Untersuchung der mikrobiellen Kooperation mittels bildgebender Massenspektrometrie-Analyse von Bakterienkolonien, die während der Infektion auf Agar und im Gewebe gezüchtet wurden

Unser Protokoll ermöglicht die Visualisierung des räumlichen Stoffwechsels von mikrobiellen Interaktionen, die während der Infektion auftreten. Wir haben diesen bildgebenden Massenspektrometrie-Workflow für bakterielle Co-Kulturen entwickelt, die auf Agar- und Gewebemodellen gezüchtet werden. Die Analyse nicht-traditioneller Substrate wie Bakterienkulturen, die auf Agar gezüchtet werden, birgt viele Herausforderungen.

Mit unserem Protokoll können Bakterienproben entsprechend getrocknet werden, um die Anwendung der MALDI-Matrix bei der anschließenden bildgebenden Massenspektrometrie-Analyse zu erleichtern. Diese Methode ist allgemein anwendbar auf eine Vielzahl von Metaboliten, mikrobiellen Krankheitserregern oder Krankheiten und Probentypen, bei denen ein räumliches Maß der Zell- oder Gewebebiochemie gewünscht wird, insbesondere bei der Untersuchung von Probentypen, die vor der Analyse dehydriert werden müssen. Entfernen Sie nach der Vorbereitung der Makrokolonien der Bakterienkultur die auf ITO-beschichteten Objektträgern montierten Agarosebakterienkolonien aus dem Verpackungsmaterial.

Legen Sie die Proben in eine trockene Schachtel mit Trockenmittel für 48 bis 72 Stunden bei Raumtemperatur. Untersuchen Sie die Kolonien visuell auf Verformungen in der Agaroberfläche. Schließen Sie anschließend die Vakuumleitung zur Probenkammer und schalten Sie den Netzschalter für die Drehschieberpumpe ein, damit sich die Vakuumpumpe erwärmen und den richtigen Vakuumdruck erreichen kann.

Schalten Sie den Transformator mit variabler Spannung ein, um den um die Kammer gewickelten Drahtfaden zu erhitzen. Stellen Sie die variable Stromversorgung ein, bis die Innentemperatur der Vakuumkammer etwa 50 Grad Celsius erreicht. Während sich die Pumpe erwärmt, geben Sie eine Aufschlämmung aus Trockeneis und 100% Ethanol in den Kühlfallenkondensator.

Öffnen Sie die Vakuumkammer mit einem Schraubenschlüssel, um die 16-Millimeter-Doppelgewebeflanschklemmen zu lösen. Führen Sie die Agaroseproben in die Kammer ein und verschließen Sie die Kammer mit den 16-Millimeter-Doppelgewebeflanschklemmen fest. Öffnen Sie dann das Pumpenventil, um die Kammer zu evakuieren, und lassen Sie die Proben 60 bis 120 Minuten trocknen.

Wenn Sie fertig sind, entlüften Sie die Vakuumkammer langsam auf Umgebungsdruck, indem Sie das Ventil an der Drehschieberpumpe schließen und den Vakuumflansch für die Umgebungsluft öffnen. Öffnen Sie die Kammer wie zuvor gezeigt und entfernen Sie die getrocknete Agaroseprobe aus der Kammer. Verwenden Sie die 1,5-Diaminonaphthalin-MALDI-Matrix für ihre günstige Desorption und Ionisierung von Aminosäuren und den negativen Ionenmodus.

Befestigen Sie die Probe an der Sprühschale und laden Sie die vorbereiteten Lösungen in die Sprühleitung. Geben Sie mit der Computersoftware die erforderlichen Parameter für eine gleichmäßige Beschichtung der Matrixverbindung an. Überwachen Sie die Sprühsequenz, bis sie fertig ist.

Nehmen Sie die Probe aus der Sprühschale und lagern Sie sie bis zur Analyse in einem Trockenschrank. Legen Sie die matrixbeschichtete Probe in den MALDI-Objektträgeradapter für Zielplatten ein. Beschriften Sie mindestens drei Passermarkierungen, die den Probenbereich mit Permanentmarkern umfassen.

Verwenden Sie einen Flachbettscanner, um ein optisches Bild des Objektträgers einschließlich der treuhänderischen Marker aufzunehmen. Definieren Sie nun eine Massenspektrometrie-Instrumentenmethode, wie im Manuskript beschrieben. Wählen Sie im negativen Ionenmodus das 100-Dalton-Massenfenster von Masse nach Ladung 100 bis 200 für die Anreicherung von Gasphasensignalen unter Verwendung eines kontinuierlichen Akkumulationsansatzes ausgewählter Ionen, der die Masse nach Ladungswerten der interessierenden Metaboliten umfasst.

Öffnen Sie die Bilderfassungssoftware des Geräts, und verwenden Sie den Setup-Assistenten, um den Dateinamen und den Speicherort, den MS-Aufnahmemodus, die zu untersuchenden Regionen und die räumliche Auflösung des Bildes zu definieren. Trainieren Sie die Probe, indem Sie die Passermarken aus dem optischen Bild verwenden, um sie mit dem Instrumentenprobenträger zu synchronisieren. Definieren Sie dann die interessierenden Regionen auf dem optischen Bild mit dem Auswahlwerkzeug für Interessenbereiche der Software.

Sobald alle Parameter definiert sind, starten Sie die Aufnahmesequenz, um seriell ein Massenspektrum an jedem Pixel über den definierten Interessenbereich zu erfassen. Speichern Sie die Daten nach der Bildaufnahme mit einer MIS-Dateierweiterung, einem herstellerspezifischen Dateiformat für bildgebende Massenspektrometrieplattformen. Öffnen Sie die Datendatei in flexImaging- oder SCiLS-Softwarepaketen oder exportieren Sie sie in ein nicht-proprietäres Datenformat wie mzML und visualisieren Sie sie mit herstellerneutraler Software.

Definieren Sie mithilfe der Referenzsoftware Massenfenster für interessierende Peaks, um Falschfarben-Heatmaps der Ionenverteilungen in den abgetasteten Regionen zu erstellen. Zoomen Sie auf der Anzeige des durchschnittlichen Massenspektrums auf den gewünschten Peak, und wählen Sie ein geeignetes Massenfenster aus, das den Bereich des Peakprofils umfasst. Klicken Sie nun mit der rechten Maustaste auf das hervorgehobene Massenfenster und wählen Sie Massenfilter hinzufügen.

Kennzeichnen Sie die ausgewählte Masse nach Ladungswert, indem Sie die vorläufige Identifizierung des verdächtigen Metaboliten verwenden, wie er durch die hochauflösende genaue Massenmessung bestimmt wird. Wählen Sie den Intensitätsschwellenwert aus, um den Dynamikbereich des Analytbildes anzupassen, das von der Falschfarben-Heatmap angezeigt wird. Passen Sie die Massenfilterparameter weiter an, sodass das Massenfenster den Bereich des Peakprofils umfasst, und fügen Sie dann den Massenfilter hinzu.

Reinigen Sie alle Kryosektionsgeräte, indem Sie sie mit 100% Ethanol spülen, und lassen Sie sie trocknen, bevor Sie die Proben in die Kryostatkammer geben. Bereiten Sie ITO-beschichtete Objektträger mit einem Ohmmeter vor, um die Seite des Objektträgers mit der leitfähigen Beschichtung zu identifizieren. Ätzen und beschriften Sie mit einem Ritzer mit Diamantspitze die ITO-beschichtete Seite des Objektträgers.

Führen Sie dann eine Kryosektion an einem Forschungskryomikrotom durch. Übertragen Sie die in OCT eingebetteten Maus-Ceca-Gewebe aus einem 80-Grad-Celsius-Gefrierschrank auf Trockeneis in die Kryomikrotomkammer. Montieren Sie das in die OCT eingebettete Gewebe in der Kryomikrotomkammer mit einer zusätzlichen OCT-Lösung auf einem Probenfutter.

Nachdem sich die OCT-Lösung verfestigt hat, befestigen Sie das Futter am Probenkopf und beginnen Sie mit der Kryosektion in Schritten von 10 bis 50 Mikrometern, um die gewünschte Gewebetiefe oder -ebene des Organs zu erreichen. Sobald ein optimaler Querschnitt des Gewebes erreicht ist, beginnen Sie mit der Entnahme von Schnitten mit einer Dicke von 12 Mikrometern. Manipulieren Sie die Scheibe vorsichtig mit Künstlerpinseln und legen Sie sie auf einen teflonbeschichteten Objektträger.

Um das Gewebe vom teflonbeschichteten Objektträger aufzunehmen, rollen Sie den ITO-beschichteten Objektträger auf den Gewebeschnitt. Befestigen Sie den Gewebeabschnitt am Objektträger, indem Sie die Handfläche auf die Rückseite des ITO-beschichteten Objektträgers drücken. Weiter auftauen, bis der Gewebeabschnitt von einer durchscheinenden zu einer undurchsichtigen oder matten Textur übergeht.

Für die Analyse am selben Tag übertragen Sie die auf dem Gewebe montierten Objektträger auf Trockeneis zur Aufbewahrung in eine Trockenbox mit Trockenmittel. Führen Sie die MALDI-Matrixanwendung und die MALDI-Bildgebungs-Massenspektrometrie durch, wie zuvor gezeigt. Analysieren Sie die Ionenbilder von mehreren biologischen Replikaten und vergleichen Sie die Ergebnisse für eine Signifikanz über Intensitäts-Box-Plot-Vergleiche mit der SCiLS-Statistiksoftware.

Die MALDI-Analyse von Bakterienkulturproben im Negativ-Ionen-Modus ermöglicht den Nachweis von Dutzenden von Metaboliten. Hochauflösende, genaue Massenmessungen ermöglichen die vorläufige Identifizierung von Ornithin und Arginin. Die Messbereiche für die bildgebende Massenspektrometrie-Analyse sind dargestellt.

Die bildgebende Massenspektrometrie dieser Proben ermöglicht die räumliche Kartierung von Ornithin- und Arginin-Aminosäuremetaboliten, die in Gegenwart von Enterococcus faecalis verändert und differentiell lokalisiert sind. Die Gewebemorphologie der infizierten Maus-Ceca wurde mittels Hämatoxylin- und Eosin-Färbung visualisiert. Gezeigt werden optische Bilder von Ceca-Geweben der Maus nach dem Auftragen einer 1,5-Diaminonaphthalin-MALDI-Matrixschicht.

MALDI-Ionenbilder für Ornithin und Arginin zeigen einzigartige räumliche Verteilungen über die Gewebeproben. Die wichtigste Überlegung für dieses Protokoll ist die Aufrechterhaltung einer schonenden Trocknung und Handhabung von Bakterienkulturproben, um Blasenbildung, Rissbildung und andere Verformungen der Probe zu minimieren. Im Anschluss an die bildgebende Massenspektrometrie können hellfeld- und fluoreszenzmikroskopische Analysen von Gewebeproben durchgeführt werden, um die Gewebemorphologie zu bewerten.

Dies kann auch eine gezielte Validierung molekularer Signalwege mit antikörperbasierten bildgebenden Verfahren ermöglichen.