und Ausbeute der Kerne durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie beurteilt werden kann. Dieser Artikel enthält Beispiele für optimale und suboptimale Ergebnisse und erläutert die Problembehandlung. Dieses Protokoll wurde für gefrorene Killifischhirne entwickelt und optimiert, kann aber auch ohne größere Modifikationen an frisch sezierten Killifischproben verwendet werden. Killifish Hirnkerne, die mit dieser Methode isoliert wurden, wurden für die Verwendung in Single Nucleus RNA-seq (snRNA-seq) als Downstream-Anwendung optimiert, sollten aber auch für den Einsatz in snATAC-seq und Bulk ATAC-seq geeignet sein.

<table><tbody><tr><td>0,4% Trypanblau-Lösung</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Bioland</td><td>PBS01-03</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Konikel-Zentrifugenröhrchen</td><td>VWR</td><td>89039-664</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Tissue Grinder</td><td>Kimble</td><td>885300-0002</td><td>Dounce Homogenisator</td></tr><tr><td>5 mL Polystyrol Rundbodenröhrchen</td><td>Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>5M Natriumchlorid, </td><td>Promega</td><td>V4221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Spüllösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Dies entspricht 1x PBS pH 7,2, 2 mM EDTA (für die Durchflusszytometrie)</td></tr><tr><td>Lösung zur Entfernung von Ablagerungen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-109-398</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBInd Tube</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Echo Revolve Mikroskop (bestückt mit 60x Objektiv)</td><td>Echo</td><td>NA</td><td>Keine Katalognummer; Wird zur visuellen Inspektion von Kernen verwendet.</td></tr><tr><td>Falcon Polystyrol-Röhrchen mit rundem Boden, 5 mL</td><td>Falcon</td><td>352052</td><td>FACS-Röhrchen</td></tr><tr><td>FLOWMI Zellsiebe, 40 &mu; M</td><td>SP Bel-Art</td><td>136800040</td><td>Im Protokoll als On-Tip-Filter</td></tr> bezeichnet <tr><td>Salzsäure</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>258146-500 mL</td><td>Wird verwendet, um den TRIS-pH-Wert von 8,0 auf 7,4</td></tr><tr><td>zu senken Leica EZ4 Präparierendoskop</td><td>Leica</td><td>NA</td><td>Keine Katalognummer</td></tr><tr><td>MACS BSA Lagerlösung</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130091376</td><td></td></tr><tr><td>MACS SmartStrainers (70 &mu; M)</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-916</td><td></td></tr><tr><td>MACSQuant Analyzer 10 Durchflusszytometer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>NA</td><td>Keine Katalognummer</td></tr><tr><td>Magnesiumchlorid, Hexahydrat, Molekularbiologische Qualität (Pulver)</td><td>Millipore</td><td>442611</td><td></td></tr><tr><td>Megafuge 16R Zentrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>75003629</td><td></td></tr><tr><td>Micro Cover Glas</td><td>VWR</td><td>48393081</td><td></td></tr><tr><td>Micro Slides Superfrost Plus</td><td>VWR</td><td>48311-703</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P-40 Ersatz</td><td>Roche</td><td>(Roche) 11332473001/ Katalog: 983739 P Code: -102368106 (Sigma Aldrich)</td><td></td></tr><tr><td>NP-40 Surfact-Amps Waschmittellösung</td><td>ThermoFisher</td><td>85124</td><td></td></tr><tr><td>Nukleasefrei HyPure Wasser HyClone in molekularbiologischer Qualität</td><td></td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>NxGen RNase Inhibitor (50.000 U)</td><td>Lucigen</td><td>30281-2</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid-Lösung</td><td>MBL</td><td>FP00010020</td><td></td></tr><tr><td>PureBlu DAPI Nuclear Staining Dye</td><td>Biorad</td><td>1351303</td><td></td></tr><tr><td>TipOne RPT Pipettenspitzen (extrem niedrige Retention, gefiltert) in 10 & Mikro; L, 20 & Mikro; L, 200 & Mikro; L und 1000 &micro; L-Größen</td><td>USA Scientific</td><td>#1181-3810; #1180-1810; #1180-8810; #1182-1830</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine-S (MS 222)</td><td>Syndel</td><td>Tricaine10G</td><td>Syndel ist ein von der FDA zugelassener Anbieter von Tricain TRIS</td></tr><tr><td>, 1 M, pH 8,0</td><td>VWR</td><td>E199-500 mL</td><td></td></tr><tr><td>Pipettenspitzen mit breiter Bohrung</td><td>Axygen</td><td>T-1005-WB-C</td><td></td></tr></tbody></table>

schonende isolierung von kernen aus dem hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener killifische, ein natürlich kurzlebiges modell für die alternsforschung

Gentle Isolation of Nuclei from the Brain Tissue of Adult African Turquoise Killifish, a Naturally Short-Lived Model for Aging Research

Die Untersuchung der Gehirnalterung mit Einzelzellauflösung in Wirbeltiersystemen bleibt aufgrund von Kosten, Zeit und technischen Einschränkungen eine Herausforderung. Hier demonstrieren wir ein Protokoll zur Generierung von Einzelkern-RNA-Sequenzierungsbibliotheken (snRNA-seq) aus den Gehirnen des natürlich kurzlebigen afrikanischen Türkis-Killifischen Nothobranchius furzeri. Der afrikanische türkisfarbene Killifisch hat eine Lebensdauer von 4-6 Monaten und kann kostengünstig untergebracht werden, wodurch Kosten- und Zeitbarrieren für die Untersuchung der Gehirnalterung von Wirbeltieren reduziert werden. Es sind jedoch maßgeschneiderte Protokolle erforderlich, um Kerne von ausreichender Qualität für nachgeschaltete Einzelzellexperimente aus dem Gehirn junger und alter Fische zu isolieren. Hier demonstrieren wir ein empirisch optimiertes Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne aus dem Gehirn erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein kritischer Schritt bei der Erzeugung hochwertiger Einzelkern-Omik-Bibliotheken. Darüber hinaus zeigen wir, dass die Schritte zur Reduzierung der kontaminierenden Hintergrund-RNA wichtig sind, um Zelltypen klar zu unterscheiden. Zusammenfassend zeigt dieses Protokoll die Machbarkeit der Untersuchung der Gehirnalterung in nicht-traditionellen Wirbeltiermodellorganismen.

Das hier beschriebene Isolationsprotokoll für Killifische Hirnkerne ist speziell für die Killifische optimiert und in Abbildung 1 zusammengefasst. Neben der Kernextraktion beschreibt das Protokoll verschiedene Methoden zur Beurteilung der Qualität und Quantität isolierter Kerne. Abbildung 2 zeigt Beispiele für gesunde (Abbildung 2A) und ungesunde (Abbildung 2B) Kerne, die lichtmikroskopisch beurteilt wurden. Gesunde Kerne, die für die nachgeschaltete Analyse geeignet sind (Abbildung 2A), liegen als Singulettkerne mit intakten Membranen vor. Wie in Abbildung 2B gezeigt, ist der häufigste Fehlermodus dieses Protokolls (und anderer Kernisolierungsprotokolle) die Erzeugung von überlysierten Kernen, die durch beschädigte Kernmembranen gekennzeichnet sind. Dies führt häufig zur Verklumpung von Kernen und kann aufgrund des Austritts von Nukleinsäuren aus den aufgebrochenen Kernen zu Hintergrundsignalen in nachgeschalteten Anwendungen beitragen. Wenn eine übermäßige Verklumpung beobachtet wird, empfehlen wir, bei den Dounce-Schritten schonender zu sein und/oder die Inkubationszeiten im Lysepuffer zu reduzieren.
Dieses Protokoll verwendet Durchflusszytometrie, um die Anzahl der isolierten Kerne zu quantifizieren und den relativen Anteil der multiplen Kerne in einer Probe zu bestimmen. Darüber hinaus kann die Durchflusszytometrie verwendet werden, um den relativen Gehalt an kontaminierenden Trümmern, oft gerissenen Kernfragmenten und anderen Zelltrümmern zu bestimmen, die nachgeschaltete Assays in der Kernprobe beeinträchtigen können. Repräsentative Durchflussdaten sind in Abbildung 3 zu sehen. Ein qualitativ hochwertiges Kernisolierungsverfahren erzeugt: 1) eine kleine Trümmerfraktion und 2) eine hohe Fraktion von Singulett- versus Multipletkernen (&gt; 80% der Kernfraktion). Die Verwendung der PI-Färbung, die Nukleinsäuren färbt, ermöglicht es, Singulettkerne von Trümmern und multiplen Kernen zu trennen. Abbildung 3A ist ein Beispiel für eine Vorbereitung, die durch Trümmer kontaminiert ist, während Abbildung 3B ein Beispiel für ein qualitativ hochwertiges Experiment ist.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig01.jpg"> Abbildung 1: Arbeitsablauf zur Isolierung von Killifish-Hirnkernen. Experimenteller Workflow zur Kernisolierung aus gefrorenen oder frischen Killifischen Gehirnen. Einmal isoliert und bewertet, können Kerne für verschiedene nachgeschaltete "Omics"-Analysen verwendet werden. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig02.jpg"> Abbildung 2: Beurteilung der Kernqualität durch Mikroskopie. Die Kerne wurden 1:1 in einer Lösung von 0,4% Trypanblau gemischt und auf einem Echo-Revolve-Mikroskop durch Hellfeld-Bildgebung bei 60x visualisiert. (A) Ein Beispiel für einen hochwertigen Kern. Der Kern liegt als Singulett vor und die Kernmembran ist intakt. (B) Ein Beispiel für Kerne schlechter Qualität. Die Kernmembranen sind beschädigt, und die Kerne verklumpen zu einem Dublette, wahrscheinlich aufgrund des Austretens von klebriger DNA, die von der Spitze des obersten Kerns austritt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64165/64165fig03.jpg"> Abbildung 3: Kernquantifizierung und Reinheitsbewertung mittels Durchflusszytometrie. Die Kernproben wurden mit einer 1:100-Verdünnung von PI angefärbt und auf einem Durchflusszytometer ausgeführt. Kerne sind in Singulett- und Multipletform im oberen rechten Quadranten von (A,B) vorhanden, wobei Sinchen die unterste Ereigniswolke sind, gefolgt von Dubletten, Tripletten usw. in aufsteigender Reihenfolge. Trümmer werden durch die Ereignisse in den beiden äußersten linken Quadranten markiert. (A) Ein Beispiel für eine minderwertige Kernvorbereitung, bei der der Schritt zur Entfernung von Trümmern weggelassen wurde und Trümmer &gt;40% der Ereignisse ausmachen. (B) Ein Beispiel für eine hochwertige Kernprobe mit dem enthaltenen Schritt zur Entfernung von Trümmern. In diesem Beispiel machen Trümmer &lt;10% aller vom Durchflusszytometer registrierten Ereignisse aus. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/64165fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Probentyp (2 Gehirne)</td>
			<td>Durchschnittlicher Ertrag (4 unabhängige Präparate)</td>
		</tr><tr><td>5-wöchige männliche Gehirne</td>
			<td>3,59 ± 1,76 x 105</td>
		</tr><tr><td>10-wöchige männliche Gehirne</td>
			<td>6,41 ± 1,33 x 105</td>
		</tr><tr><td>15-wöchige männliche Gehirne</td>
			<td>14,59 ± 2,05 x 105</td>
		</tr><tr><td>5-wöchige weibliche Gehirne</td>
			<td>2,54 ± 0,75 x 105</td>
		</tr><tr><td>10-wöchige weibliche Gehirne</td>
			<td>4,66 ± 1,29 x 105</td>
		</tr><tr><td>15-wöchige weibliche Gehirne</td>
			<td>7,95 ± 3,51 x 105</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Durchschnittliche erwartete Erträge von zwei Gehirnen afrikanischer türkisfarbener Killifische über Geschlecht und Alter hinweg. Die durchschnittlichen Ausbeuten, ausgedrückt als 105 Kerne, ± Standardfehler des Mittelwerts über vier unabhängige Kernpräparate in jeder Kategorie.
Ergänzende Abbildung 1: Vergleich der Qualität der Kernisolierung unter Verwendung von Standardprotokollen und unserem optimierten Protokoll über gefrorene Killifischhirne. (A) Beurteilung der Kernqualität durch Mikroskopie. Die Kerne wurden 1:1 in einer Lösung von 0,4% Trypanblau gemischt und auf einem Mikroskop durch Hellfeldbildgebung bei 60x visualisiert. (B) Quantifizierung der Kern- und Trümmerbelastung durch Durchflusszytometrie. Die Kernproben wurden mit einer 1:100-Verdünnung von PI angefärbt und auf einem Durchflusszytometer ausgeführt. (C) Zusammenfassung der Qualitätsbewertungsmetriken durch Mikroskopie und Durchflusszytometrie mit den verschiedenen Benchmark-Protokollen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_FIgure_S1_v3.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Abbildung 2: Schematische Darstellung der Schritte zur Schmutzbeseitigung. (A) Schema der Schichtung vor der Zentrifugation zur Entfernung von Trümmern. (B) Schema der Überstandentfernung nach Zentrifugation. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64165/2022-07-06_Figure_S2_JOVE_Revision.pdf" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Isolierung von Kernen aus den Gehirnen des kurzlebigen Wirbeltiermodells Nothobranchius furzeri für nachgeschaltete Anwendungen wie Einzelkern-RNA-Sequenzierung oder Einzelkern-Assay für Transposase-zugängliches Chromatin mit Sequenzierung (ATAC-seq).

Schonende Isolierung von Kernen aus dem Hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein natürlich kurzlebiges Modell für die Alternsforschung

Studying brain aging at single-cell resolution in vertebrate systems remains challenging due to cost, time, and technical constraints. Here, we ...

Dies ist das erste optimierte Protokoll zur Isolierung hochwertiger Kerne für Einzelkernsequenzierungsexperimente mit gefrorenen Gehirnen afrikanischer türkisfarbener Killifische, einem aufstrebenden Wirbeltiermodell für die Alternsforschung. Dieses Protokoll isoliert Kerne sehr schonend, was es von härteren Protokollen unterscheidet, die für andere Organismen mit myelinisierteren Gehirnen optimiert sind, die bei Verwendung im Killifisch zu abgebauten Kernen führen. Diese Methode wird uns helfen, die Alterung des Gehirns auf Einzelzellebene zu verstehen.Es sollte sich gut auf andere Gewebe übertragen lassen, die eine schonendere Kernisolierung erfordern. Dieses Protokoll ist benutzerfreundlich. Die anspruchsvollste Aufgabe ist die Gradientenzentrifugation zur Schmutzentfernung, bei der es besser ist, langsam und genau zu sein als schnell und unordentlich.Ari Adler und Brian Teefy, ein Forschungslabortechniker und Postdoktorand aus dem Benayoun-Labor, demonstrieren das Verfahren. Nach dem Sezieren der Killifische das gefrorene Hirngewebe auf Eis für 10 Minuten auftauen und das Gehirn in einem Milliliter eiskalten Kern-Lysepuffer in einem Zwei-Milliliter-Düsterhomogenisator abstoßen. Halten Sie den Homogenisator während des Lysierens der Probe auf Eis und vermeiden Sie die Erzeugung von Blasen.Treten Sie das Gewebe wie im Manuskript beschrieben ab und lassen Sie die Probe zwei Minuten auf Eis im Dounce-Homogenisator ruhen. Anschließend wird die Probe durch einen 70-Mikrometer-Zellfilter in ein 15-Milliliter-konisches Röhrchen gesiebt, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist. Fügen Sie der Probe vier Milliliter Kernwaschpuffer hinzu, indem Sie den Waschpuffer über den 70-Mikrometer-Zellfilter pipettieren und durch fünfmaliges Umdrehen des Röhrchens mischen.Zentrifugieren Sie die Probe mit einem schwingenden Schaufelrotor bei 500 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand, indem Sie ihn vorsichtig in einen flüssigen Abfallbehälter gießen. Halten Sie die Probe aufrecht und entfernen Sie den restlichen Waschpuffer mit einer P1000-Pipette.Die Kerne werden sofort in einem Milliliter Kernwaschpuffer mit einer P1000-Pipettenspitze mit breiter Bohrung resuspendiert. Dann bringen Sie die Probe auf fünf Milliliter, indem Sie vier Milliliter Kernwaschpuffer hinzufügen und wie zuvor demonstriert mischen. Pelletieren Sie die Zelle durch Zentrifugieren.Verwerfen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Kerne in einem Milliliter Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze. Übertragen Sie nun die Kerne in ein Durchflusszytometrieröhrchen. Fügen Sie der Zellsuspension 300 Mikroliter Schmutzentfernungslösung hinzu und mischen Sie sie gründlich durch Pipettieren mit einer breiten Bohrungsspitze, bis die Mischung homogen ist.Halten Sie das Röhrchen in einem leichten Winkel und legen Sie vorsichtig einen Milliliter Kernwaschpuffer mit einer P1000-Pipette auf die Kernlösung. Zentrifugieren Sie die Probe in einem schwingenden Schaufelrotor bei 3000 G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie die oberen beiden Phasen vollständig mit einer P1000-Pipette.Übertragen Sie die untere Schicht in ein 15-Milliliter-konisches Rohr, das mit 5% BSA vorbeschichtet ist. Dann bringen Sie das Volumen mit Kernwaschpuffer auf 15 Milliliter und mischen Sie, indem Sie das Röhrchen dreimal umdrehen. Zentrifugieren Sie das Rohr bei 1000G für 10 Minuten bei vier Grad Celsius in einem schwingenden Schaufelrotor.Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und resuspendieren Sie das Pellet sofort in 150 Mikroliter Kernwaschpuffer mit einer breiten Pipettenspitze. Wechseln Sie zu einer Standard-Pipettenspitze mit 300 Mikrolitern. Pipetten Sie die gesamte Probe und befestigen Sie dann einen 40-Mikrometer-Filter am Ende der Pipettenspitze.Filtern Sie die Probe, indem Sie die Probe gewaltsam durch den Filter in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit niedriger DNA-Bindung ausstoßen. In einem FACS-Röhrchen werden 10 Mikroliter der gefilterten Kernprobe in 90 Mikrolitern des empfohlenen Durchflusszytometriepuffers resuspendiert. Färben Sie die Proben mit Propidiumiodid in einer Endkonzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter.Nachdem Sie den Arbeitsbereich wie im Manuskript beschrieben eingerichtet haben, starten Sie den Ablauf, indem Sie auf das Play-Symbol in der unteren rechten Ecke klicken. Überprüfen Sie, ob Luftblasen oder -klumpen in der Probe verwendet werden, indem Sie den Seitenstreubereich im Vergleich zu HDRT verwenden. Überprüfen Sie außerdem das Seitenstreudiagramm im Vergleich zum Vorwärtsstreudiagramm, um sicherzustellen, dass sich die Ereignisse innerhalb der Fenstergrenzen ansammeln.Doppelklicken Sie für eine vergrößerte Ansicht auf den Seitenstreubereich im Vergleich zum PerCP-Vio700-A-Diagramm. Klicken Sie auf die Schaltfläche in der oberen linken Symbolleiste mit einer senkrechten Linie, um ein Quadrantentor auszuwählen. Klicken Sie dann auf eine beliebige Stelle im Seitenstreubereich im Vergleich zum PerCP-Vio700-A-Diagramm, und Quadranten werden innerhalb des Diagramms angezeigt.Klicken Sie auf eine beliebige Stelle der Quadrantentrennlinien, und schieben Sie den Cursor, um die Quadrantenplatzierung zu ändern. Platzieren Sie die Quadranten so, dass der obere linke Quadrant Trümmer und der obere rechte Quadrant Kerne enthält. Klicken Sie auf das quadratische, graue I-Symbol, um das Eigenschaftenfenster zu öffnen.Gehen Sie zur Registerkarte Bereichsfunktionen und sorgen Sie für ein grünes Häkchen neben dem obersten Element, das anzeigt, dass das gesamte Diagramm ausgewählt ist. Klicken Sie in der Funktionsliste auf Anzahl pro Mikroliter, um ein grünes Häkchen zu erzeugen. Klicken Sie auf OK, und jeder Quadrant zeigt eine Anzahl pro Mikroliter-Metrik an.Wählen Sie auf der Registerkarte Regionsfunktionen die Option Anzahl und Gesamtprozent aus, um bei Bedarf Rohzählungen und Prozentsätze anzuzeigen. Zeichnen Sie ein polygonales Tor um diese Population, indem Sie auf die Polygonschaltfläche in der Symbolleiste oben links klicken. Klicken Sie dann ein einzelnes Mal und schieben Sie die Maus, um ein lineares Segment des Tors zu zeichnen.Klicken Sie erneut, um den Vorgang abzuschließen und den nächsten zu beginnen, gefolgt von einem Doppelklick, um das Tor zu beenden. Klicken Sie auf den Rand des Tors und schieben Sie die Maus, um das Tor neu zu positionieren. Klicken Sie auf die Scheitelpunkte des Tors, um die Form zu ändern, und die Anzahl pro Mikroliter der Gated Population wird angezeigt.Gesunde Kerne, die als Singulettkerne mit intakten Membranen erschienen sind, eignen sich für die nachgeschaltete Analyse. Ungesunde Kerne zeichnen sich jedoch durch beschädigte Kernmembranen aus, was zu einer Verklumpung der Kerne führt und zu Hintergrundsignalen in nachgeschalteten Anwendungen beitragen kann. Kerne sind in Singulett- und Multipletform im oberen rechten Quadranten, mit Sintagen als unterste Ereigniswolke, gefolgt von Dubletten und Tripletten in aufsteigender Reihenfolge.Trümmer sind durch Ereignisse in den beiden linken Quadranten in einer minderwertigen Kernpräparation gekennzeichnet, bei denen der Schritt zur Entfernung von Trümmern weggelassen wurde. Trümmer machen mehr als 40% der Ereignisse aus. In einem qualitativ hochwertigen Experiment machen Trümmer jedoch weniger als 15% aller Ereignisse aus.Es ist unerlässlich, die mittlere Schicht nach dem Zentrifugationsschritt zur Entfernung von Trümmern vollständig zu entfernen, um die kontaminierende Hintergrund-RNA zu reduzieren Kerne, die mit diesem Protokoll isoliert wurden, können für die Einzelkern-RNA-Sequenzierung oder ATAC-Sequenzierung verwendet werden, um transkriptomische und epigenetische Informationen auf Einzelzellebene zu erhalten. Diese Technik wird es den Forschern ermöglichen, die Genregulation des Gehirns auf Einzelzellebene im afrikanischen türkisfarbenen Killifisch zu erforschen, einem natürlich kurzlebigen Wirbeltiermodellorganismus für die Alternsforschung.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Neuroscience

Neurowissenschaften

Dieses Protokoll beschreibt die Technik, fluoreszenzmarkierte T-Zell-Tumorzellen der akuten lymphatischen Leukämie (T-ALL) aus einem erwachsenen Zebrafisch zu isolieren und sie mit Hilfe des Trypanblau-Farbstoffs zu quantifizieren.

Isolierung fluoreszenzmarkierter T-ALL-Zellen: Eine Methode zur Isolierung von T-ALL-Zellen aus adulten Zebrafischen

Dieses Video beschreibt ein Protokoll zur Isolierung von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafischlarvengehirnen durch mechanische Zerstörung des Gehirngewebes. Die gereinigten Zellpopulationen können weiterhin für die Genomanalyse verwendet werden.

Isolierung von Gehirnzellen aus Zebrafischlarven: Eine Technik zur Gewinnung intakter Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Zebrafisch-Hirngewebe

Um die zellulären und molekularen Mechanismen der Neurogenese und Regeneration adulter Zebrafische zu beleuchten, haben wir ein Protokoll für invasive Operationen entwickelt, die mechanische Verletzungen im adulten Telencephalon des Zebrafisches verursachen, und die anschließende Überwachung von Veränderungen in der gestochenen Hemisphäre durch Immunhistochemie oder in situ Hybridisierung.

Stichwunde Verletzung des Zebrafisch Erwachsene Telen: eine Methode, um Wirbel Gehirn Neurogenese und Regeneration Untersuchen

Hier stellen wir ein reproduzierbares Verfahren adulte Neurogenese zu untersuchen, aus dem gesamten Gehirn stamm eine Neurosphäre Assay verwendet oder von entweder dem telencephalic, tectal oder cerebellar Regionen des adulten Gehirns Zebrabärbling. Zusätzlich beschreiben wir das Verfahren der Genexpression in Zebrabärbling Neurosphären zu manipulieren.

Isolierung und Kultur von Adult Zebrafisch brain-derived Neurosphären

Dieses Protokoll beschreibt die Synthese, Charakterisierung und Injektion von Monomeren Amyloid-β42 Peptide zur Erzeugung von Amyloid Toxizität in Erwachsenen Zebrafisch, eine Alzheimer-Krankheitsmodell, gefolgt von histologische Analyse und Erkennung von Aggregationen.

Modellierung von Amyloid-β42 Toxizität und Neurodegeneration bei Erwachsenen Zebrafisch-Gehirn

Das Hauptziel dieser Studie war die Nadel anpassen Verglasung (NIV) Verfahren um ganze Zebrafisch Hoden Ovarialgewebe eingetaucht. Darüber hinaus wurde die Reproduzierbarkeit der Methode in fünf verschiedenen Zebrafisch-Sorten getestet.

Kryokonservierung von Zebrafisch-Spermatogonien durch ganze Hoden Nadel eingetaucht, ultra-schnelle Abkühlung

Labor-Gehäuse von Türkis, die Killifische unterzubringen und effizient erhöhen Tausende von einzelnen Fische in eine zentralisierte Wasserfilter-System, mit der gleichen Infrastruktur für standard Zebrafisch genutzt skaliert werden kann. Hier zeigen wir eine Liste von standardisierten Verfahren, die effiziente Killifische Wartung ermöglichen.

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

Wir präsentieren Ihnen ein Protokoll um Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirn unter physiologischen und pathologischen Bedingungen zu isolieren. Bei der Isolierung wird dieser Zellen zu analysieren, ihre Genexpressionsprofil RNA entzogen. Dieses Protokoll ermöglicht für die Sammlung von qualitativ hochwertigen RNA nachgelagerte Analyse wie qPCR und Transkriptom durchführen.

Isolation und RNA-Extraktion von Neuronen, Makrophagen und Mikroglia aus Larven Zebrafisch Gehirne

Hier stellen wir ein Protokoll zur einfachen Isolierung bestimmter Gruppen lebender neuronaler Zellen vor, die grünes fluoreszierendes Protein aus transgenen Caenorhabditis elegans-Linien exdrücken. Diese Methode ermöglicht eine Vielzahl von Ex-vivo-Studien, die sich auf bestimmte Neuronen konzentrieren und hat die Fähigkeit, Zellen für eine weitere kurzfristige Kultivierung zu isolieren.

Isolierung spezifischer Neuronenpopulationen von Roundworm Caenorhabditis elegans

Die Isolierung einzelner Kerne beruht auf der Dissoziation und der Waschmittel-basierten Permeabilisierung der Zellmembran, Schritte, die optimiert werden müssen und anfällig für die Einführung technischer Artefakte sind. Wir zeigen ein Waschmittel- und enzymfreies Protokoll zur schnellen Isolierung intakter Kerne direkt aus dem gesamten Gewebe, das Kerne liefert, die für Single-Nucleus RNA-seq (snRNA-Seq) oder ATAC-seq geeignet sind.

Kernisolierung aus ganzem Gewebe mit einer Waschmittel- und enzymfreien Methode

Hier stellen wir eine Methode vor, um das embryonale Gehirn des Zebrafischs in vivo bis hin zu Larven- und Juvenilenstadien abbilden zu können. Dieses mikroinvasive Verfahren, das von elektrophysiologischen Ansätzen adaptiert wurde, bietet Zugang zu zellulären und subzellulären Details reifer Neuronen und kann mit optogenetischen und neuropharmakologischen Studien zur Charakterisierung der Gehirnfunktion und der medikamentösen Intervention kombiniert werden.

In vivo Bildgebung von vollaktivem Hirngewebe bei wachen Zebrafischlarven und Jungtieren durch Schädel- und Hautentfernung

Lernen Sie die schonende Isolierung von Kernen aus dem Gehirn des afrikanischen türkisfarbenen Killifischs für Einzelkern-Sequenzierung. Diese Methode ermöglicht präzise Analysen des zellulären Alterns im Gehirn.

Schonende Isolierung von Kernen aus dem Hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein natürlich kurzlebiges Modell für die Alternsforschung (Video) | JoVE Journal

Schonende Isolierung von Kernen aus dem Hirngewebe erwachsener afrikanischer türkisfarbener Killifische, ein natürlich kurzlebiges Modell für die Alternsforschung

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