Protokolle für CRISPR/Cas9-Mutagenese der Orientalischen Fruchtfliege Bactrocera dorsalis

Die orientalische Fruchtfliege ist eine hochinvasive und anpassungsfähige Schädlingsart. Effektive Methoden der funktionellen Genforschung könnten uns helfen, umweltfreundliche Strategien zur Schädlingsbekämpfung zu entwickeln. Diese Methode ist hocheffizient und kostengünstig.

Unser Protokoll wird als nützlicher Leitfaden für die Erzeugung mutierter Fliegen für orientalische Fruchtfliegenforscher dienen. Zunächst können Sie die Struktur der interessierenden Zielgene vorhersagen und die Grenzen zwischen Exons und Introns durch bioinformatische Analyse des Bactroceras dorsalis-Genoms bestimmen. Verwenden Sie das kommerziell erhältliche gRNA-Synthesekit, um die entworfene sgRNA zu erzeugen.

Resuspendieren Sie das gRNA-Produkt in nukleasefreiem Wasser. Quantifizieren Sie die Konzentration mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer und lagern Sie sie vor Gebrauch bei 80 Grad Celsius. Setzen Sie B.dorsalis pupae in einen Plastikkäfig mit einem Aufzuchtzustand von 55% relativer Luftfeuchtigkeit, 26,5 Grad Celsius und einem Licht-Tag-Zyklus von 14:10.

Wenn die Erwachsenen sich schließen, stellen Sie eine Mischung aus Zucker und Hefe als Nahrung zusammen mit Wasser zur Verfügung. Die meisten Erwachsenen erreichen die Geschlechtsreife 10 Tage nach dem Auftauchen. Verwenden Sie einen Lichtständer mit einem Licht von 30 bis 50 Lux, um die Fruchtbarkeit der Weibchen zu verbessern und somit die Effizienz der Embryonensammlung zu verbessern.

Als nächstes legen Sie eine 200-Mesh-Gaze in die Eiablagekammer, etwa 1 bis 2 Millimeter vom Kammerdeckel entfernt. Stellen Sie eine neue Eiablagekammer in den Käfig, wenn der Mikroinjektionsaufbau fertig ist. Sammeln Sie die Embryonen alle 10 Minuten mit einer feinen nassen Bürste und richten Sie sie auf einer selbstgebauten Injektionsplatte aus.

Tauchen Sie die Embryonen während der Injektion in Halogenkohlenstofföl, um eine weitere Austrocknung zu vermeiden. Bereiten Sie die Arbeitslösung vor, indem Sie das Cas9-Protein und die entsprechende sgRNA auf eine Konzentration von jeweils 300 Nanogramm pro Mikroliter mischen. Fügen Sie dann 1 Mikroliter Phenolrot zu der Mischung hinzu, um injizierte Embryonen bequem zu markieren.

Die vorbereitete Mischung auf Eis legen, um einen Abbau der sgRNA zu vermeiden. Bereiten Sie die Glasinjektionsnadel mit einem Mikropipettenzieher vor. Geben Sie 3 Mikroliter der Mischung in die Injektionsnadel, ohne Luftblasen einzuführen.

Öffnen Sie dann die Nadel mit einem Microgrinder und verbinden Sie sie gemäß der Bedienungsanleitung mit dem Mikromanipulator. Stellen Sie die Parameter für den Injektor auf Pi auf 500 Hektopascal ein. Ti bis 0,5 Sekunden und PC bis 200 Hektopascal.

Stellen Sie den Teller mit aufgereihten Embryonen auf den objektiven Tisch. Stellen Sie dann die Mikropipettenposition unter einem feinen optischen Mikroskop ein und stellen Sie die Mikropipette und den Embryo auf die gleiche Ebene. Führen Sie die Nadelspitze in den hinteren oder pflanzlichen Pol des Embryos ein.

Drücken Sie dann das Pedal vom Injektor, um die Mischungen in den Embryo zu bringen. Das Auftreten von leichter rötlicher Farbe ist auf die Zugabe von Phenolrot in der Mischung zurückzuführen. Legen Sie die Injektionsplatte mit den injizierten Embryonen in eine künstliche Klimakammer.

Nach 36 Stunden die geschlüpften Larven mit einer Feinspitzenbürste in die Larvendiät überführen. Sammle die Larven drei- bis viermal täglich einsammelst, bis keine Larven mehr schlüpfen. Als nächstes legen Sie die reifen Larven in den nassen Sand, um sich zu verpuppen.

Die Verpuppungsphase dauert 10 Tage. Bewegen Sie die Puppen nach der Verpuppung in einen Plastikkäfig, bevor die Eklosion beginnt. Nach der Isolierung genomischer DNA aus einem frischen Puparium oder einem einzelnen Mittelbein einzelner Erwachsener und dem Design der spezifischen Primer zur Amplifikation des Zielbereichs führen Sie eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) gemäß den im Textmanuskript beschriebenen Zyklusbedingungen durch.

Dann sequenzieren Sie die gereinigten PCR-Produkte. Die Erkennung mehrerer überlappender Peaks neben der Zielstelle deutet auf eine erfolgreiche Mutagenese hin. Für die Sub-Klonierung mischen Sie die gereinigten PCR-Produkte mit einem stumpfen Vektor und ligieren Sie sie 15 Minuten lang bei 25 Grad Celsius.

Dann fügen Sie trans-T1-Zellen hinzu und legen Sie sie für 30 Minuten auf Eis. Dann fügen Sie 500 Mikroliter LB-Medium hinzu und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius für 1 Stunde mit Schütteln. Zentrifugieren und den Überstand verwerfen.

Resuspendieren Sie das Pellet und verteilen Sie es auf einer LB-Platte. Stellen Sie die Platte für die Inkubation über Nacht bei 37 Grad Celsius auf. Wählen Sie dann einzelne Bakterienkolonien für die Sequenzierung aus, um den Genotyp der Mutanten zu überprüfen.

In dieser Studie befindet sich das Beispiel der Zielstelle des ausgewählten Gens im dritten Exon. Die Zielstelle ist hochkonserviert, und eine einzelne Bande wurde durch Gelelektrophorese für die DNA-Vorlage für synthetische gRNA und gRNA nachgewiesen, die in vitro Transkription erhalten wurde. Das Überleben und die Mutagenese von B.dorsalis nach Mikroinjektionen sind hier dargestellt.

Nach der Sequenzierung der PCR-Produkte sind 80% der G0-Individuen Mosaikmutanten. Beim Mutantenscreening führte die Mutante mit 8-Basenpaar-Deletion zu einer vorzeitigen Beendigung der Aminosäuretranslation. Das Einführen der Nadel in den hinteren Bereich oder den Pflanzenpol eines Embryos ist ein zentraler Schritt, da dies das Überleben der Eier direkt beeinflusst.

Diese Technologie bietet eine Referenz für die Untersuchung von Bereichen der Genfunktionen in B.Dorsalis Sie können schnell die Mutanten erfassen, die sie durch diese Methode wollen.