Messung der Kompressibilität von Zelle und Zellkern mittels akustofluidischem Mikrogerät

Die Zellmechanik spielt eine wichtige Rolle bei der Tumormetastasierung, der malignen Transformation von Zellen und der Strahlenempfindlichkeit. Die akustofluidische Methode kann eine schnelle und zerstörungsfreie Messung in suspendierten Zuständen realisieren. Diese Technik kann verwendet werden, um die Veränderung der Selbstkompressibilität während des epithelialen zu mesenchymalen Übergangs zu spiegeln und zirkulierende Tumorzellen zu trennen, was ihre Anwendungsaussichten in der Krebsdiagnose zeigt.

Binden Sie zunächst den PDMS-Block an den Chip, indem Sie mit einer Hohlnadel mit einem Durchmesser von einem Millimeter Löcher in den PDMS-Block für Ein- und Auslassöffnungen stanzen. Dann legen Sie die PDMS-Blöcke und Chip mit der Rückseite nach oben für eine Minute in einen Plasmareiniger. Nachdem Sie die Löcher an den PDMS-Blöcken mit dem Chipeinlass und -auslass ausgerichtet haben, drücken Sie die PDMS-Blöcke 15 Sekunden lang vorsichtig auf den Chip, wodurch eine Verbindung zwischen den PDMS-Blöcken und der Oberfläche des Chips auftritt.

Um den PTFE-Katheter mit dem Chip zu verbinden, schneiden Sie zwei Katheter mit einem Innendurchmesser von 0,8 Millimetern und einer Länge von 10 Zentimetern. Biegen Sie eine Edelstahlnadel mit einem Innendurchmesser von 0,7 Millimetern und einer Länge von 1,5 Zentimetern um 90 Grad in eine L-Form und verbinden Sie sie mit einem Ende des Katheters. Führen Sie die Edelstahlnadeln in die Löcher der PDMS-Blöcke ein.

Schließen Sie für den Einlass eine 19-Gauge-Dosiernadel als Anschluss für eine Spritze an das andere Ende des Katheters an. Anschließend injizieren Sie entionisiertes Wasser, um die Dichtheit des gesamten Kanals zu testen. Wählen Sie für eine piezoelektrische Keramikbaugruppe vorgeschnittene piezoelektrische Keramikplatten mit einer Breite von fünf Millimetern.

Dann schweißen Sie Drähte auf beiden Seiten der piezoelektrischen Keramik an einem Ende. Kleben Sie die piezoelektrische Keramik auf die Mitte der Rückseite des Chips, indem Sie einen Tropfen Cyanacrylatkleber auf die piezoelektrische Keramik geben. Glätten Sie den Kleber mit dem Zahnstocher und entfernen Sie den überschüssigen Kleber.

Drücken Sie dann schnell auf den Chip und drücken Sie etwa eine Minute lang weiter. Um das Mikrogerät zu montieren, schneiden Sie ein Stück PDMS als Basis des Mikrogeräts ab und kleben Sie eine Seite der Basis an die PDMS-Blöcke für den Ein- und Auslass und die andere Seite an einen transparenten Glasobjektträger mit doppelseitigem Klebeband. Befestigen Sie das gesamte Mikrogerät am Mikroskoptisch, um den Chip in einer Fokusebene zu halten.

Zur Herstellung der Polystyrol-Standardpartikellösungen werden 0,05 Milliliter Polystyrol-Partikellösung zu 10 Milliliter PBS gegeben und gut gemischt. Dann bereiten Sie die Zellsuspensionen vor, indem Sie die adhärenten Zellen bei 90% Konfluenz mit PBS waschen. Fügen Sie 500 Mikroliter 0,25 Trypsin für ein bis zwei Minuten bei Raumtemperatur hinzu.

Nach dem Entfernen des Trypsins einen Milliliter komplettes Medium hinzufügen und durch Pipettieren eine Zellsuspension bilden. Als nächstes zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 100 G für fünf Minuten. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie 0,5 bis einen Milliliter PBS, um eine Zellsuspension zu erhalten.

Dann wurden die Zellen mit einem Hämozytometer gezählt und die Konzentration betrug etwa 300 bis 500.000 Zellen pro Milliliter. Nach einer Herstellung der Zellkernsuspension, wie zuvor gezeigt, entfernen Sie den Überstand und fügen Sie 200 Mikroliter zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz A pro 20 Mikroliter Zellpalette hinzu und mischen Sie gut. Dann die obige Mischung bei 220 G für fünf Sekunden vortex und für 10 Minuten auf Eisbad legen.

Als nächstes fügen Sie der Lösung nach der Inkubation 10 Mikroliter zytoplasmatisches Proteinextraktionsreagenz B hinzu. Nach dem Wirbeln für eine Minute auf das Eisbad legen und fünf Sekunden lang erneut bei 220 G wirbeln. Dann schließlich bei 1000 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius zentrifugieren.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Palette in einem Milliliter PBS. Dann bei 1000 g bei vier Grad Celsius für vier Minuten zentrifugieren. Nach dem Entfernen des Überstands in 100 Mikroliter PBS als Zellkernsuspension resuspendieren.

Fügen Sie Trypanblau zu der obigen Zellkernsuspension hinzu und färben Sie sie bei Raumtemperatur für vier Minuten. Als nächstes zählen Sie die Anzahl der Kerne unter dem inversen Mikroskop mit einem 10x-Objektiv. Die obige Zellkernsuspension wird mit PBS-Puffer auf eine Konzentration von 200 bis 300.000 Kern pro Milliliter verdünnt.

Anschließend filtrieren Sie die Zellkernsuspension durch ein 70-Mikrometer-Sieb. Um das Messsystem einzurichten, schalten Sie die Lichtquelle des Mikroskops ein und öffnen Sie die Kamerasoftware. Verwenden Sie das 4x-Objektiv, um die mittlere Position des Mikrokanals zu finden, dh die Position der piezoelektrischen Keramik.

Nach dem Anschließen der Drähte an die Plus- bzw. Minuspole des Signalgeneratorausgangs der piezoelektrischen Keramik verschweißen. Legen Sie dann die Spritze auf die Mikroinjektionspumpe und verbinden Sie sie mit dem Einlasskatheter. Um die Flüssigkeit aus dem Mikrokanal zu sammeln, platzieren Sie einen kleinen Behälter am Ende des Auslasskatheters.

Zur Bestimmung der Messparameter saugen Sie die Polystyrolpartikellösung mit der Spritze ab. Injizieren Sie dann die Lösung in den Chip-Mikrokanal unter Vermeidung von Luftblasen und in den Chip-Mikrokanal, um eine genaue Messung zu gewährleisten. Stellen Sie den Ausgang des Signalgenerators auf ein Vorzeichensignal mit einer Frequenz von einem Megahertz und einer Spitze-zu-Spitze-Spannung von 10 Volt ein, bis beobachtet wird, dass sich die Partikel in Richtung der Mittellinie bewegen und nach Erreichen der Mittellinie in Vorwärtsbewegung entlang der Mittellinie bleiben.

Nachdem Sie eine Milliliterzelle oder Kernsuspension mit der Standardpartikellösung im Verhältnis eins zu eins gemischt haben, injizieren Sie sie mit einer Spritze in den Mikrokanal, um Zellen und Kerne zu messen. Starten Sie die Aufnahme mit der CCD-Kamera, wenn die Zellen oder Kerne in das Sichtfeld eintreten und schalten Sie den Signalgenerator ein. Spülen Sie dann den Mikrokanal nacheinander mit entionisiertem Wasser, 75% Alkohol und entionisiertem Wasser für den späteren Gebrauch.

Die Bewegung der Zellen und Partikel wurde unter der Wirkung der akustischen Feldkraft in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals in verschiedenen Zeitintervallen beobachtet. Die Berechnung von Energie, Dichte und Zellkompressibilität wurde durchgeführt und die akustische Energiedichte und die gemessene Bewegungsbahn für das Partikel wurden aus dem besten Anpassungsergebnis erhalten. Die hochreinen und intakten Kerne wurden aus Zellen isoliert und die Messung der Kompressibilität des Kerns wurde durch die Ermittlung der Bewegungsbahn des Kerns erreicht.

Die Kompressibilität verschiedener Krebszelltypen und Zellen nach medikamenteninduzierter EMT- oder Röntgenbestrahlung mit unterschiedlichen Dosen wurde gemessen und verglichen. Die gemessenen Zellen wurden gesammelt und es wurde festgestellt, dass es nach 48 Stunden Kultur keinen signifikanten Unterschied in der Zellproliferation und Lebensfähigkeit im Vergleich zur unbehandelten Gruppe gab. Dies deutet darauf hin, dass die Kompressibilitätsmessung keinen Einfluss auf die Zellproliferation und das Überleben hat.

Das Wichtigste ist, die Frequenz des Signals zu verfeinern, bis beobachtet wird, dass sich Partikel in Richtung der Mittellinie des Mikrokanals bewegen.