Name: Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T13:40:00.000+00:00
Duration: 14 min 1 s
Description: Lernen Sie die schnelle Durchflusszytometrie zur Detektion therapieinduzierter Seneszenz in Tumorzellen mit zwei Markern. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung seneszenter Zellen für weitere Analysen.

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Wir danken der Cytometry and Antibody Core Facility der University of Chicago für die Unterstützung bei der Durchflusszytometrie. Das Animal Research Center an der University of Chicago stellte Tierunterkünfte zur Verfügung.

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<li>Flor, A. C., Wolfgeher, D., Wu, D., Kron, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+signature+of+enhanced+lipid+metabolism%2C+lipid+peroxidation+and+aldehyde+stress+in+therapy-induced+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Discovery%22%5BJournal%5D)">A signature of enhanced lipid metabolism, lipid peroxidation and aldehyde stress in therapy-induced senescence.</a> Cell Death Discovery. 3, 17075(2017).</li>
<li>Burd, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+tumorigenesis+and+senescence+in+vivo+with+a+p16%28INK4a%29-luciferase+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Monitoring tumorigenesis and senescence in vivo with a p16(INK4a)-luciferase model.</a> Cell. 152 (1-2), 340-351 (2013).</li>
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<li>González-Gualda, E., Baker, A. G., Fruk, L., Muñoz-Espín, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+assessing+cellular+senescence+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+FEBS+Journal%22%5BJournal%5D)">A guide to assessing cellular senescence in vitro and in vivo.</a> The FEBS Journal. 288 (1), 56-80 (2021).</li>
</ol>

Die Autoren haben für diese Studie keine Interessenkonflikte zu erklären.

In den letzten zehn Jahren hat sich die Durchflusszytometrie aufgrund der zunehmenden Popularität der Tumorimmunologie, der Entwicklung kostengünstigerer Durchflusszytometer und der Verbesserung gemeinsamer Instrumentierungseinrichtungen an akademischen Einrichtungen zu einer immer häufigeren Assay-Plattform in der Krebsforschung entwickelt. Multicolor-Assays sind jetzt Standard, da die meisten neueren Instrumente mit violetten, blau-grünen und roten bis fernroten optischen Arrays ausgestattet sind. Daher ist dieses DDAO...

Seneszente Zellen sammeln sich normalerweise während des normalen biologischen Alterns über Jahre in Organismen an, können sich aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden entwickeln, die durch verschiedene Krebsbehandlungen, einschließlich Bestrahlung und Chemotherapie, verursacht werden. Obwohl sie sich nicht mehr vermehren, können therapieinduzierte seneszente (TIS) Tumorzellen zur Behandlungsresistenz beitragen und ein Rezidiv bewirken 1,2,3. Von TIS-Zellen sezernierte Faktoren können die Tumormalignität verschlimmern, indem sie Immunevasion oder Metastasierung fördern 4,5. TIS-Zellen entwickeln komplexe, kontextspezifische Phänotypen, veränderte Stoffwechselprofile und einzigartige Immunantworten 6,7,8. Daher ist die Identifizierung und Charakterisierung von TIS-Tumorzellen, die durch verschiedene Krebsbehandlungsansätze induziert werden, ein Thema von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft.
Zum Nachweis von TIS-Tumorzellen sind konventionelle Seneszenz-Assays weit verbreitet, die hauptsächlich auf dem Nachweis einer erhöhten Aktivität des Seneszenzmarkerenzyms, der lysosomalen Beta-Galactosidase GLB19, basieren. Der Nachweis bei einem nahezu neutralen (statt sauren) lysosomalen pH-Wert ermöglicht den spezifischen Nachweis von Seneszenz-assoziierter Beta-Galactosidase (SA-β-Gal)10. Ein seit mehreren Jahrzehnten verwendeter Standard-SA-β-Gal-Assay verwendet X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galactopyranosid), ein blau-chromogenes Beta-Galactosidase-Substrat, um SA-β-Gal in fixierten Zellen lichtmikroskopischnachzuweisen11. Der X-Gal-Assay ermöglicht die qualitative visuelle Bestätigung von TIS unter Verwendung handelsüblicher Reagenzien und Laborgeräte. Ein einfaches Durchlichtmikroskop ist das einzige Instrument, das erforderlich ist, um das Vorhandensein des blauen Chromogens zu bewerten. Das X-Gal-Färbeverfahren kann jedoch nicht empfindlich sein und manchmal mehr als 24 Stunden dauern, bis sich die Farbe entwickelt. Auf die Färbung folgt eine subjektive Bewertung einzelner seneszenter Zellen mit niedrigem Durchsatz, basierend auf der Zählung der Zellen, die eine gewisse Intensität des blauen Chromogens unter einem Lichtmikroskop aufweisen. Da X-Gal zellundurchlässig ist, erfordert dieser Assay lösungsmittelfixierte Zellen, die für die nachgeschaltete Analyse nicht gewonnen werden können. Bei der Arbeit mit begrenzten Proben von Tieren oder Patienten kann dies ein großer Nachteil sein.
Verbesserte SA-β-Gal-Assays unter Verwendung zellpermeanter, fluoreszierender Enzymsubstrate, einschließlich C 12-FDG (5-Dodecanoylaminofluorescein Di-β-D-Galactopyranosid, grün) und DDAOG (9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on-7-yl) β-D-Galactopyranosid, weit rot) sind bereits in der Literaturerschienen 12,13,14,15. Die chemische Sondenstruktur und die optischen Eigenschaften von DDAOG sind in der ergänzenden Abbildung S1 dargestellt. Diese zellpermeierten Sonden ermöglichen die Analyse lebender (und nicht fixierter) Zellen, und fluoreszierende statt chromogene Sonden erleichtern die Verwendung von schnellen Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich High-Content-Screening-Instrumenten und Durchflusszytometern. Sortierdurchflusszytometer ermöglichen die Gewinnung angereicherter Populationen lebender alternder Zellen aus Zellkulturen oder Tumoren für die nachgeschaltete Analyse (z. B. Western Blotting, ELISA oder Omics). Die Fluoreszenzanalyse liefert auch ein quantitatives Signal, das eine genauere Bestimmung des Prozentsatzes der alternden Zellen innerhalb einer bestimmten Probe ermöglicht. Zusätzliche Fluoreszenzsonden, einschließlich Viabilitätssonden und fluorophormarkierter Antikörper, können problemlos für die Multiplexanalyse von Zielen jenseits von SA-β-Gal hinzugefügt werden.
Ähnlich wie DDAOG ist C12-FDG eine Fluoreszenzsonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit intrinsischem zellulärem AF, der während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten in Zellen16 entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten DDAOG-Sonde kann grüner zellulärer AF als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenzverwendet werden 17. Dies verbessert die Assay-Zuverlässigkeit durch die Verwendung eines zweiten Markers zusätzlich zu SA-β-Gal, der oft als einzelner Marker für die Seneszenz18 unzuverlässig sein kann. Da der Nachweis von endogenem Vorhofflimmern in seneszenten Zellen ein markierungsfreier Ansatz ist, ist es eine schnelle und einfache Möglichkeit, die Spezifität unseres DDAOG-basierten Assays zu erweitern.
In diesem Protokoll demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und AF als schnellen Dual-Parameter-Durchflusszytometrie-Assay zur Identifizierung lebensfähiger TIS-Tumorzellen aus In-vitro-Kulturen oder isoliert aus medikamentös behandelten Tumoren, die in Mäusen etabliert wurden (Abbildung 1). Das Protokoll verwendet Fluorophore, die mit einer Vielzahl von handelsüblichen Durchflusszytometrie-Analysatoren und -Sortierern kompatibel sind (Tabelle 1). Die Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen mittels Standard-Durchflusszytometrie-Analyse ist möglich. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt durchgeführt werden, um die interessierenden Zelloberflächenantigene gleichzeitig mit der Seneszenz zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch mit der Standard-Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS) angereichert werden.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64176/64176fig01.jpg"> Abbildung 1: Experimenteller Workflow. Eine schematische Zusammenfassung der wichtigsten Punkte des DDAOG-Assays. (A) Ein TIS-induzierendes Medikament wird Säugetierkulturzellen zugesetzt oder tumortragenden Mäusen verabreicht. Zeit ist dann für den Beginn der TIS vorgesehen: für Zellen, 4 Tage nach der Behandlung; für Mäuse, insgesamt 22 Tage, mit drei Behandlungen alle 5 Tage plus 7 Tage Erholung. Zellen werden geerntet oder Tumore in Suspension dissoziiert. (B) Die Proben werden mit Baf behandelt, um den lysosomalen pH-Wert für den Nachweis von SA-β-Gal für 30 min einzustellen; dann wird eine DDAOG-Sonde für 60 min hinzugefügt, um SA-β-Gal zu erkennen. Die Proben werden 2x in PBS gewaschen und kurz ein Lebensfähigkeitsfleck hinzugefügt (15 min). Optional können Proben in offenen Fluoreszenzkanälen mit fluoreszierenden Antikörpern angefärbt und/oder für eine spätere Analyse fixiert werden. (C) Die Proben werden mit einem Standard-Durchflusszytometer analysiert. Lebensfähige Zellen werden in Punktdiagrammen visualisiert, die rotes DDAOG (was SA-β-Gal anzeigt) versus grüne Autofluoreszenz (Lipofuszin) zeigen. Ein Gate zur Bestimmung des Prozentsatzes der TIS-Zellen wird basierend auf unbehandelten Kontrollproben (nicht gezeigt) erstellt. Wenn ein Sortierzytometer (FACS) verwendet wird, können TIS-Zellen gesammelt und für weitere In-vitro-Assays wieder in Kultur gebracht oder für molekularbiologische Assays lysiert und verarbeitet werden. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; TIS = therapieinduzierte Seneszenz; FL-Ab = fluorophorkonjugierter Antikörper; Baf = Bafilomycin A1; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase; PBS = phosphatgepufferte Kochsalzlösung; FACS = fluoreszenzaktivierte Zellsortierung. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64176/64176fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>Fluorophor</td>
			<td>Erkennt</td>
			<td>Ex/Em (nm)</td>
			<td>Zytometerlaser (nm)</td>
			<td>Zytometerdetektor / Bandpassfilter (nm)</td>
		</tr><tr><td>DDAOG</td>
			<td>SA-β-Gal</td>
			<td>645/6601</td>
			<td>640</td>
			<td>670 / 30</td>
		</tr><tr><td>AF</td>
			<td>Lipofuszin</td>
			<td>&lt; 600</td>
			<td>488</td>
			<td>525 / 50</td>
		</tr><tr><td>CV450</td>
			<td>Lebensfähigkeit</td>
			<td>408/450</td>
			<td>405</td>
			<td>450 / 50</td>
		</tr><tr><td>PE</td>
			<td>Antikörper/Oberflächenmarker</td>
			<td>565/578</td>
			<td>561</td>
			<td>582 / 15</td>
		</tr></tbody></table>Tabelle 1: Optische Spezifikationen für Fluorophore und Zytometer. Die in diesem Protokoll verwendeten Zytometerspezifikationen sind für ein Gerät mit insgesamt 4 Lasern und 15 Emissionsdetektoren aufgeführt. DDAOG, das bei 645/660 nm nachgewiesen wird, ist die Form der Sonde, die von SA-β-Gal1 gespalten wurde. Unspaltetes DDAOG kann bei 460/610 nm eine geringe Fluoreszenz aufweisen, wird aber durch Waschschritte im Protokoll entfernt. Abkürzungen: DDAO = 9H-(1,3-Dichlor-9,9-dimethylacridin-2-on); DDAOG = DDAO-Galactosid; AF = Autofluoreszenz; PE = Phycoerythrin; SA-β-Gal = Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase.

<table><tbody><tr><td>Bafilomycin A1</td><td>Research Products International</td><td>B40500</td><td></td></tr><tr><td>Bleomycinsulfat</td><td>Cayman</td><td>13877</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA)</td><td>US Biological</td><td>A1380</td><td></td></tr><tr><td>Calcein Violet 450 AM Viabilitätsfarbstoff</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>65-0854-39</td><td>eBioscience</td></tr><tr><td>DPP4 Antikörper, PE-Konjugat</td><td>Biolegend</td><td>137803</td><td>Klon H194-112</td></tr><tr><td>Zelllinie: A549 menschliches Lungenadenokarzinom</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Zelllinie: B16-F10 Mausmelanom</td><td>American Type Culture Collection</td><td>CRL-6475</td><td></td></tr><tr><td>Zellschaber</td><td>Corning</td><td>3008</td><td></td></tr><tr><td>Zellsiebe, 100 & Mikro; m</td><td>Falcon</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>DDAO-Galactosid</td><td>Life Technologies</td><td>D6488</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Medium 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11960-069</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Sigma</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin, Hydrochlorid-Injektion (USP)</td><td>Pfizer</td><td>NDC 0069-3032-20</td><td></td></tr><tr><td>Doxorubicin, PEGyliertes liposomales (USP)</td><td>Sun Pharmaceutical</td><td>NDC 47335-049-40</td><td></td></tr><tr><td>EDTA 0,5 M</td><td>Life Technologies</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Etoposid&nbsp;</td><td>Cayman</td><td>12092</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Omega&nbsp;</td><td>FB-11</td><td></td></tr><tr><td>Fc-Rezeptor-Blockierungsreagenz</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>Anti-Maus CD16/32</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer (Zellanalysator)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Verschiedenes</td><td>LSRFortessa</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer (Zellsortierer)</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>Verschiedenes</td><td>FACSAria</td></tr><tr><td>GlutaMax 100x</td><td>Life Technologies</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Lonza</td><td>BW17737</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL</td><td>Sigma</td><td>5401020001</td><td>Roche</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 16%</td><td>Elektronenmikroskopie</td><td>Sciences 15710</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin 100x</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 1x</td><td>Corning</td><td>MT21031CV</td><td>Dulbecco's PBS (ohne Calcium und Magnesium)</td></tr><tr><td>Regenbogen-Kalibrierpartikel, Ultra-Kit</td><td>SpheroTech</td><td>UCRP-38-2K</td><td>3.5-3.9 &micro; m, 2E6/mL</td></tr><tr><td>RPMI-1640 mittel 1x</td><td>Life Technologies</td><td>11875-119</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid 0,9% (USP)</td><td>Baxter Healthcare Corporation</td><td>2B1324</td><td></td></tr><tr><td>Software zur Erfassung von Zytometerdaten, "FACSDiva"</td><td>Becton Dickinson (BD)</td><td>n/a</td><td>Kontaktieren Sie BD für Lizenz</td></tr><tr><td>Software zur Analyse von Zytometerdaten, "FlowJo"</td><td>TreeStar</td><td>n/a</td><td>Kontaktieren Sie TreeStar für die Lizenz</td></tr>: <tr><td>Trypsin-EDTA 0.25%</td><td>Life Technologies</td><td>25200-114</td><td></td></tr></tbody></table>

far-red fluoreszenz-seneszenz-assoziierte β-galactosidase-sonde zur identifizierung und anreicherung von seneszenten tumorzellen mittels durchflusszytometrie

Far-Red Fluorescent Senescence-Associated &#946;-Galactosidase Probe for Identification and Enrichment of Senescent Tumor Cells by Flow Cytometry

Zelluläre Seneszenz ist ein Zustand des proliferativen Stillstands, der durch biologische Schäden induziert wird, der normalerweise über Jahre in alternden Zellen entsteht, aber auch schnell in Tumorzellen als Reaktion auf Schäden auftreten kann, die durch verschiedene Krebsbehandlungen induziert werden. Die Seneszenz von Tumorzellen wird im Allgemeinen als unerwünscht angesehen, da alternde Zellen gegen den Tod resistent werden und die Tumorremission blockieren, während sie die Tumormalignität und die Behandlungsresistenz verschlimmern. Daher ist die Identifizierung von seneszenten Tumorzellen von anhaltendem Interesse für die Krebsforschungsgemeinschaft. Es gibt verschiedene Seneszenzassays, von denen viele auf der Aktivität des bekannten Seneszenzmarkers basieren, der Seneszenz-assoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-Gal). 
Typischerweise wird der SA-β-Gal-Assay unter Verwendung eines chromogenen Substrats (X-Gal) an festen Zellen durchgeführt, wobei die langsame und subjektive Zählung von "blauen" alternden Zellen durch Lichtmikroskopie durchgeführt wird. Verbesserte Assays mit zellpermeanten, fluoreszierenden SA-β-Gal-Substraten, einschließlich C12-FDG (grün) und DDAO-Galactosid (DDAOG; weit rot), haben die Analyse lebender Zellen ermöglicht und die Verwendung von Hochdurchsatz-Fluoreszenzanalyseplattformen, einschließlich Durchflusszytometern, ermöglicht. C12-FDG ist eine gut dokumentierte Sonde für SA-β-Gal, aber ihre grün fluoreszierende Emission überlappt sich mit der intrinsischen zellulären Autofluoreszenz (AF), die während der Seneszenz aufgrund der Akkumulation von Lipofuszin-Aggregaten entsteht. Durch die Verwendung der tiefroten SA-β-Gal-Sonde DDAOG kann die grünzelluläre Autofluoreszenz als sekundärer Parameter zur Bestätigung der Seneszenz verwendet werden, was die Zuverlässigkeit des Assays erhöht. Die verbleibenden Fluoreszenzkanäle können für die Färbung der Zelllebensfähigkeit oder die optionale fluoreszierende Immunmarkierung verwendet werden.
Mit Hilfe der Durchflusszytometrie demonstrieren wir die Verwendung von DDAOG und Lipofuszin-Autofluoreszenz als Dual-Parameter-Assay zur Identifizierung von seneszenten Tumorzellen. Es wird eine Quantifizierung des Prozentsatzes lebensfähiger seneszenter Zellen durchgeführt. Falls gewünscht, kann ein optionaler Immunmarkierungsschritt enthalten sein, um die interessierenden Antigene der Zelloberfläche zu bewerten. Identifizierte seneszente Zellen können auch flusszytometrisch sortiert und für die nachgeschaltete Analyse gesammelt werden. Gesammelte seneszente Zellen können sofort lysiert (z. B. für Immunoassays oder Omics-Analysen) oder weiter kultiviert werden.

Mehrere Experimente wurden durchgeführt, um die Vergleichbarkeit von DDAOG mit X-Gal und C12-FDG für den Nachweis der Seneszenz durch SA-β-Gal zu demonstrieren. Zunächst wurde X-Gal verwendet, um seneszente B16-F10-Melanomzellen zu färben, die durch ETO induziert wurden (Abbildung 2A). Eine intensive blaue Farbe entwickelte sich in einer Untergruppe von ETO-behandelten Zellen, während andere Zellen eine weniger intensive blaue Färbung aufwiesen. Die Morphologie war in den meisten ...

Ein Protokoll zur fluoreszierenden, durchflusszytometrischen Quantifizierung von seneszenten Krebszellen, die durch Chemotherapeutika in Zellkultur oder in murinen Tumormodellen induziert werden, wird vorgestellt. Optionale Verfahren umfassen die Co-Immunfärbung, die Probenfixierung zur Erleichterung der Analyse großer Chargen oder Zeitpunkte sowie die Anreicherung lebensfähiger seneszenter Zellen durch durchflusszytometrische Sortierung.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

Cellular senescence is a state of proliferative arrest induced by biological damage that normally accrues over years in aging cells but may also emerge ...

Unser Multiparameter-Durchflusszytometrie-Protokoll ermöglicht einen schnellen und verbesserten Nachweis der therapieinduzierten Seneszenz in Tumorzellen, die eine Bedingung für laufende Studien in der Krebsbiologie und -therapie ist. Unser Durchflusszytometrie-Seneszenz-Assay ist schneller als bestehende mikroskopiebasierte Assays. Wir verwenden zwei Marker anstelle von nur einem, um alternde Zellen zu identifizieren und die Zuverlässigkeit des Assays zu verbessern.Zellen können mit fluoreszierenden Antikörpern co-gefärbt werden, um zusätzliche Ziele von Interesse zu erkennen. Die Durchflusszytometrie-Sortierung kann verwendet werden, um Populationen von seneszenten Zellen für die nachgeschaltete Analyse anzureichern. Der Assay kann alternde Zellen in kultivierten Krebszelllinien oder in ganzen Tumorproben nach sanfter Dissoziation nachweisen.Bevor Sie diese Technik ausprobieren, ist es wichtig, mit den allgemeinen Betriebsabläufen des verwendeten Durchflusszytometers vertraut zu sein. Bitte konsultieren Sie den Text für empfohlene Durchflusszytometer-Spezifikationen. Einen Tag vor der Seneszenzinduktion durch Medikamente ernten Sie die Krebszelllinienkultur mit 0,25% Trypsin EDTA.Platzieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius, um Trypsin zu aktivieren, und lösen Sie die Zellmonoschicht. Wenn sich die Monoschicht sichtbar gelöst hat, neutralisieren Sie Trypsin, indem Sie ein gleiches Volumen des vollständigen Kulturmediums hinzufügen. Die Zellsuspension wird in ein steriles konisches Röhrchen überführt.Zählen Sie die Zellen mit der Standard-Hämozytometermethode und zeichnen Sie die Zellen pro Milliliter auf. Plattenzellen einmal 10 bis 10 mal 10 bis dritte Zellen pro Quadratzentimeter in einer Standard-Sechs-Well-Kunststoffkulturplatte. Die Platte über Nacht bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid und Feuchtigkeit inkubieren.Am nächsten Tag behandeln Sie die Zellen mit dem Seneszenz-induzierenden Mittel von Interesse, wie Etoposid. Dann für vier Tage inkubieren, um den Beginn der Seneszenz zu ermöglichen. Untersuchen Sie die Zellen täglich unter einem Lichtmikroskop auf erwartete morphologische Veränderungen.Nach Beginn der Seneszenz ernten Sie die Zellen durch Zugabe von Trypsin EDTA für fünf Minuten bei 37 Grad Celsius. Wenn die Zellen in Suspension dissoziiert sind, neutralisieren Sie Trypsin mit einem gleichen Volumen des vollständigen Mediums. Jede Vertiefung der Zellsuspension wird in ein 1,7-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt.Zählen Sie die Zellen erneut und aliquot eine gleiche Anzahl von Zellen pro Probe in einen neuen Satz Röhrchen. Die Röhrchen fünf Minuten lang bei 1.000 g bei vier Grad Celsius zentrifugieren und den Überstand entfernen. Zuerst wird der lysosomale pH-Wert kultivierter Zellproben eingestellt, indem eine Lösung von einem mikromolaren Bafilomycin A in DMEM in einer Konzentration von einmal 10 bis sechster Zellen pro Milliliter zum Zellpellet gegeben und zum Mischen pipettiert wird.30 Minuten bei 37 Grad Celsius auf einem Rotator mit langsamer Geschwindigkeit inkubieren. Um dann für Seneszenz-assoziierte Beta-Galactosidase zu färben, geben Sie DDAOG Stammlösung mit 10 Mikrogramm pro Milliliter zu den Proben ohne Waschen. Für 60 Minuten vor direktem Licht geschützt auf einen Rotator stellen.Wie zuvor zentrifugieren Sie die Röhrchen, entfernen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet mit einem Milliliter eiskaltem 0,5% BSA in PBS. Dann fügen Sie 300 Mikroliter verdünnte Calcein Violet 450 AM Lösung zu den gewaschenen Zellpellets hinzu. 15 Minuten auf Eis im Dunkeln inkubieren.Die Zellproben werden in durchflusszytometrische Instrumenten-kompatible Röhrchen überführt. Öffnen Sie in der Datenerfassungssoftware ein Violettkanalhistogramm und ein Punktdiagramm für einen weit roten Kanal im Vergleich zu einem grünen Kanal. Starten Sie die Zytometerdatenerfassung bei niedriger Aufnahmegeschwindigkeit und legen Sie die mit DDAOG gefärbten positiven Kontrollproben auf die Ansaugöffnung.Beginnen Sie mit der Erfassung von Beispieldaten. Passen Sie die Kanalspannungen so an, dass mehr als 90% der Ereignisse in jedem Diagramm enthalten sind. Wenn alle Einstellungen optimal sind, zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Stichprobe auf.Legen Sie die mit DDAOG befleckten Fahrzeugkontrollproben auf die Ansaugöffnung. Starten Sie die Datenerfassung und zeichnen Sie 10.000 Ereignisse pro Stichprobe auf. Suchen Sie nach einem Anstieg der Autofluoreszenz oder AF und des DDAO-Galactosid-Signals im Vergleich zur Positivkontrolle.Speichern Sie die Probendaten im fcs-Dateiformat und exportieren Sie die Dateien auf einen Arbeitsplatzrechner, der mit einer Durchflusszytometrie-Analysesoftware ausgestattet ist. Laden Sie mithilfe der Zytometrie-Datenanalysesoftware die FCS-Datendateien für alle erfassten Proben. Um lebensfähige Zellen zu gattern, doppelklicken Sie zunächst auf die Beispieldaten für die reine Fahrzeugsteuerung, um ihr Datenfenster zu öffnen.Visualisieren Sie die Daten als Violettkanalhistogramm. Die lebensfähigen Zellen, die mit CV 450 gefärbt wurden, basieren auf ihrer helleren Fluoreszenz als die toten Zellen. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Einzeltorhistogramm-Werkzeug, um nur lebensfähige Zellen einzuschließen.Nennen Sie das Tor Viable. Ziehen Sie dann das Viable Gate aus dem Probenlayoutfenster auf die anderen Zellproben, um das Gate gleichmäßig anzuwenden. Öffnen Sie das Fenster Layout.Visualisieren Sie im Fenster Layout alle Samples als Violettkanalhistogramme. Stellen Sie sicher, dass Viable Cell Gating für alle Proben geeignet ist. Wenn nicht, passen Sie es nach Bedarf an.Um alternde Zellen zu gattern, doppelklicken Sie auf die Gated Viable Cell-Daten, damit die Nur-Fahrzeug-Steuerung ihr Datenfenster öffnet. Visualisieren Sie dann die Daten als Punktdiagramm für den fernroten Kanal im Vergleich zum grünen Kanal. Zeichnen Sie ein Tor mit dem Rechteck-Gating-Werkzeug, um weniger als 5 % der DDAO-positiven und AF-positiven Zellen aus dem oberen rechten Quadranten einzubeziehen.Visualisieren Sie alle lebensfähigen Proben als Far-Rot- versus Grünkanal-Punktdiagramme und beobachten Sie die Ergebnisse. Stellen Sie sicher, dass das Seneszenz-Gate auf allen Parzellen sichtbar ist und dass das Gate für die reinen Fahrzeugkontrollen weniger als 5% seneszente Zellen aufweist. Die Analyse ist nun abgeschlossen.Daten können nun beliebig in Grafik- und Tabellenform exportiert werden. Im Vergleich zu unbehandelten Zellen zeigten seneszente B16-F10-Melanomzellen, die durch Etoposid induziert wurden, eine vergrößerte Morphologie und blaue Färbung aufgrund der Spaltung von X-gal durch erhöhte Seneszenz-assoziierte Beta-Galaktosidase. Die Färbung von mit Etoposid behandelten Zellen mit fluoreszierendem C12FDG oder DDAOG zeigte vergleichbare Färbemuster und Intensitätsvariationen wie X-gal.Es wurde jedoch gezeigt, dass sich zelluläre Autofluoreszenz, die sich mit grüner C12FDG-Emission überlappt, in nicht gefärbten alternden Zellen ansammelt. Im Gegensatz dazu war die Autofluoreszenz im fernroten Emissionsbereich von DDAOG typischerweise vernachlässigbar. Der Aufbau von Durchflusszytometer-Datenerfassungen für Streudiagramme, kommerzielle Fünf-Peak-Regenbogenfluoreszenz-Kalibrierungsmikrosphären und Einkanal-Fluoreszenzdaten von gefärbten Zellen werden hier gezeigt.DDAOG-Durchflusszytometer-Seneszenz-Assay-Daten für B16-F10-Melanomzellen zeigten, dass therapieinduzierte Seneszenz (TIS), induziert durch Etoposid, in 35% der lebensfähigen Zellen auftrat und das senolytische Mittel ABT-263 TIS-Zellen fast eliminierte. In A549-Lungenkrebszellen reduzierte Bleomycin-induziertes TIS in 66% der lebensfähigen Zellen und ABT-263 den Prozentsatz auf 15. ABT-263 allein war für unbehandelte proliferierende Zellen nicht toxisch.In einem Antikörper-Co-Färbe-Assay zeigte ein Histogramm der PE-Kanaldaten, dass 42% der mit Etoposid behandelten Zellen positiv für den Seneszenzmarker DPPP4-positiv waren. Darüber hinaus zeigte die Visualisierung mit zweidimensionalen Punktdiagrammen, dass 44% der mit Etoposid behandelten Zellen doppelt positiv für DDAOG und DPP4 waren, verglichen mit 4% der reinen Vehikelzellen. Als nächstes wurde die Fixierung von DDAOG gefärbten Zellen untersucht.Im Vergleich zu unfixierten Kontrollproben zeigten fixierte Proben einen etwas höheren Hintergrund in unbehandelten Zellen mit einem höheren Prozentsatz von Zellen, die in BLM-behandelten Zellen als seneszent bewertet wurden. Dieser Effekt wurde auch in festen Proben beobachtet, die über Nacht und eine Woche lang bei vier Grad Celsius gelagert wurden. Durchflusszytometrische Sortierung und Validierung von angereicherten seneszenten Zellpopulationen durch Morphologie und Proliferationsmarker werden gezeigt.Sortierte seneszente Zellen zeigten wie erwartet eine vergrößerte Morphologie, visualisiert durch Färbung von Aktin mit fluoreszierendem Phalloidin. Eine Verringerung des Signals für den Proliferationsmarker Ki67 wurde auch durch Immunfluoreszenzfärbung beobachtet. Schließlich wurde die Quantifizierung der Seneszenz bei Tumoren, die mit Chemotherapeutika behandelt wurden, bewertet.Die X-gal-Färbung in Geweben war relativ schwach, aber die blaue Färbung zeigte sich bei Tumoren, die mit Doxorubicin oder pegyliertem liposomalem Doxorubicin behandelt wurden, insbesondere bei Tumoren, die auch durch DDAO-Galactosid-Flow-Assay positiv für die Seneszenz bewertet wurden. Wie erwartet, zeigten reine Kochsalzlösungstumoren eine vernachlässigbare Seneszenz. Hier sollten, wie bei jedem Lebendzelltest, die Protokollschritte effizient, aber schonend durchgeführt werden.Längere Färbevorgänge oder Inkubationen über die genannten Zeiten hinaus sollten vermieden werden. Wenn seneszente Zellen durchflusszytometrisch sortiert werden, können sie für Immunoassays wieder in Kultur gebracht oder lysiert und für die Omics-Analyse, einschließlich Transkriptomik oder Proteomik, verarbeitet werden. Diese Technik hat es unserem Labor und anderen ermöglicht, neue Merkmale von alternden Tumorzellen zu identifizieren, einschließlich der Quantifizierung von DNA-Schäden, Proteinexpression und Veränderungen im Stoffwechsel.

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Forschung

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Cancer Research

Krebsforschung

Dieses Video zeigt einen auf Durchflusszytometrie basierenden Assay zur Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen mit dualen Seneszenzmarkern. Der Nachweis und die Quantifizierung seneszenter Zellen erfolgt unter Verwendung eines β-Galactosidase-Substrats. Das Substrat wird durch aktive lysosomale β-Galactosidase innerhalb der seneszenten Zellen gespalten, wodurch ein fluoreszierendes Produkt entsteht, das in Verbindung mit autofluoreszierenden Lipofuszin-Granulaten die...

Durchflusszytometrie-basierte Quantifizierung von therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Ob Seneszenz verhindert oder fördert Tumorentstehung bleibt umstritten. Da Chemotherapeutika Krebszellen veranlassen können, altern, Studium Seneszenz ist für Vorschläge für neue Therapien unerlässlich. Allerdings stellt die Standard-und im Großen und Ganzen verwendet β-Galactosidase Assay große Nachteile. Wir schlagen hier eine schnelle und empfindliche Durchflusszytometrie-basierte Assays zur Quantifizierung Seneszenz.

Eine empfindliche Methode zur Quantifizierung Seneszente Cancer Cells

Intrazellulären ROS hat nachweislich eine wichtige Rolle in der Induktion der zellulären Seneszenz. Hier beschreiben wir einen sensible Assay zur Quantifizierung der ROS Ebenen während der zellulären Seneszenz. Wir bieten auch Protokolle für die Beurteilung des Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyps, was angeblich zu verschiedenen altersbedingte Funktionsstörungen beiträgt.

Eine Quantitative Messung von reaktiven Sauerstoffspezies und Seneszenz-assoziierten sekretorischen Phänotyp in normalen menschlichen Fibroblasten während Onkogen-induzierte Seneszenz

Zelluläre Seneszenz ist der Schlüsselfaktor bei der Entwicklung chronischer altersbedingter Pathologien. Die Identifizierung von Therapeutika, die auf seneszente Zellen abzielen, verspricht, eine gesunde Alterung zu verlängern. Hier präsentieren wir einen neuartigen Test zur Identifizierung von Senotherapeutika auf der Grundlage der Messung der seneszenzassoziierten Galactosidase-Aktivität in Einzelzellen.

SA--Galactosidase-basierter Screening-Test zur Identifizierung von Senotherapeutischen Arzneimitteln

Hier stellen wir eine auf Durchflusszytometrie basierende Methode zur Visualisierung und Quantifizierung mehrerer seneszenzassoziierter Marker in einzelnen Zellen vor.

Simultane Bildgebung und Durchflusszytometrie-basierte Detektion mehrerer fluoreszierender Seneszenzmarker in therapieinduzierten seneszenten Krebszellen

Dieses Protokoll bietet eine reflektierte-licht-konfokale Mikroskopie zur objektiven, einzelzelligen Detektion der seneszenzassoziierten Beta-Galactosidase (SA-β-gal) Aktivität in der stromalen Gefäßfraktion, die aus menschlichem Fettgewebe isoliert ist. Die Methode ist mit der Immunzytochemie kompatibel, beinhaltet pH-Kontrollen zur quantitativen Beurteilung und bietet zudem eine sensiblere und weniger subjektive Alternative zur herkömmlichen SA-β-gal-Färbung.

Seneszenzdetektion mit reflektiertem Licht in der fettreichen stromalen Gefäßfraktion

Dieser Artikel stellt ein lebendzelliges LysoTracker-Protokoll zur Messung der lysosomalen Remodellierung während der Seneszenz in humanen Fibroblasten von IMR-90 vor.

Lysosomales Profiling mit LysoTracker zur quantitativen Bewertung der zellulären Seneszenz bei humanen Fibroblasten

Eine effizientes Screening-Protokoll wird für die Identifikation von kleinen Molekülen präsentiert, die Astroglial Differenzierung in Glioblastom Stammzellen (vorliegenden Allgemeinen Geschäftsbedingungen) zu fördern. Der Test basiert auf Stammzell-Differenzierung Reporter, wobei der Ausdruck der verbesserte GFP (eGFP) durch den menschlichen GFAP Projektträger angetrieben wird.

Flow Cytometry-based Drug Screening-System für die Identifizierung von kleinen Molekülen, die zelluläre Differenzierung von Stammzellen Glioblastom zu fördern

Dieses Protokoll ist zu erholen und molekulare genetische Charakterisierung der Ebene der einzelligen seltene Zielzellen aus einer Mischung mit Nichtziel-hintergrundzellen vorbereiten. DNA-Qualität entspricht nicht behandelten Einzelzellen und einzellige Anwendung (sowohl Screening basiert und gezielte Analyse) ermöglicht.

Ziel Zelle Voranreicherung und ganze Genome Amplifikation für einzelne Zelle nachgelagerten Charakterisierung

Die Versuchsdurchführung auf die Immunphänotypisierung der murinen orthotopen PDAC Homografts bezweckt die Profilierung der Tumor Immuno-Mikroumgebung. Tumoren sind Orthotopically über Operation implantiert. Tumoren von 200 – 600 mm3 in der Größe wurden geerntet und distanzierte um einzellige Suspensionen, gefolgt von Multi-immun FACS Markeranalyse mit verschiedenen fluoreszent-markierten Antikörpern vorzubereiten.

Die Immunphänotypisierung der Orthotopen Homograft (Phänomen) der murinen primäre KPC duktales Pankreaskarzinom durch Durchflusszytometrie

Lernen Sie die schnelle Durchflusszytometrie zur Detektion therapieinduzierter Seneszenz in Tumorzellen mit zwei Markern. Diese Methode ermöglicht die Anreicherung seneszenter Zellen für weitere Analysen.

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie (Video) | JoVE Journal

Far-Red Fluoreszenz-Seneszenz-assoziierte β-Galactosidase-Sonde zur Identifizierung und Anreicherung von seneszenten Tumorzellen mittels Durchflusszytometrie

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