Industrialisierte, von künstlicher Intelligenz gesteuerte Laser-Mikrodissektion zur mikroskaligen proteomischen Analyse der Tumormikroumgebung

Dieses Protokoll integriert KI-gesteuerte Bildanalyse für die Gewebesegmentierung. Mit der Histologie selektive Ernte durch Laser-Mikrodissektion und bringt uns der Realität der Pathomics näher. Die Vordefinition des Gewebe-ROI mithilfe von KI begrenzt die Verweilzeit von Gewebeobjektträgern bei Umgebungstemperatur, reduziert den Personalaufwand für die Durchführung dieser Ernten und verringert die Variabilität des Bedieners.

Diese Technik ist allgemein anwendbar auf jede krankheits- oder pathologiebasierte Forschung, die die Sammlung oder Anreicherung spezifischer Zellpopulationen aus Gewebeproben beinhaltet. Diese Methode ist für Benutzer mit grundlegenden histopathologischen Kenntnissen und LMD-Erfahrung unkompliziert. Der Schlüssel ist, sicherzustellen, dass Sie den Kalibrator für die Zellen sauber schneiden und den Klassifikator gut trainieren.

Stellen Sie zunächst sicher, dass der Objektträger vollständig trocken ist, bevor Sie die Referenzkalibrierungsfiducials schneiden. Öffnen Sie die Laser-Mikrodissektionssoftware und öffnen Sie die Standard-Kalibrierungspunkt-SLD-Datei unter der Option Formen importieren. Laden Sie den Objektträger mit dem Gewebe nach unten und der Etikettenseite näher an den Bediener.

Wählen Sie in den Objektträgerhalter auf der Laser-Mikrodissektionsstufe die Option Autofokus vor dem Schneiden. Schneiden Sie mit dem Lasermikroskop und der Standardkalibrierungspunkt-SLD-Datei Kalibrierfiduzierstücke in die PEN-Membran ein. Öffnen Sie die Bildanalysesoftware nur für mit Lasermikrodissektion angereicherte Sammlungen.

Wählen Sie "Bilder öffnen" und wählen Sie im Popup-Fenster die Punkt-SVS-Bilddatei aus, die beim Scannen der Folie generiert wurde. Navigieren Sie zur Registerkarte Anmerkungen, wählen Sie das Rechteckanmerkungswerkzeug aus, und verwenden Sie es, um ein Feld um das Gewebe zu zeichnen. Wählen Sie die Box-Anmerkung aus und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das Bild.

Wählen Sie das erweiterte Dropdown-Menü aus und klicken Sie dann auf die Partitionierungsoption. Legen Sie die Kachelgröße und den Abstand zwischen 500 und 40 fest, und wählen Sie OK aus, um die Kacheln zu generieren. Wählen Sie die Randfeldanmerkung aus, die zum Generieren der Kacheln verwendet wird, und löschen Sie sie.

Wählen Sie das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die gekachelten Anmerkungen als Punktanmerkungsdatei zu speichern. Legen Sie eine gespeicherte Kopie des Python-dapa-Algorithmus ab, der entwickelt wurde, um die klassifizierten AI-Anmerkungsebenen im selben Ordner wie die gekachelte Anmerkungsdatei zusammenzuführen. Kopieren Sie den Namen der gekachelten Anmerkungsdatei.

Öffnen Sie das Python-Programm mit der integrierten Entwicklungsumgebung im Leerlauf und fügen Sie den Namen der gekachelten Anmerkungsdatei zwischen den Zitaten am unteren Rand des Programms ein. Wählen Sie das Dropdown-Menü Ausführen aus, und klicken Sie dann auf Modul ausführen. Warten Sie, bis einige Dateien generiert wurden, in denen alle gekachelten Anmerkungen unter einer einzigen Ebene zusammengeführt werden.

Öffnen Sie die Bildanalysesoftware und navigieren Sie zur Registerkarte Anmerkungen. Wählen Sie das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus und klicken Sie dann auf "Alle Ebenen löschen", um alle Anmerkungen aus dem Bild zu entfernen. Wählen Sie das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus, und klicken Sie dann auf Lokale Anmerkungsdatei importieren.

Wählen Sie im Popup-Fenster die zusammengeführte Punktanmerkungsdatei aus, die vom Skript generiert wurde. Stellen Sie sicher, dass sich alle importierten Kacheln unter derselben Anmerkungsebene befinden. Befolgen Sie auf der Registerkarte Klassifikator die Anweisungen des Herstellers, um repräsentative Bereiche des ROIs für den Tumor-, Stroma- und Rohglas-Objektträgerhintergrund hervorzuheben.

Klicken Sie vor dem Ausführen des Klassifizierers auf Erweiterte Klassifizierungsoptionen, und wählen Sie die gewünschte Anmerkungsebene aus, indem Sie das ROI-Kontrollkästchen oder die Kontrollkästchen auf der Registerkarte Anmerkungen aktivieren. Verwenden Sie die Option Anmerkungsebene aus dem Menü "Klassifikatoraktionen", um den Klassifikator auszuführen. Nachdem die Klassifizierungsanalyse abgeschlossen ist, navigieren Sie zur Registerkarte Anmerkungen, und wählen Sie die aus der Analyse generierte Anmerkungsfolie aus.

Wählen Sie das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus und klicken Sie dann auf Alle Ebenen, aber aktuell, löschen, um alle anderen Anmerkungsebenen aus dem Bild zu entfernen. Wählen Sie als Nächstes das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die Anmerkungen als Punktanmerkungsdatei zu speichern. Erstellen Sie einen Ordner für die Sitzung oder das Projekt, und speichern Sie die Punktanmerkungsdatei in einem Unterordner.

Beschriftet mit dem eindeutigen Bezeichner für die Folie. Navigieren Sie zur Registerkarte Anmerkungen, wählen Sie die Dropdown-Liste Ebenenaktionen aus, und klicken Sie dann auf Alle Ebenen löschen, um alle Anmerkungen aus dem Bild zu entfernen. Wählen Sie das Stiftwerkzeug aus und zeichnen Sie eine kurze Linie von jedem Kalibrierfiducial.

Zeichnen Sie Linien aus den Markierungen in der folgenden Reihenfolge. Oben links, oben rechts, unten rechts. Wählen Sie das Dropdown-Menü Ebenenaktionen aus, und klicken Sie dann auf Exportieren, um die gekachelten Anmerkungen als Do-Annotationsdatei zu speichern.

Fügen Sie dem Dateinamen einen Unterstrich calib hinzu, und legen Sie die Datei in dem Unterordner ab, der die Koordinaten für die gekachelten Formen enthält. Kopieren Sie die Adresse für das Hauptprojekt. Öffnen Sie den XML-Import-Generierungsskript-Malliator mithilfe der integrierten Entwicklungsumgebung im Leerlauf, und fügen Sie dann die Projektordneradresse zwischen die Anführungszeichen am unteren Rand des Skripts ein.

Wählen Sie das Dropdown-Menü Ausführen aus, und klicken Sie dann auf Modul ausführen, um das Skript auszuführen. Laden Sie den markierten Membranträger mit dem Gewebe nach unten und der Etikettenseite näher am Bediener in den Objektträgerhalter auf dem Lasermikroskoptisch. Wählen Sie im Dropdown-Menü Datei die Option Formen importieren aus.

Wählen Sie die für die Folie generierte Punkt-XML, LMD-Importdatei aus. Wählen Sie Nein im Popup-Fenster, um das Laden von Referenzpunkten aus der Datei zu vermeiden, und Nein im zweiten Popup-Fenster, um die Verwendung zuvor gespeicherter Referenzpunkte für die Kalibrierung zu vermeiden. Befolgen Sie die Anweisungen der Laser-Mikrodissektionsanwendung und richten Sie das Kalibrierkreuz an jedem der drei Kalibrierfiduzierer auf dem Objektträger aus.

Suchen Sie nach Kalibrierungsfiducials, die oben links, oben rechts und unten rechts im Folienbild angezeigt werden. In der Bildanalysesoftware entspricht das den Referenzpunkten des inversen Laser-Mikrodissektionsobjektträgers auf der Mikroskopstufe. Wechseln Sie zwischen der Verwendung des 5-fachen subjektiven Objektivs zum Auffinden und des 63-fachen subjektiven Objektivs, um jede Kalibrierungsfiducial auszurichten.

Wählen Sie Nein im Popup-Fenster, um zu vermeiden, dass die Referenzpunkte in der Datei gespeichert werden, und im zweiten Popup-Fenster in Ordnung, um zu bestätigen, dass die Folie eingefügt wurde. Bewegen Sie das 5-fach subjektive Objektiv in Position und wählen Sie im Popup-Fenster Ja, um die tatsächliche Vergrößerung zu verwenden. Sobald die importierten Formen angezeigt werden, fokussieren Sie die Kamera auf das Gewebe.

Markieren und markieren Sie alle Formen im Listenfenster der Formen. Ziehen Sie sie mit einer oder zwei Anmerkungen innerhalb des Sichtfelds als Referenzen an ihren Platz und richten Sie die vertikale z-Achse zum Schneiden mit dem Laser aus. Laden Sie die Rohre in einen universellen Rohrhalter für PCT-Mikroröhrchen.

Überprüfen Sie die importierten Formen, und weisen Sie sie der entsprechenden Rohrposition zum Sammeln zu. Drücken Sie Start Cut, um den Laser zu starten. Entladen und verschließen Sie das Probenröhrchen mit LMD-Gewebe und legen Sie es auf Trockeneis.

Nach dem Thermocycling und der Zentrifugierung entnahm der LMD Gewebeproben, entfernt und entsorgt die Mikrokappen aus den PCT-Mikroröhrchen. Fügen Sie Trypsin hinzu, fügen Sie ein Verhältnis von einem Mikrogramm pro 30 Millimeter quadratischem Gewebe hinzu. Und führen Sie mit dem Microcap-Tool einen Mikrostößel in den Mikroschlauch ein.

Geben Sie die Mikroröhrchen in eine Barrel-Cycle-Patrone und montieren Sie die komplette Patrone. Legen Sie die Kartusche in die Zylinderzyklus-Druckkammer und befestigen Sie den Deckel. Barrel-Zyklus bei 45.000 PSI für 50 Sekunden und atmosphärischer Druck für 10 Sekunden bei 50 Grad Celsius für 60 Zyklen.

Für die LC-MS MS-Analyse laden Sie Auto-Sampler-Fläschchen an den entsprechenden Positionen in den automatischen Probenehmer für Flüssigkeitschromatographie. Schließen Sie den Autosampler und analysieren Sie einzelne Fraktionen mit einer geeigneten Gradienten- und Massenspektrometriemethode. Unüberwachtes hierarchisches Clustering unter Verwendung der 100 variabelsten Proteine.

Führte zur Segregation der hochgradigen serösen Eierstockkrebs- und Ovarialklarzellkarzinom-Histo-Typen aus den Laser-Mikrodissektions- und ganzen Tumorproben. Im Gegensatz dazu reicherte die Laser-Mikrodissektion Stromaproben sowohl von hochgradigem serösem Eierstockkrebs als auch von Ovarialklarzellkarzinomen an. Geclustert und unabhängig von der Laser-Mikrodissektion angereicherte Tumor- und ganze Tumorproben.

Unter den 5.971 quantifizierten Proteinen waren 215 signifikant zwischen ganzen Tumorsammlungen von hochgradigem serösem Eierstockkrebs und ovariellen klarzelligen Karzinomproben verändert. Von den 76 Signaturproteinen, die von Hughes quantifiziert wurden, wurden 57 in diesem Datensatz koquantifiziert und waren stark korreliert Training der Klassifikator ist der schwierigste Teil. Das Befolgen der Anweisungen der Indica Lab-Software und das Verfeinern des Klassifikators reproduzierten die genauesten Ergebnisse.

Alles andere ist standardisiert. Das mit diesem KI-gesteuerten LMD-Workflow entnommene Gewebe ist mit einer Vielzahl von nachgelagerten analytischen Anwendungen kompatibel, einschließlich der hier beschriebenen massenspektrometriebasierten Proteomik oder der Genom-, transkriptomischen oder anderen omischen Analysen.