Multimodale Analyseplattform auf einem Multiplex-Oberflächenplasmonen-Resonanztomographie-Chip zur Analyse extrazellulärer Vesikel-Untergruppen

Die Komplexität von Elektrofahrzeugen macht es schwierig, die interessierende Subpopulation zu erkennen, und dieses Protokoll kann sie anhand ihres Phänotyps, ihres Größenprofils und ihrer nanomechanischen Eigenschaften erkennen. Diese Kombination von Techniken ist eine markierungsfreie Methode, die es uns ermöglicht, EVs in Echtzeit aus den Zustandsmedien und dem Blutplasma zu erkennen. Diese Technik ermöglicht es, eine tiefe Untergruppe von Nanopartikeln von Interesse zu charakterisieren, um als Bioindikatoren der Pathologie oder auch als Nanopartikel für die Arzneimittelabgabe verwendet zu werden.

Da es sich um eine sehr empfindliche Methode handelt, ist es unbedingt erforderlich, auf die Biochip-Vorbereitung zu achten, bevor Sie Ihre interessierende Probe injizieren. Nach dem Beschichten und Funktionalisieren der Chips wird der Biochip in einer Mischung aus 200-millimolaren Ethyldimethylaminopropylcarbodiimid/N-Hydroxysuccinimid und 50 Millimolar pro Liter N-Hydroxysuccinimid für mindestens 30 Minuten im Dunkeln bei Raumtemperatur inkubiert. Fügen Sie mit dem Spotter 300 Nanoliter Ligandenlösung hinzu und inkubieren Sie den Biochip 30 Minuten lang unter einem Schallbad.

Waschen Sie den Biochip von oben mit Reinstwasser. Fügen Sie ein Tröpfchen Öl mit dem gleichen Brechungsindex wie das Prisma hinzu, um eine gleichmäßige dünne Schicht zwischen dem Biochip und dem Prisma zu erzeugen, und legen Sie es vorsichtig auf ein Prisma mit dem gleichen Brechungsindex wie der Biochip. Für die Oberflächenplasmonenresonanztomographie montieren Sie den Biochip auf dem SPRi-System.

Navigieren Sie zum Dropdown-Menü auf der linken Seite der Software und klicken Sie auf das Arbeitsverzeichnis. Suchen Sie das Bild, auf dem verschiedene Stellen sichtbar sind, und klicken Sie, um dieses Bild auszuwählen. Schreiben Sie dann den Namen der Ligandenfamilien und klicken Sie auf die Definition der finnischen Spezies.

Ziehen Sie die schwarze Linie mit dem Cursor in den optimalen Arbeitswinkel. Klicken Sie auf Spiegel in Arbeitswinkel verschieben und wählen Sie einen Arbeitswinkel aus. Klicken Sie nun auf Kinetik.

Wenn die Software den Benutzer auffordert, die Negativkontrolle zu definieren, wählen Sie an dieser Stelle Keine Negativkontrolle aus. Injizieren Sie vier Minuten lang Rattenserumalbumin in einer Menge von 50 Mikrolitern pro Minute. Injizieren Sie Ethanolamin mit 20 Mikrolitern pro Minute für 10 Minuten, um die noch vorhandenen und reaktiven Carboxylgruppen auf der Oberfläche zu deaktivieren.

Waschen Sie anschließend den Biochip, indem Sie vier Minuten lang 40 millimolare OG mit 50 Mikrolitern pro Minute injizieren. Injizieren Sie die extrazellulären Vesikel in einer bestimmten Konzentration auf den biofunktionalisierten Chip, während Sie gleichzeitig die Kinetik der Wechselwirkung der Vesikel an den verschiedenen Stellen verfolgen. Bestimmen Sie auch den Wert des Reflexionsvermögens und den Grad der Wechselwirkung.

Nach der Stabilisierung injizieren Sie Glutaraldehyd auf den Chip, um extrazelluläre Vesikel an der Stelle zu fixieren, an der sie sich befinden, bevor Sie eine AFM-Bildgebung durchführen. Richten Sie den Biochip auf der Oberseite der Maske auf dem Objektträger aus. Verwenden Sie die CCD-Kamera oben auf dem AFM, um den Ausleger an der richtigen Stelle zu lokalisieren, die gescannt werden muss.

Starten Sie die AFM-Erfassung im Kontaktmodus von drei bis fünf großen bis kleinen Bereichen. Behandeln Sie als Nächstes die AFM-Bilder mit der JPK-Datenverarbeitungssoftware, indem Sie zuerst den Höhenkanal auswählen. Wählen Sie eine Polynomanpassung, die von jeder Linie subtrahiert werden soll, um begradigte Scanlinien zu erhalten.

Wählen Sie die Höhenschwelle für Goldkörner, um die Rauheit auf der Oberfläche zu beseitigen. Das Getreideextraktionsmodul markiert die Körner mit einer Höhenschwelle von 8,5 Nanometern. Multiplex-Biochips wurden nach Albuminpassivierung analysiert.

Der Chip ohne Standard. Der Chip weist einige Defekte auf, die auf die Verschmelzung von Flecken, eine schwache Pfropfung oder Blasen oder Verunreinigungen zurückzuführen sind. Und gezeigt wird ein nackter Goldchip ohne Microarrays zur Untersuchung der Adsorption von extrazellulären Vesikeln auf Gold.

Das Capture-Experiment auf einem gemultiplexten Biochip zeigte gute Reflektivitätssignale für verschiedene Liganden und ein gutes Signal-Rausch-Verhältnis für die verschiedenen Liganden, da die Reaktion der Negativkontrolle vernachlässigbar war. Die extrazelluläre Vesikeladsorption nach der Injektion der extrazellulären Vesikelprobe zeigte ein hohes Reflektivitätssignal, was darauf hindeutet, dass diese Vesikel in der Lage waren, zu adsorbieren und auf dem Goldchip stabil zu bleiben. Nach extrazellulärer Vesikelbeladung wurden die großskaligen und kleinskaligen AFM-Bilder von extrazellulären Vesikeln auf Biochips erzeugt.

Eine hochauflösende Nahaufnahme ermöglicht die Metrologie extrazellulärer Vesikel. Der effektive Durchmesser der extrazellulären Vesikel auf einem Biochip lag zwischen 30 und 300 Nanometern, wobei die große Mehrheit bei etwa 60 Nanometern lag. Die in Luft und Flüssigkeit erzielten Ergebnisse waren vergleichbar.

Das Raman-Spektrum extrazellulärer Vesikel, die auf einem nackten Chip adsorbiert wurden, zeigte ein klares Spektrum mit Peaks, die hauptsächlich Methylenschwingungen entsprechen, die mit den Lipiden extrazellulärer Vesikelmembranen assoziiert sind. Es ist wichtig, Ihren Biochip gründlich vorzubereiten, um Ihre Elektrofahrzeuge genau und reproduzierbar erkennen zu können. Konventionelle Methoden wie Western Blot und Nanopartikel-Tracking-Analyse können eingesetzt werden, um Phänotypen und Größenmuster zu korrelieren und zu bestätigen.

Darüber hinaus sind Multi-Omik-Analysen vorgesehen, um noch tiefer in die molekulare Charakterisierung von EV und die mögliche Unterscheidung von Untergruppen einzudringen.