Auswertung und Manipulation neuronaler Aktivität mittels holographischer Zwei-Photonen-Mikroskopie

Dieses Protokoll liefert genaue räumliche Zeitinformationen über die Neuroaktivität. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Fähigkeit, die Neuroaktivität mit hoher räumlicher zeitlicher Auflösung zu manipulieren und zu bewerten. Es kann nützlich sein, um die Erreger neuropsychiatrischer Erkrankungen zu veranschaulichen, die zu Anomalien in der neuronalen Aktivität führen.

Diese Methode kann sowohl auf die Untersuchung von Neuronen als auch auf die Gesundheit in den anderen Organen angewendet werden. Das Verfahren wird von Zhongtian Guo, Doktorand aus unserem Labor, demonstriert. Einen Tag nach der Implantation der Kopfplatte 1,32 Milligramm pro Kilogramm Dexamethason-Natriumphosphat intraperitoneal verabreichen, eine Stunde vor der Operation, um ein Hirnödem zu vermeiden.

Führen Sie unter einem Stereoskop eine kreisförmige Kraniotomie mit einem Durchmesser von etwa zwei Millimetern mit einem Zahnbohrer durch. Um Hirnschäden zu reduzieren, bedienen Sie den Zahnbohrer vorsichtig mit konstanter leichter Bewegung und leichtem Druck nach unten. Entfernen Sie die Knochenfragmente mehrmals mit einem Saugsystem.

Verwenden Sie nach der Entfernung des Knochenfragments eine künstliche Rückenmarksflüssigkeit oder eine ACSF-Lösung, um alle auf der Gehirnoberfläche verbliebenen Ablagerungen zu entfernen und zu waschen. Wiederholen Sie diesen Reinigungsvorgang mehrmals, um Entzündungsreaktionen zu unterdrücken. Stellen Sie mit einem Druckinjektionssystem den entsprechenden Druck ein, um 500 Nanoliter AAV-Lösung 10 Minuten lang durch eine Glaskapillare mit einem Spitzendurchmesser von 10 bis 20 Mikrometern zu injizieren.

Wenn der Spiegel der AAV-Lösung in der Glaskapillare allmählich abnimmt, wird die AAV-Lösung dem Gehirn verabreicht. Lassen Sie die Glaskapillare weitere 10 Minuten an Ort und Stelle, um einen Rückfluss zu verhindern. Wiederholen Sie dies dreimal, um insgesamt 1,5 Mikroliter AAV-Lösung in das Gehirn zu verabreichen.

Tragen Sie 2 % niedrigschmelzende Agarose mit einer Mikropipette auf die Gehirnoberfläche von S1 auf und platzieren Sie dann ein Glasfenster mit zwei Deckgläsern über der Kraniotomie. Drücken Sie das Deckglas gegen die Agarose, solange sie noch flüssig ist. Dadurch wird die Bildung von Luftblasen in der Agarose verhindert.

Versiegeln Sie die Ränder des Schädelfensters mit Zahnkleber. Um das holographische Stimulationssystem zu kalibrieren, platzieren Sie die Oberfläche eines rot fluoreszierenden Objektträgers auf der Probenebene und stellen Sie das Mikroskop in den Live-Bildgebungsmodus mit schwachem Anregungslicht. Führen Sie die Kalibrierungs-GUI aus.

mfile, überprüfen Sie den Parameterbereich und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Klicken Sie auf die Schaltfläche Z-Scan im Bereich Schritt eins, wenn automatisch drei zufällige Punkte in 21 verschiedenen axialen Ebenen im Abstand von zwei Mikrometern von jeder Ebene generiert werden. Verschieben Sie den Schieberegler und überprüfen Sie das Live-Bild.

Suchen Sie die perfekte Ebene, in der die Punkte am kleinsten und hellsten erscheinen, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Speichern. Dadurch wird automatisch eine versetzte sphärische Wellenfront für das digitale Hologramm erzeugt. Klicken Sie im Bereich Schritt zwei auf die Schaltfläche Los, und klicken Sie dann auf sechs Stellen im linken Quadrat.

Überprüfen Sie das Live-Bild. Wenn es sechs unterscheidbare fluoreszierende Punkte gibt, geben Sie ihre x- und y-Achse in die Bearbeitungsfelder ein und klicken Sie auf die Schaltfläche Speichern. Dadurch wird automatisch ein feiner Transformationskoeffizient generiert, um die Kalibrierung zwischen dem holografischen Stimulations- und dem Bildgebungssystem zu koordinieren.

Klicken Sie dann im Bereich Schritt drei auf die Schaltfläche Scannen. Es wird 441 digitale Hologramme generieren, um in 21 mal 21 Schritten Einzelpunktscans über das Sichtfeld durchzuführen. Überprüfen Sie die Bilder, während Sie die Muster im Listenfeld ändern.

Passen Sie die Laserleistung an, um Spotbilder innerhalb des Dynamikbereichs des Bildgebungsgeräts zu erhalten. Versetzen Sie das Imaging-Gerät in den Aufnahmemodus und klicken Sie auf die Schaltfläche Wiedergabe. Klicken Sie nach Abschluss der Wiedergabe im vierten Schritt auf Gewichtskarte generieren und wählen Sie ein gestapeltes Bild aus.

Schließen Sie dann das Fenster der Kalibrierungs-GUI. Es wird automatisch eine Gewichtskarte erstellt, um die unausgewogene Intensität an jeder Stelle auszugleichen. Legen Sie die AAV-injizierte Maus mit einer Kopfplatte unter das Mikroskop und führen Sie eine Zwei-Photonen-Bildgebung mit einem holografischen Mikroskop und einem modengekoppelten Titan-Saphir-Laser durch, der auf 920 Nanometer mit einem 25-fachen Objektiv abgestimmt ist.

Öffnen Sie die kommerzielle Imaging-Software im Live-Imaging-Modus. Passen Sie die Spannung des Bilddetektors und die Leistung des Bildgebungslasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die GCaMP8f exprimieren. Nehmen Sie Bilder von den Neuronen auf, die dieses Protein exprimieren.

Um die spezifischen Neuronen mit holografischer Beleuchtung zu beleuchten, führen Sie die SLM-Steuerung aus. m-Skriptdatei. Klicken Sie auf das Referenzbild und wählen Sie das aufgenommene Bild aus.

Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Spot, um bestimmte Pixel auf den Neuronen im Bild auszuwählen, und drücken Sie die Eingabetaste auf der Tastatur, um den Vorgang abzuschließen. Um neuronale Aktivität mit hoher zeitlicher Auflösung mit einem Bildsensor zu erkennen, stellen Sie die Belichtungszeit, den Bildbereich und das Binning ein und führen Sie dann die Bildaufnahme durch. Nachdem Sie die Maus unter das Mikroskop gelegt und eine Zwei-Photonen-Bildgebung durchgeführt haben, öffnen Sie die kommerzielle Bildgebungssoftware.

Passen Sie im Live-Bildgebungsmodus die Spannung des Bilddetektors und die Leistung des Bildgebungslasers an, um die Helligkeit der Neuronen zu optimieren, die GCaMP-6m-p2A-ChRmine exprimieren. Nehmen Sie Bilder der Neuronen auf, die diese Proteine exprimieren, und beleuchten Sie dann die spezifischen Neuronen nach dem zuvor gezeigten Verfahren. Um die funktionelle Konnektivität innerhalb der Neuronen der Schicht zwei und drei zu untersuchen, verwenden Sie einen räumlichen Lichtmodulator, um holographische Muster optogenetischer Stimulation zu erzeugen, und kombinieren Sie sie mit Zwei-Photonen-Kalzium-Bildgebung.

Stellen Sie die Intensität des bildgebenden Lasers auf 920 Nanometer bei 10 bis 20 Milliwatt und das Sichtfeld auf 256 Mikrometer mal 256 Mikrometer ein, gemessen in einer Tiefe von 100 bis 150 Mikrometern von der kortikalen Oberfläche. Stellen Sie die Pixelverweildauer auf 1,5 Mikrosekunden für zwei Hertz oder 100 Nanosekunden für 30 Hertz ein. Verwenden Sie sowohl zwei Hertz als auch 30 Hertz als Bildrate, um zu sehen, ob ein einzelner holografischer Stimulus eine Kalziumantwort in den Neuronen hervorgerufen hat.

Stellen Sie die Intensität des holografischen Stimulationslasers, der ein einzelnes Neuron stimuliert, auf 10 Milliwatt ein, was ausreicht, um neuronale Aktivität zu induzieren. Stellen Sie gleichzeitig die Kalzium-Eisen-Antwort bei 920 Nanometern mit 10 holographischen Stimuli bei 1040 Nanometern und Acht-Sekunden-Intervallen für eine Dauer von 50 Millisekunden nach einer Baseline-Periode von 10 Sekunden dar. Danach bringen Sie die Maus in ihren Heimatkäfig zurück.

Das repräsentative Bild und die Spuren von Neuronen, die GCaMP8f exprimieren, in 100-Hertz-Bildgebung mit holographischer Stimulation und einem Bildsensor sind hier zu sehen. Diese Grafik zeigt die neuronale Reaktion auf holographische Stimulation bei jeder Laserleistung. Die repräsentativen Calcium 2+-Spuren während der holographischen Stimulation von 10 verschiedenen Neuronen mit Bildraten von zwei Hertz und 30 Hertz werden hier vorgestellt.

Die gleiche Farbe zeigt das gleiche Neuron an. Eine schematische Darstellung der funktionellen Verbindungen zwischen Neuronen ist hier dargestellt. Wenn das orangefarbene Neuron stimuliert wird, reagieren die roten Neuronen gleichzeitig, was darauf hinweist, dass eine funktionelle Verbindung zwischen diesen Neuronen besteht.

Ein typisches Bild der primären somatosensorischen Kortexneuronen, die GCaMP6m im Wildtyp exprimieren, ist hier gezeigt. Diese grafischen Bilder stellen die typischen Calcium 2+-Spuren während der holographischen Stimulation mit Bildraten von zwei Hertz und 30 Hertz dar. Die neurologische Reaktionsfähigkeit auf holographische Stimulation kann sowohl bei zwei Hertz als auch bei 30 Hertz Bildgebungsgeschwindigkeiten nachgewiesen werden.

Diese Schritte sind wichtig, um die Gehirnbewegung zu reduzieren und zweitens stabile Ergebnisse zu erzielen. Wir glauben, dass dieses Mikroskop Verhalten in schreibenden Neuronen mit bestimmten Mustern induzieren kann. Mit dieser Technik sind wir nun in der Lage, die Aktivität einzelner Neuronen zu beurteilen und zu manipulieren und die Neuropsychiatrie im Detail zu charakterisieren.