Name: Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-17T13:55:00.000+00:00
Duration: 8 min 32 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Transzytosefähigkeiten von Escherichia coli-Stämmen durch polarisierte intestinale Epithelzellen mit reifen Verbindungen vergleichen. Diese Methode untersucht einen wichtigen Schritt in der Pathogenese neonataler E.-coli-Invasion.

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Diese Arbeit wurde durch ein Sarah Morrison Studentenstipendium unterstützt, das von der University of Missouri-Kansas City School of Medicine an A.I.

HINWEIS: Führen Sie alle Manipulationen der T84-Zellen, Bakterien, Platten und Reagenzien in einer Sicherheitswerkbank der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2) durch, um eine Kontamination zu vermeiden. Verwenden Sie separate Bereiche und Inkubatoren für alle Arbeiten mit sterilen T84-Zellen, infizierten T84-Zellen und E. coli. Die klinischen E. coli-Isolate, die mit den hier beschriebenen Methoden getestet wurden, wurden nach den Richtlinien des Institutional Review Board an unserer Institution 1,16 gewonnen.
1. Herstellung von Transzytose-Inserts mit T84-Zellen (ca. 1-2 Wochen vor dem Experiment)
<ol><li>Züchten Sie American Type Culture Collection (ATCC) T84-Zellen in Gewebekulturmedium (TCM + Antibiotika), bestehend aus Dulbeccos modifiziertem Adlermedium: Hams F-12-Nährstoffmischung (1:1, Endkonzentration: jeweils 50%), 5% fötalem Rinderserum und 1% (100 U/ml) Penicillin / Streptomycin-Dual-Antibiotika-Mischung. Die Zellen bei 37 °C mit 5%CO2 inkubieren. HINWEIS: Eine Variation dieser Mediumformulierung ohne Penicillin/Streptomycin (TCM ohne Antibiotika) wird für die späteren Schritte (Abschnitt 2 und weiter) des Verfahrens verwendet. Stellen Sie sicher, dass für jeden Schritt die richtige Formulierung verwendet wird.</li>
	<li>In einer Biosicherheitswerkbank (BSC) werden die T84-Zellen in Polyethylenterephthalat-Membran-Zellkultur-Transwell-Einsätze mit 3 μm-Poren für 24-Well-Platten ausgesät. Fügen Sie Transwell-Insert-Replikate für jede gewünschte Versuchsbedingung sowie nicht infizierte Kontrollen hinzu, um mögliche Kontaminationen zu überwachen.<ol><li>Füllen Sie in einer 24-Well-Platte zur Aufnahme von Transwell-Einsätzen die gewünschte Anzahl von Sammelmulden mit 1 ml TCM + Antibiotika.</li>
		<li>Legen Sie in jede Vertiefung einen Transwell-Einsatz.</li>
		<li>Säen Sie diese Einsätze mit 1 x 105 T84-Zellen, die in 500 μL TCM + Antibiotika suspendiert sind. Quantifizieren Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer mit Trypanblaufärbung oder einem automatisierten Zellzähler17.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Transwell-Platten mit den gesäten Einsätzen unter den gleichen Bedingungen, unter denen die Zellen gezüchtet wurden.</li>
		<li>Mit Lichtmikroskopie wird überprüft, ob die Monoschichten nach der Aussaat des Einsatzes, etwa 48 Stunden nach der Aussaat, zu konfluieren begonnen haben.</li>
	</ol></li>
	<li>Messen und notieren Sie alle 2 Tage nach der Aussaat den transepithelialen elektrischen Widerstand (TEER) mit einem epithelialen Volt/Ohm-Messgerät (EVOM), um den Reifegrad der Monoschicht zu beurteilen. Sobald die Einsätze einen TEER von mindestens 1.000 Ω·cm2 erreichen, gelten sie als bereit für den Assay18. HINWEIS: Die Einsätze benötigen in der Regel 7-10 Tage, um diesen TEER nach der Aussaat zu erreichen. Die T84-Zellen zeigen unter Lichtmikroskopie eine 100%ige Konfluenz, sobald dieser Widerstand erreicht ist.<ol><li>Lagern Sie die EVOM Sonde mit den Elektroden in 0,15 M KCl getaucht, wenn sie nicht verwendet wird.</li>
		<li>Vor der Messung des TEER dekontaminieren Sie die Elektrodensonde, indem Sie sie 10-15 Minuten lang in ein konisches 50-ml-Röhrchen mit 70 % Ethanol eintauchen. Entfernen Sie die Sonde, schütteln Sie das überschüssige Ethanol ab und lassen Sie es 10 Minuten lang im BSC an der Luft trocknen. Behalten Sie die Röhre mit Ethanol bei.</li>
		<li>Testen Sie das EVOM und die Sonde, indem Sie die trockene dekontaminierte Sonde in eine sterile Vertiefung mit 1 ml TCM + Antibiotika mit einem sterilen Einsatz im Inneren mit 500 μl TCM + Antibiotika legen. Stellen Sie sicher, dass der VOM Messwert <200 Ω beträgt. Notieren Sie diesen leeren Wert, um ihn in den späteren Widerstandsberechnungen zu verwenden, die in Schritt 1.3.6 beschrieben werden.</li>
		<li>Entfernen Sie die Sonde aus dem Röhrchen TCM + Antibiotika. Bewahren Sie dieses Röhrchen für die Aufbewahrung der Sonde während des gesamten Experiments auf.</li>
		<li>Senken Sie die Sonde vorsichtig in den ersten Einsatz mit der langen Elektrode in der Auffangmulde und der kurzen Elektrode im Inneren des Einsatzes. Lassen Sie die lange Elektrode den Boden der Sammelmulde berühren, aber drücken Sie nicht nach unten, da dies die epitheliale Monoschicht stören kann.</li>
		<li>Wiederholen Sie diesen Vorgang, um den Widerstand in Ohm (Ω) für jeden Einsatz zu messen und aufzuzeichnen. Wenn Sie fertig sind, dekontaminieren Sie die Sonde im Ethanol, indem Sie sie für weitere 10-15 Minuten eintauchen. Bringen Sie dann die dekontaminierte Sonde zur Lagerung zurück in die KCl-Lösung. Der in Schritt 1.3.3 ermittelte Blindwiderstand wird von jedem Wert abgezogen, der von jedem Einsatz mit T84-Zellen erhalten wird. Multiplizieren Sie den resultierenden Widerstand (Ω) für jeden Einsatz mit der Fläche der Unterseite jedes Einsatzes (cm 2), um die endgültige TEER-Messung (Ω·cm2) zu erhalten.</li>
		<li>Sobald das TEER mindestens 1.000 Ω·cm2 erreicht, ist die epitheliale Monoschicht ausgereift und bereit für Infektionstests.</li>
	</ol></li>
	<li>Wenn das TEER reift, versorgen Sie die Zellen alle 1-2 Tage mit frischem Medium.<ol><li>In einer neuen 24-Well-Platte 1 ml TCM + Antibiotika zu einer Vertiefung für jede vorbereitete Saateinlage hinzufügen.</li>
		<li>Mit sterilen Pinzetten die Einsätze vorsichtig in die neu aufgefüllten Brunnen geben.</li>
		<li>Ersetzen Sie die Medien in den Einsätzen.<ol><li>Entfernen Sie das alte Medium aus den Einsätzen, indem Sie die Platte kippen und mit einem hauseigenen Vakuumsauger das Medium mit einer Pipettenspitze an der Seite des Einsatzes vorsichtig entfernen. Der Absauger ermöglicht die Regulierung der schwachen Saugleistung, um die Störung der Zellen zu verhindern. Lassen Sie die Pipettenspitze nicht die Unterseite des Einsatzes berühren, da dies die sich entwickelnde epitheliale Monoschicht stört.</li>
			<li>Fügen Sie 500 μL TCM + Antibiotika zu den Einsätzen hinzu. Visualisieren Sie die Monoschicht mit Lichtmikroskopie, um zu überprüfen, ob sie intakt bleibt.</li>
		</ol></li>
		<li>Messen Sie alle 1-2 Tage den TEER an jedem Einsatz, wie oben in den Schritten 1.3.2-1.3.6 beschrieben.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Vorbereitung der T84-Zellen 1 Tag vor dem Experiment mit TCM ohne Antibiotika
<ol><li>Messen und notieren Sie den TEER am Tag vor dem Experiment.</li>
	<li>Ersetzen Sie die TCM auf die gleiche Weise wie bei der vorherigen Zellvorbereitung und -erhaltung. Zur Vorbereitung auf die Infektion wird jedoch TCM ohne Antibiotika eingesetzt (1 ml in der Plattenmulde und 500 μl im Einsatz).</li>
</ol>3. E. coli-Kulturen (begonnen 1 Tag vor dem Experiment)
VORSICHT: Verwenden Sie Vorsichtsmaßnahmen der Biosicherheitsstufe 2 (BSL-2), wenn Sie mit pathogenen klinischen E. coli-Stämmen arbeiten.
<ol><li>Nehmen Sie ein markiertes konisches 15-ml-Röhrchen mit 5 ml steriler Lysogenie-Bouillon (LB) und verwenden Sie eine sterile Schleife, um die Brühe mit einer Kolonie eines Bakterienstamms (E. coli) zu impfen. Wiederholen Sie diesen Vorgang und erstellen Sie ein Übernacht-Kulturröhrchen für jede zu testende Sorte.</li>
	<li>Die Übernachtkultur bei gelösten Deckeln der Röhrchen in einem Inkubatorschüttler (250 U/min, 37 °C) inkubieren.</li>
</ol>4. Vorbereitung des E. coli-Inokulums, der Epithelzellen und -materialien (am Morgen des Experiments)
HINWEIS: Verwenden Sie ab diesem Zeitpunkt TCM ohne auf 37 °C erwärmte Antibiotika.
<ol><li>Fügen Sie 250 μL aus jeder LB-Kultur über Nacht zu 25 ml TCM ohne Antibiotika in einem konischen 50-ml-Röhrchen hinzu (eines pro einzelnen Stamm). Halten Sie die Kappen der Röhrchen gelockert. Legen Sie diese neuen Kulturröhrchen mit den gleichen Einstellungen (250 U/min, 37 °C) für genau 2 h in den Shaker. Führen Sie die verbleibenden Teilschritte aus, während Sie warten.</li>
	<li>Messen Sie den TEER an jedem Einsatz, wie in den Schritten 1.3.2 bis 1.3.6 beschrieben. Notieren Sie diese als TEERs zum Zeitpunkt (t) = 0 h.</li>
	<li>Bewegen Sie die Einsätze in Vertiefungen in einer neuen Platte und wechseln Sie das Medium mit der in Schritt 1.4.3 beschriebenen Technik. Füllen Sie dieses Mal die neuen Auffangbrunnen mit 500 μL TCM ohne Antibiotika und füllen Sie die Einsätze mit 400 μL TCM ohne Antibiotika. Bewahren Sie die Einsätze bis zum Zeitpunkt der Infektion im Gewebekulturinkubator auf.</li>
	<li>Legen Sie eine ausreichende Anzahl von quadratischen LB-Agarplatten vor, um sich für eine spätere Beschichtung und bakterielle Quantifizierung auf Raumtemperatur (RT) zu erwärmen.</li>
</ol>5. Impfung der Zellen (Beginn des Experiments)
<ol><li>Nach genau 2 h die morgendlichen Bakterienkulturen aus dem Shaker nehmen und 10 min (1.900 x g, 4 °C) zentrifugieren. HINWEIS: Halten Sie für alle folgenden Schritte alle Bakteriensuspensionen auf Eis, um das Wachstum zu minimieren.</li>
	<li>Resuspendieren Sie das Bakterienpellet in TCM ohne Antibiotika. Verwenden Sie ein Spektralphotometer, um die optische Dichte (OD) auf 0,7-0,9 einzustellen, und verdünnen Sie sie weiter mit TCM ohne Antibiotika auf eine Konzentration von 1 x 106 koloniebildenden Einheiten (KBE)/ml (ca. 1:100 Verdünnung). Verwenden Sie diese Bakteriensuspension, um jeden Einsatz mit 1 x 105 KBE pro 100 μL Volumen zu infizieren.</li>
	<li>Beschriften Sie die Transwell-Platte und infizieren Sie jeden Einsatz mit 100 μL des OD-adjustierten Inokulums (insgesamt 1 x 105 KBE pro Einsatz). Der Test hat nun begonnen. Notieren Sie sich die Uhrzeit und notieren Sie sie als t = 0 h.</li>
	<li>Zur Quantifizierung der KBE/ml unter Verwendung der Spurverdünnungsmethode wird die Inokulumbakteriensuspension plattiert, wobei 10 μL-Aliquots auf quadratische LB-Agarplattenplattiert werden 19.</li>
</ol>6. Quantifizierung der Transzytose
<ol><li>Füllen Sie alle 30 Minuten nach der Impfung neue Vertiefungen mit 500 μL TCM ohne Antibiotika. Übertragen Sie die Einsätze in diese neuen Vertiefungen mit einer anderen sterilen Pinzette für jeden Bakterienstamm.</li>
	<li>Sammeln Sie das Medium aus der gebrauchten Auffangmulde für jeden Einsatz in separat beschrifteten Röhrchen. Legen Sie diese Röhrchen auf Eis. Geben Sie die Transwell-Platten zwischen den Zeitpunkten in den Inkubator zurück.</li>
	<li>Kombinieren Sie für jede Einlage die gesammelten Medien aus t = 0,5 h, t = 1 h, t = 1,5 h und t = 2 h und Wirbel kurz. Die gesammelten Medien werden auf LB-Agarplatten unter Verwendung der Track-Verdünnungsmethode beschichtet, um die Menge der in den ersten 2 h des Experiments transzytosierten Bakterien zu quantifizieren. HINWEIS: Wenn die Bakterien alle 30 Minuten entnommen und auf Eis gehalten werden, wird sichergestellt, dass das Bakterienwachstum in den Auffangbrunnen minimiert wird und Messungen an überwiegend transzytosierten Bakterien durchgeführt werden.</li>
	<li>Legen Sie die markierten LB-Agarplatten zur Spurverdünnung in den Bakterieninkubator bei 37 °C ohne zusätzlichesCO2 und bringen Sie die T84-Transwell-Platte in den Gewebekulturinkubator zurück.</li>
	<li>Bei t = 4 h wiederholen Sie Schritt 6.3, indem Sie die gesammelten Medien aus t = 2,5 h, t = 3 h, t = 3,5 h und t = 4 h kombinieren.</li>
	<li>Bei t = 6 h wiederholen Sie Schritt 6.3, indem Sie die gesammelten Medien aus t = 4,5 h, t = 5 h, t = 5,5 h und t = 6 h kombinieren. Zusätzlich werden bei t = 6 h die Medien aus den Kontrolltöpfen plattiert.</li>
</ol>7. Ende des Experiments
<ol><li>Messung und Aufzeichnung des TEER am Ende des Experiments, t = 6 h. Verwenden Sie das in den Schritten 1.3.2-1.3.6 beschriebene Verfahren.</li>
	<li>Dekontamination der Sonde, indem Sie sie für 10-15 min in 70% Ethanol tauchen. Entsorgen Sie die Einsätze oder speichern Sie sie für weitere Anwendungen, falls gewünscht. Lassen Sie die LB-Agarplatten über Nacht inkubieren und desinfizieren und/oder entsorgen Sie alle anderen verwendeten Materialien.</li>
	<li>Nach der Inkubation über Nacht werden die Bakterienkolonien manuell auf den LB-Platten der Spurverdünnung gezählt, um die Inokulummenge und die Menge an E. coli-Transzytose zu bestimmen. Stellen Sie sicher, dass die Kontrollplatten kein Bakterienwachstum aufweisen.</li>
</ol>

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<li>Shiou, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erythropoietin+protects+intestinal+epithelial+barrier+function+and+lowers+the+incidence+of+experimental+neonatal+necrotizing+enterocolitis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Erythropoietin protects intestinal epithelial barrier function and lowers the incidence of experimental neonatal necrotizing enterocolitis.</a> Journal of Biological Chemistry. 286 (14), 12123-12132 (2011).</li>
<li>Newburg, D. S., Ko, J. S., Leone, S., Nanthakumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+milk+oligosaccharides+and+synthetic+galactosyloligosaccharides+contain+3%E2%80%99-%2C+4-%2C+and+6%27-galactosyllactose+and+attenuate+inflammation+in+human+T84%2C+NCM-460%2C+and+H4+cells+and+intestinal+tissue+ex+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Human milk oligosaccharides and synthetic galactosyloligosaccharides contain 3’-, 4-, and 6'-galactosyllactose and attenuate inflammation in human T84, NCM-460, and H4 cells and intestinal tissue ex vivo.</a> Journal of Nutrition. 146 (2), 358-367 (2016).</li>
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<li>Raut, B., Chen, L. J., Hori, T., Kaji, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+add-on+EVOM%28%28R%29%29+device+for+real-time+transepithelial%2Fendothelial+electrical+resistance+measurements+in+multiple+transwell+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">An open-source add-on EVOM((R)) device for real-time transepithelial/endothelial electrical resistance measurements in multiple transwell samples.</a> Micromachines. 12 (3), 282(2021).</li>
<li>McCarthy, A. J., Stabler, R. A., Taylor, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+identification+by+transposon+insertion+sequencing+of+Escherichia+coli+K1+genes+essential+for+in+vitro+growth%2C+gastrointestinal+colonizing+capacity%2C+and+survival+in+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">Genome-wide identification by transposon insertion sequencing of Escherichia coli K1 genes essential for in vitro growth, gastrointestinal colonizing capacity, and survival in serum.</a> Journal of Bacteriology. 200 (7), 00698(2018).</li>
<li>Sayoc-Becerra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+JAK-inhibitor+tofacitinib+rescues+human+intestinal+epithelial+cells+and+colonoids+from+cytokine-induced+barrier+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Inflammatory+Bowel+Diseases%22%5BJournal%5D)">The JAK-inhibitor tofacitinib rescues human intestinal epithelial cells and colonoids from cytokine-induced barrier dysfunction.</a> Inflammatory Bowel Diseases. 26 (3), 407-422 (2020).</li>
</ol>

Diese Methode leitet sich von Techniken ab, die in der Gastroenterologie und bei Infektionskrankheitenverwendet werden 20. In-vitro-Modelle der intestinalen Epithelbarriere wurden verwendet, um die Mechanismen aufzuklären, durch die die luminalen Gehalte mit dieser relevanten Komponente der angeborenen Immunität interagieren 6,8. Die Wirt-Pathogen-Interaktionen von invasiven neonatalen E. coli wurden auch separat durch ge...

Escherichia coli ist die häufigste Ursache für eine früh einsetzende Sepsis bei Neugeborenen 1,2,3. Die Sterblichkeitsrate der neonatalen E. coli-Bakteriämie kann 40% erreichen, und Meningitis ist eine mögliche Komplikation, die mit schweren neurologischen Entwicklungsstörungen einhergeht2. Die Aufnahme von mütterlichen E. coli-Stämmen durch das Neugeborene kann zu neonataler Bakteriämie führen; Dieser Prozess wurde in Tiermodellenrepliziert 2,4. Einmal eingenommen, wandern pathogene Bakterien aus dem neonatalen Darmlumen über die Darmbarriere und gelangen in den Blutkreislauf, was zu einer Sepsis führt. Neonatale invasive E. coli-Stämme, die Bakteriämien produzieren, unterscheiden sich in ihrer Fähigkeit, in Darmepithelzellen einzudringen 1,5. Ihre Fähigkeit, das Darmepithel nach der Invasion zu transzytieren, ist jedoch nicht vollständig charakterisiert.
Dieses intestinale Transzytosemodell ist eine nützliche In-vitro-Methode, um die bakterielle Passage durch das Darmepithel zu emulieren. Das übergeordnete Ziel der in diesem Manuskript vorgestellten Methoden ist es, die Fähigkeit von neonatalen E. coli-Isolaten zu vergleichen, das Darmepithel zu transzytieren. Das hier beschriebene Modell verwendet T84-Zellen, die immortalisierte humane intestinale Adenokarzinomzellen 6,7 sind. T84-Zellen werden auf einer semipermeablen Membran mit zwei getrennten Kompartimenten zum Zusammenfluss gezüchtet. Der Grund für die Anwendung dieser Technik ist, dass diese Darmzellen, wie in vivo geschehen, polarisieren und reife Tight Junctions entwickeln 6,8. Die Seite, die mit der Membran in Kontakt kommt, wird zur basalen Seite. Die gegenüberliegende Seite der Zellen wird zur apikalen Seite und ähnelt dem Darmlumen, wo aufgenommene Krankheitserreger haften und eindringen. Die Transwell-Membran ist durchlässig für Bakterien, aber die polarisierten Darmzellen bilden enge Verbindungen, die die bakterielle parazelluläre Bewegung beeinträchtigen9. Somit bietet diese Methode den Vorteil einer kontrollierten In-vitro-Umgebung, in der eine menschliche Zelllinie verwendet wird, um den Prozess der bakteriellen Transzytose, einschließlich des transzellulären Weges, zu untersuchen. Während es andere Methoden gibt, um die Transzytose von Bakterien über das Darmepithel zu untersuchen, bietet die hier vorgestellte Transwell-Methode eine größere Leichtigkeit und Zugänglichkeit. Es stehen alternative Techniken zur Verfügung, z. B. unter Verwendung von Ex-vivo-Proben, die in Ussing-Kammersystemen eingerichtet wurden. Sie verwenden jedoch Gewebeproben, die möglicherweise nicht leicht zugänglich sind, insbesondere wenn die Forschung beabsichtigt, die menschliche Physiologie zu untersuchen10. Intestinale Organoide stellen ein weiteres Beispiel für eine In-vitro-Alternative zur Untersuchung von Wirt-Bakterien-Interaktionen dar11. Während organoide Monoschichten auch im Transwell-System verwendet werden können, um bakterielle Transzytose zu untersuchen, erfordern sie die Isolierung und das Wachstum von Stammzellen und die Verwendung spezifischer Wachstumsfaktoren, um die Differenzierung zu induzieren12. Daher ist ihre Verwendung zeitaufwendiger und mit höheren Kosten verbunden als die in diesem Manuskript beschriebene Transwell-Methode.
Die Beurteilung der bakteriellen Passage durch das Darmepithel mit diesem In-vitro-Transwell-System wurde erfolgreich für verschiedene Krankheitserreger durchgeführt. Diese Studien haben den Nutzen des Transwell-Systems unter Verwendung von T84-Zellen gezeigt, um die Transzytose von Bakterien über das polarisierte Darmepithel zu charakterisieren13,14,15. Die Anwendung dieser Transwell-Methode zum Vergleich der Transzytosefähigkeit von Bakteriämie erzeugenden neonatalen E. coli-Stämmen wurde jedoch nicht detailliert beschrieben. Dieses Manuskript bietet anderen Forschern ein Standard-Transwell-Protokoll, das zuverlässig und einfach zu bedienen ist und keine zu teuren Ressourcen erfordert.
Um die Fähigkeit neonataler invasiver E. coli-Stämme zur Transzytose des Darmepithels zu vergleichen, kann die apikale Seite der intestinalen Epithelmonoschicht mit einer bekannten Anzahl von Bakterienzellen infiziert werden. Nach der Inkubation kann das Medium auf der basalen Seite des Epithels gesammelt und die Bakterien quantifiziert werden, um die Menge der bakteriellen Transzytose im Laufe der Zeit zu bestimmen. In diesem Manuskript werden die vorgestellten Methoden verwendet, um die Transzytosefähigkeit von klinischen E. coli-Stämmen von Neugeborenen zu untersuchen, die von Neugeborenen mit Bakteriämie hospitalisiert wurden. Die Einschlusskriterien für die Auswahl dieser neonatalen klinischen Isolate für Transzytosestudien wurden bereits veröffentlicht 1,2,16. Wenn diese Methode mit verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt wird, können ihre Transzytosefähigkeiten verglichen werden. Durch diesen Prozess liefert das intestinale Transzytosemodell wertvolle Daten zur Charakterisierung der Virulenzfaktoren von E. coli, die zu dem mehrstufigen Prozess beitragen, der in der Entwicklung einer neonatalen Bakteriämie gipfelt.

<table><tbody><tr><td>10.000 U/ml Penicillin/Streptomycin-Gemisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-140-122</td><td></td></tr><tr><td>15 mL sterile konische Röhrchen</td><td>MidSci</td><td>C15B</td><td></td></tr><tr><td>2 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Avant</td><td>AVSS2000</td><td></td></tr><tr><td>50 mL sterile konische Röhrchen aus Polypropylen</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Aspirator</td><td>Corning</td><td>4930</td><td></td></tr><tr><td>Biosicherheitswerkbänke</td><td>Labconco</td><td>30441010028343</td><td>Drei davon werden in der Methode verwendet: eine für die Arbeit mit sterilem Gewebe, eine für die Arbeit mit infiziertem Gewebe und eine für die Arbeit mit Bakterien.</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>Legend RT</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Impfösen</td><td>Fisherbrand</td><td>22363605</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965-084</td><td></td></tr><tr><td>Epithel Volt/Ohm Meter</td><td>World Precision Instruments</td><td>EVOM2</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Fisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Ham's F-12 Nährstoffmischung</td><td>Gibco</td><td>11765-047</td><td></td></tr><tr><td>Hämazytometer</td><td>Sigma Aldrich, Bright Line</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatorschüttler</td><td>New Brunswick</td><td>Innova 4080</td><td></td></tr><tr><td>Inkubatoren</td><td>Thermo Scientific</td><td>51030284</td><td>Drei davon werden in der Methode verwendet: einer für die sterile Gewebekultivierung, einer für die Kultivierung von infiziertem Gewebe und einer für die bakterielle Inkubation.</td></tr><tr><td>Lysogenie-Bouillon</td><td>Difco</td><td>244610</td><td></td></tr><tr><td>Lysogen-Bouillon-Agar</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49101</td><td></td></tr><tr><td>Nikon Eclipse TS2R Mikroskop</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer</td><td>Unico</td><td>1100RS</td><td></td></tr><tr><td>T84 Darmzellen</td><td>Amerikanische Gewebekultur-Sammlung</td><td>CCL248</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekultureinsätze, mit Polyethylen-Trephthalat-Membran, 3 & Mikro; m Poren,&nbsp; 24-Well-Format</td><td>Falcon</td><td>353096</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturplatte, 24 Wells</td><td>Falcon</td><td>353504</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau-Färbung</td><td>Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr></tbody></table>

beurteilung der intestinalen transzytose von neonatalen escherichia coli bacteremia-isolaten

Assessment of Intestinal Transcytosis of Neonatal Escherichia coli Bacteremia Isolates

Neugeborene nehmen mütterliche E. coli-Stämme auf, die ihren Darmtrakt um den Zeitpunkt der Geburt besiedeln. E. coli-Stämme mit der Fähigkeit, über den Darm zu translozieren, dringen in den Blutkreislauf des Neugeborenen ein und verursachen lebensbedrohliche Bakteriämie. Die hier vorgestellte Methodik verwendet polarisierte intestinale Epithelzellen, die auf semipermeablen Einsätzen gezüchtet wurden, um die Transzytose von neonatalen E. coli-Bakteriämie-Isolaten in vitro zu beurteilen. Diese Methode nutzt die etablierte T84-Darmzelllinie, die die Fähigkeit hat, zu Konfluenz zu wachsen und enge Verbindungen und Desmosomen zu bilden. Nach Erreichen der Konfluenz entwickeln reife T84-Monoschichten einen transepithelialen Widerstand (TEER), der mit einem Voltmeter quantifiziert werden kann. Die TEER-Werte korrelieren umgekehrt mit der parazellulären Permeabilität extrazellulärer Komponenten, einschließlich Bakterien, über die intestinale Monoschicht. Die transzelluläre Passage von Bakterien (Transzytose) hingegen verändert die TEER-Messungen nicht notwendigerweise. In diesem Modell wird die bakterielle Passage durch die intestinale Monoschicht bis zu 6 h nach der Infektion quantifiziert, und wiederholte Messungen von TEER werden durchgeführt, um die parazelluläre Permeabilität zu überwachen. Darüber hinaus erleichtert diese Methode den Einsatz von Techniken wie der Immunfärbung, um die strukturellen Veränderungen in Tight Junctions und anderen Zell-zu-Zell-Adhäsionsproteinen während der bakteriellen Transzytose über das polarisierte Epithel zu untersuchen. Die Verwendung dieses Modells trägt zur Charakterisierung der Mechanismen bei, durch die neonatale E. coli durch das Darmepithel transzytieren, um Bakteriämie zu erzeugen.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64241/64241fig01.jpg"> Abbildung 1: T84 TEER im Zeitverlauf. Wenn die T84-Zellschicht auf dem Einsatz reift, steigt der elektrische Widerstand der Monoschicht. Bei einem TEER von mindestens 1.000 Ω·cm2 ist die Zellschicht ausreichend entwickelt, um den parazellulären Bakterientransport zu verringern und die Messung des primär transzellulären Bakterientransits z...

Escherichia coli verursacht Sepsis bei Neugeborenen, die die Bakterien um den Zeitpunkt der Geburt aufnehmen. Der Prozess, der an der Fähigkeit von E. coli beteiligt ist, vom Darmtrakt in den Blutkreislauf zu gelangen, ist kaum verstanden. Dieses In-vitro-Modell bewertet die Fähigkeit von E. coli-Stämmen, durch die Darmepithelzellen zu wandern.

Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

Newborns ingest maternal E. coli strains that colonize their intestinal tract around the time of delivery. E. coli strains with the ability to translocate ...

Diese Methode ermöglicht es, die Transzytosefähigkeiten verschiedener ausgeglichener Stämme über polarisierte intestinale Epithelzellen mit reifen Verbindungen zu vergleichen. Dies ist eine relativ einfache Technik, die keinen großen Ressourcen- oder Zeitaufwand erfordert und es ermöglicht, einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der neonatalen invasiven E. coli-Erkrankung zu untersuchen. Josh Wheatley, ein wissenschaftlicher Mitarbeiter in meinem Labor, wird das Verfahren demonstrieren.In einer Biosicherheitswerkbank werden T84-Zellen in Polyethylenterephthalat-Membran-Zellkultur-Transwell-Einsätze geimpft. In einer 24-Well-Platte, die für die Aufnahme von Transwell-Einsätzen ausgelegt ist, füllen Sie die gewünschte Anzahl von Auffangbecken mit einem Milliliter Gewebekulturmedium oder TCM mit Antibiotika. Säen Sie diese Einsätze mit einmal 10 bis fünften T84-Zellen, die in 500 Mikrolitern TCM mit Antibiotika suspendiert sind.Etwa 48 Stunden nach der Aussaat wird mit Lichtmikroskopie überprüft, ob die Monoschichten begonnen haben, zu konfluieren. Messen und notieren Sie alle zwei Tage nach der Aussaat den transepithelialen elektrischen Widerstand oder TEER mit einem Epithelvolt

assessment-intestinal-transcytosis-neonatal-escherichia-coli

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Islam, A., et al., Bewertung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bakteriämie-Isolaten. J. Vis. Exp. (2023)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Beurteilung der Transzytose von neonatalen Escherichia coli über intestinale Epithelmonoschichten unter Verwendung von Transwell-Inserts, elektrischer Widerstandsmessung und bakterieller Quantifizierung.

Beurteilung der Transzytose von E. coli über intestinale Epithelmonoschichten

Quelle: Taylor, M. N., et.al. Verwendung von Einzelwurmdaten zur Quantifizierung der Heterogenität bei Caenorhabditis elegans-bakteriellen Interaktionen. J. Vis. Exp. (2022)Dieses Video zeigt die Exposition von keimfreien, altersangepassten Caenorhabditis elegans-Würmern gegenüber einem Bakterienstamm zur Darmbesiedlung. Sie erklärt die selektive Entfernung von nicht anhaftenden und externen Bakterien, wobei nur lebensfähige Bakterien, die am Darmepithel haften, zur Quantifizierung übrig...

Bewertung der bakteriellen Besiedlung im Darm bei keimfreien C. elegans

Quelle: Le, T. A. N. et al., Messung der Auswirkungen von Bakterien und Chemikalien auf die Darmdurchlässigkeit von Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019)Dieses Video demonstriert einen fluoreszenzbasierten Test zur Quantifizierung der Darmpermeabilität von C. elegans, der Pseudomonas aeruginosa ausgesetzt ist. Im Vergleich zu Kontrollen, die mit Escherichia coli gefüttert wurden, zeigen pathogen-behandelte Würmer eine erhöhte Fluorophor-Leckage in die Körperhöhle, was auf Schäden an der...

Beurteilung der Darmpermeabilität bei C. elegans nach bakterieller Exposition

Hier wird ein Verfahren für die Festlegung der systemischen Infektion in der neonatalen Ratten mit Kulturen von Escherichia coli K1 beschrieben. Diese nichtinvasive Vorgehensweise erlaubt Besiedlung des Magen-Darm-Trakt, die Translokation des Erregers in den systemischen Kreislauf, und das Eindringen des zentralen Nervensystems in den Plexus choroideus.

Nichtinvasive Modell Neuropathogenic Escherichia coli Infektion in der neonatalen Ratten

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen Kultur Enteroid oder Colonoid Monolagen, die intakten Barrierefunktion, Wirt epithelialen Mikrobiota Interaktionen auf die zelluläre und biochemische Ebene zu studieren.

Menschliche Colonoid Monolagen Wechselwirkungen zwischen Erreger, Kommensalen und Host Darmepithel zu studieren

Die Infektion von neonatalen Mäusen mit biolumineszierendem E. coli O1:K1:H7 führt zu einer septischen Infektion mit signifikanter Lungenentzündung und Lungenpathologie. Hier beschreiben wir Verfahren zur Modellierung und weiteren Untersuchung der neonatalen Sepsis unter Verwendung von längsinaler intravitaler Bildgebung parallel zur Aufzählung systemischer bakterieller Belastungen, entzündlicher Profilierung und Lungenhistopathologie.

Ein neonatales Bildgebungsmodell der gramnegativen bakteriellen Sepsis

Dieses Protokoll beschreibt ein in vitro Modell der nekrotisierenden Enterokolitis (NEC), das für mechanistische Studien zur Krankheitspathogenese verwendet werden kann. Es verfügt über einen mikrofluidischen Chip, der mit Darmenteroiden besät ist, die aus dem menschlichen Neugeborenendarm, Endothelzellen und dem Darmmikrobiom eines Neugeborenen mit schwerem NEC stammen.

Mikrofluidisches Modell der nekrotisierenden Enterokolitis unter Einbeziehung menschlicher neonataler Darmenteroide und eines dysbiotischen Mikrobioms

Frühgeburten (Entbindung &lt; 37. Woche) sind ein dringendes globales Gesundheitsproblem mit suboptimalen Präventions- und Behandlungsmöglichkeiten. Wir stellen ein Mausmodell der aufsteigenden vaginalen bakteriellen Infektion induzierten Frühgeburt vor und skizzieren, wie die daraus resultierende neonatale Morbidität und Mortalität analysiert werden kann.

Modellierung von aufsteigenden vaginalen Infektionen, Frühgeburten und neonataler Morbidität bei Mäusen

Dieser Artikel beschreibt: (1) die orale Abgabe von Testmolekülen an Neugeborenenmäuse bereits ab DOL 6; und (2) ex-vivo-Bewertung der Funktion der Colonepithelbarriere in Biopsien von DOL 10 bis zum Abstillen (DOL 20) Jungen durch Bewertung der parazellulären und transzellulären Permeabilität mit Ussing-Kammern.

Orale Gavage bei neonatalen Mauswelpen und funktionelle Beurteilung der Integrität der Darmbarriere mittels Ussing-Kammern

Die Studie präsentiert eine Methode zur in-vitro-Untersuchung bakterieller Infektionen unter Verwendung von Gewebestammzell-abgeleiteten Intestinalorganoiden. Das Protokoll beschreibt, wie man Organoide in zwei Dimensionen kultiviert und differenziert, sie mit adhärent-invasiven Escherichia coli infiziert und wichtige Werte bewertet, darunter das Durchbrechen der Epithelbarriere, die Bildgebung der Infektion und die Antwort der epithelialen RNA.

Eine zweidimensionale Organoidkultur auf Invasin- oder Basementmembranextrakt zur Untersuchung von Wirts-Bakterien-Interaktionen

Die Antibiotikaresistenz bei adhärent-invasiven Escherichia-coli-Stämmen stellt Herausforderungen bei der Beurteilung bakterieller Invasionen mit dem traditionellen Gentamicin-Schutztest dar. Eine verbesserte Methode zur quantitativen Bewertung der bakteriellen Invasion durch Aufzählung koloniebildender Einheiten und qualitativ durch die Visualisierung infizierter Zellen mittels Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie wird beschrieben.

Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung und Visualisierung der Escherichia-coli-Zellinvasion

Erfahren Sie, wie Sie die Transzytosefähigkeiten von Escherichia coli-Stämmen durch polarisierte intestinale Epithelzellen mit reifen Verbindungen vergleichen. Diese Methode untersucht einen wichtigen Schritt in der Pathogenese neonataler E.-coli-Invasion.

Beurteilung der intestinalen Transzytose von neonatalen Escherichia coli Bacteremia-Isolaten

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