Name: Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-07-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Erfahren Sie die Einzelmolekülbildgebung auf überfüllten Lipidmembranen mit smTIRF-Mikroskopie. Diese Methode ermöglicht die Analyse von Bindung, Diffusion und Assemblierung von Biomolekülen in dichten Umgebungen.

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Die Autoren danken Prof. Benjamin Schuler für die Weitergabe des Expressionsplasmids für das ClyA-Protein. Diese Arbeit wurde vom Human Frontier Science Program (RGP0047-2020) unterstützt.

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Hier demonstrieren wir Einzelmolekülexperimente an unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs), die eine überfüllte Umgebung für membraneingebettete Biomoleküle manifestieren. Die überfüllte Umgebung erzeugt einen ausgeschlossenen Volumeneffekt, der zur Verstärkung biomolekularer Reaktionen führt 1,2,39,40. Für das PEG-Lipidsystem, bei dem das Polymer primär das Volumen außerhalb der Doppelschich...

Zellmembranen sind sehr überfüllte und komplexe Systeme1. Molekulares Crowding kann einen erheblichen Einfluss auf die Diffusion membrangebundener Entitäten wie Protein und Lipide 2,3,4 haben. Ebenso werden bimolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen wie die Rezeptordimerisierung oder die Oligomerisierung von Membrankomplexen durch Crowding 5,6,7 beeinflusst. Die Art, Konfiguration und Konzentration von Crowdern kann die Membranbindung, Diffusivität und Protein-Protein-Interaktion auf verschiedene Weise steuern 8,9. Da die Kontrolle der Membranüberfüllung auf zellulären Membranen und die Interpretation ihres Einflusses auf eingebettete Biomoleküle eine Herausforderung darstellt, haben Forscher versucht, alternative In-vitro-Systeme zu etablieren10.
Ein beliebter Ansatz für künstliche überfüllte Membranen ist die Dotierung der Doppelschichtmembranen mit polymeren (wie Polyethylenglykol, PEG)-gepfropften Lipiden11,12. Während der Visualisierung der Protein- und Lipiddynamik auf unterstützten Lipiddoppelschichten (SLBs) schirmen diese Polymere die in die Membran eingebetteten Komponenten zusätzlich vom darunter liegenden negativ geladenen Substrat (z. B. Glas) ab, indem sie die Doppelschicht effektiv von der darunterliegenden Unterstützung wegheben. Durch Variation der Größe und Konzentration des Polymers kann man das Ausmaß der molekularen Verdrängung sowie seine Trennung vom zugrunde liegenden festen Träger13,14 kontrollieren. Dies ist eindeutig ein Vorteil gegenüber Lipiddoppelschichten, die auf festen Substraten ohne Polymerpolster15,16 gelagert werden, wo Transmembranbiomoleküle ihre Aktivität verlieren können17,18,19. Noch wichtiger ist, dass es uns ermöglicht, die überfüllte Umgebung der Zellmembran in vitro zu rekapitulieren, was für viele Membranprozesse entscheidend ist.
Oberflächengepfropfte Polymere auf Membranen unterliegen ebenfalls Änderungen in ihrer Konfiguration in Abhängigkeit von ihrer Pfropfdichte12. Bei geringen Konzentrationen verbleiben sie in einer entropisch gewundenen Konfiguration, einem sogenannten Pilz, über der Membranoberfläche. Mit zunehmender Konzentration beginnen sie zu interagieren und neigen dazu, sich abzuwickeln und auszudehnen, was schließlich zu einer dichten bürstenartigen Formation auf der Membran21 führt. Da der Übergang vom Pilz- zum Bürstenregime sehr heterogen ist und sich in schlecht charakterisierten Bedingungen des Polymers manifestiert, ist es wichtig, gut charakterisierte Bedingungen für das Gedränge auf polymergepfropften Membranen zu verwenden. Im Vergleich zu einer aktuellen Studie20 identifizieren und berichten wir überfüllte Membranzusammensetzungen, die den diffusiven Transport und die Aktivität von Transmembranbiomolekülen aufrechterhalten.
In diesem Protokoll diskutieren wir, wie PEGylierte Lipidmembranen erzeugt werden können, und geben Empfehlungen für PEG-Dichten, die Crowding in zwei verschiedenen Regimen der Polymerkonfiguration (nämlich Pilz und Bürste) nachahmen. Das Protokoll beschreibt auch die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichdatenerfassung und -analyse für Moleküle, die in diese überfüllten Membranen eingebettet sind. Zunächst beschreiben wir die gründlichen Reinigungsschritte, den Aufbau der Bildgebungskammer und die Erzeugung von PEG-SLBs. Zweitens liefern wir Details für die Einzelmolekülbindung, Partikelverfolgung und Photobleichexperimente. Drittens diskutieren wir i) die Extraktion der relativen Bindungsaffinitäten, ii) die Charakterisierung der molekularen Diffusion und iii) das Zählen von Untereinheiten in einer Proteinanordnung aus Filmen einzelner Moleküle auf der Membran.
Während wir dieses System mit Einzelmolekül-Bildgebung charakterisiert haben, ist das Protokoll für alle Membranbiophysiker nützlich, die daran interessiert sind, die Wirkung von Crowding auf biomolekulare Reaktionen auf Lipidmembranen zu verstehen. Insgesamt präsentieren wir eine robuste Pipeline zur Herstellung von überfüllten und unterstützten Lipiddoppelschichten, zusammen mit verschiedenen Einzelmolekül-Assays, die an ihnen durchgeführt werden, und den entsprechenden Analyseroutinen.

<table><tbody><tr><td>2,5 ml Spritzen</td><td>HMD Healthcare</td><td>Dispo Van, 2,5 ml Tuberkulin</td><td>Kunststoffspritze</td></tr><tr><td>Aceton</td><td>Finar Chemicals</td><td>10020LL025</td><td></td></tr><tr><td>Acrylplatte</td><td></td><td></td><td>2 mm dick</td></tr><tr><td>Acrylplatte</td><td>BigiMall</td><td></td><td>2 mm, Clear</td></tr><tr><td>Bath Sonicator</td><td>Branson</td><td>CPX-1800</td><td></td></tr><tr><td>Calciumchlorid</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma</td><td>528730</td><td>&nbsp; Cholesterin in HPLC-Qualität</td></tr><tr><td></td><td>Avanti</td><td>700100</td><td></td></tr><tr><td>Coplin Jar</td><td>Duran Wheaton Kimble</td><td>S6016</td><td>8 Slide Jar mit Glasabdeckglas</td></tr><tr><td></td><td>Deckgläser VWR</td><td>631-1574</td><td>24 mm X 50 mm</td></tr><tr><td>Cy3-DNA Strang</td><td>IDT</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTGGTT GGTGTGGTTGG-Cy3</td></tr><tr><td>Cyaninfarbstoff (Cy3)</td><td>Cytiva Life Sciences</td><td>PA23001</td><td></td></tr><tr><td>DiI</td><td>Invitrogen</td><td>D3911</td><td>Dil Stain (1,1'-Dioctadecyl-3,3,3',3'-tetramethylindocarbocyaninperchlorat ("DiI"; DiIC18(3)))</td></tr><tr><td>DNA Konnektor Strang 1</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>GCTGCTATTGCGTCCGTTTAGCT GGGGGAGTATTGCGGAGGAAGC T</td></tr><tr><td>DNA Konnektor Strang 2</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td>CGGACGCAATAGCAGCTCAG TCGGTCACAT</td></tr><tr><td>DNA Tocopherol</td><td>Strang Biomers</td><td></td><td>Toco-CCCAATGTGACCGACTGTGA</td></tr><tr><td>DOPE-PEG2000</td><td>Avanti</td><td>880130</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-[methoxy(Polyethylenglykol)-2000] (Ammoniumsalz)</td></tr><tr><td>Doppelseitiges Klebeband</td><td>3M</td><td>LF93010LE</td><td></td></tr><tr><td>Bohrer (diamantbeschichtet)</td><td></td><td></td><td>0,5 - 1 mm</td></tr><tr><td>Bohrmaschine</td><td>Dremel</td><td>220</td><td>Workstation</td></tr><tr><td>EMCCD</td><td>Andor</td><td>DU-897U-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzperlen</td><td>Invitrogen</td><td>F10720</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Blue Star</td><td></td><td>Micro Objektträger, PIC-1</td></tr><tr><td>Glasfläschchen</td><td>Sigma</td><td>854190</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Lobachemie</td><td>00182</td><td>30% Lösung, AR Grade</td></tr><tr><td>Labolene</td><td>Thermo-Fischer Wissenschaftlich</td><td></td>&<td>nbsp; Reinigungsmittel</td></tr><tr><td>Laser 532 nm</td><td>Coherent</td><td>Sapphire</td><td></td></tr><tr><td>Laser Cutter</td><td>Universal Laser Systems</td><td>ILS12.75</td><td></td></tr><tr><td>Lissamin Rhodamin DOPE</td><td>Avanti</td><td>810150</td><td>1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamin-N-(Lissamin Rhodamin B-Sulfonyl) (Ammoniumsalz)</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Finar Chemicals</td><td>30932LL025</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop</td><td>Olympus</td><td>IX81</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpuffer-Kochsalzlösung (PBS)1X</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Plasmareiniger</td><td>Harrick Plasma Inc</td><td>PDC-002</td><td></td></tr><tr><td>POPC</td><td>Avanti</td><td>850457</td><td>1-Palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholin</td></tr><tr><td>Programmierbare Spritzenpumpe</td><td>New Era Pump</td><td>Systems NE1010</td><td>Hochdruck-Spritzenpumpe</td></tr><tr><td>PTFE-Kappen</td><td>Sigma</td><td>27141</td><td></td></tr><tr><td></td><td>PTFE-Schlauch Cole-Parmer</td><td>WW-06417-21</td><td>Masterflex, 0,022" ID x 0,042" OD</td></tr><tr><td>Schwefelsäure</td><td>SD Feinchemikalien</td><td></td><td>98%, AR Grade</td></tr><tr><td>TIRF Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UPLAPO100XOHR</td><td></td></tr><tr><td>Vakuum-Exsikkator</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer</td><td>Tarsons</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

einzelmoleküldiffusion und assemblierung auf polymerüberfüllten lipidmembranen

Single-Molecule Diffusion and Assembly on Polymer-Crowded Lipid Membranes

Zellmembranen sind sehr überfüllte Umgebungen für biomolekulare Reaktionen und Signalübertragungen. Die meisten In-vitro-Experimente , die die Proteininteraktion mit Lipiden untersuchen, verwenden jedoch nackte Doppelschichtmembranen. Solche Systeme haben nicht die Komplexität der Verdrängung durch membraneingebettete Proteine und Glykane und schließen die damit verbundenen Volumeneffekte aus, die auf zellulären Membranoberflächen auftreten. Auch die negativ geladene Glasoberfläche, auf der die Lipiddoppelschichten gebildet werden, verhindert die freie Diffusion von Transmembran-Biomolekülen. Hier präsentieren wir eine gut charakterisierte Polymer-Lipid-Membran als Nachahmung für überfüllte Lipidmembranen. Dieses Protokoll verwendet Polyethylenglykol (PEG)-konjugierte Lipide als generalisierten Ansatz für den Einbau von Crowdern in die unterstützte Lipiddoppelschicht (SLB). Zunächst wird ein Reinigungsverfahren der mikroskopischen Objektträger und Deckgläser zur Durchführung von Einzelmolekülexperimenten vorgestellt. Als nächstes werden Methoden zur Charakterisierung der PEG-SLBs und zur Durchführung von Einzelmolekülexperimenten der Bindung, Diffusion und Assemblierung von Biomolekülen mittels Einzelmolekül-Tracking und Photobleaching diskutiert. Schließlich zeigt dieses Protokoll, wie die Nanoporenanordnung des bakteriellen porenbildenden Toxins Cytolysin A (ClyA) auf überfüllten Lipidmembranen mit Einzelmolekül-Photobleichanalyse überwacht werden kann. MATLAB-Codes mit Beispieldatensätzen sind ebenfalls enthalten, um einige der gängigen Analysen wie Partikelverfolgung, Extraktion von Diffusionsverhalten und Untereinheitenzählung durchzuführen.

Überwachung der Bindung von ClyA-Protein an PEGylierte Membranen Nach Schritt 4.5 wird die Bindungskinetik geschätzt, indem die Anzahl der Partikel, die sich im Laufe der Zeit an die Membranoberfläche binden, aufgetragen wird (Video 1). Wenn das ClyA-Protein an eine Membran mit 5 Mol-% PEG2000-Lipiden bindet, nimmt die Partikeldichte zu und erreicht die Sättigung (Abbildung 5). Eine exponentielle Zerfallsanpassung an die gebundenen Teilchen (Cyankreise) e...

Hier wird ein Protokoll zur Durchführung und Analyse der Bindung, Mobilität und Assemblierung einzelner Moleküle auf künstlichen überfüllten Lipidmembranen unter Verwendung der Einzelmolekül-Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie (smTIRF) vorgestellt.

Einzelmoleküldiffusion und Assemblierung auf polymerüberfüllten Lipidmembranen

Cellular membranes are highly crowded environments for biomolecular reactions and signaling. Yet, most in vitro experiments probing protein interaction ...

Zellmembranen sind aufgrund des Vorhandenseins eingebetteter Proteine und Zucker stark überfüllt. Wir demonstrieren Einzelmolekül-Bildgebung an synthetischen überfüllten Lipiddoppelschichten. Diese Plattform ist nützlich, um die Auswirkungen von Crowding auf biomolekulare Reaktionen der Membran auf molekularer Ebene zu untersuchen.Das Protokoll erklärt die Analyse der Bindung, Diffusion und Assemblierung von Membranbiomolekülen. Der Erfolg des Experiments hängt von der rigorosen Reinigung des Substrats, der Vermeidung von Schäden an der Doppelschicht und der Aufrechterhaltung eines hohen Signal-Rausch-Verhältnisses bei der Einzelmolekülbildgebung ab. Das Verfahren demonstrieren mir Aditya Upasani und Vishwesh Haricharan Rai, Doktoranden aus dem Labor.Legen Sie zunächst den plasmabehandelten Acrylobjektträger auf sauberes Seidenpapier. Ziehen Sie das doppelseitige lasergeschnittene Klebeband ab und kleben Sie es auf den Objektträger. Flachen Sie das Band mit einer Pipettenspitze, um ein Auslaufen von einem Kanal zum anderen zu verhindern.Schließen Sie die Kammer, indem Sie den plasmabehandelten Deckschlitz auf den geklebten Objektträger legen. Drücken Sie mit einer Pipettenspitze vorsichtig auf die abgeklebten Bereiche, um den Kanal wasserdicht zu machen. Bei Verwendung von Glasobjektträgern die Kanten mit Epoxidharz abdichten.Lagern Sie die vorbereiteten mikrofluidischen Bildgebungskammern für ein bis zwei Wochen unter getrockneten Bedingungen. Man nimmt eine Glasdurchstechflasche, die mit Piranha-Lösung vorgereinigt wurde, und fügt Chloroformlösung aus POPC und DOPE-PEG (2000) in der gewünschten Molfraktion von PEG 2000-Lipiden hinzu, um nach Zugabe des Puffers die endgültige Lipidkonzentration von drei Millimol zu erhalten. Ebenso können andere Membranzusammensetzungen von Lipiden hergestellt werden.Als nächstes trocknen Sie das Chloroform aus der Durchstechflasche mit einem sanften Stickstoffstrom mit einem kleinen Wirbel, so dass die gewünschten Lipide gleichmäßig auf der Oberfläche der Durchstechflasche beschichtet sind. Entfernen Sie Restchloroform, indem Sie die Durchstechflasche eine Stunde lang in einem Vakuum-Exsikkator aufbewahren. Dann einen Milliliter PBS in die Durchstechflasche geben und über Nacht bei 37 Grad Celsius inkubieren.Nach der Inkubation über Nacht die Durchstechflasche ein bis zwei Minuten lang vorsichtig vorziehen, bis die Lösung trüb und milchig wird. Nun werden 100 Mikroliter dieser Lösung in ein kleines 500 Mikroliter Zentrifugenröhrchen überführt. Um kleine unilamellare Vesikel von 50 bis 100 Nanometern Durchmesser zu erzeugen, wird die Lösung etwa eine Stunde lang in einem Badesonikator beschallt.Am Ende der Beschallung wird die Lösung klar, wenn die Lösung noch trüb ist, dann für weitere 30 Minuten beschallen. Dann fügen Sie den beschallten Vesikeln Calciumchlorid bis zu einer Endkonzentration von 30 Millimolar in der Lipidlösung hinzu. Schneiden Sie eine Mikropipettenspitze ab, um die Probenlösung so zu injizieren, dass sie fest in das Loch passt.Mischen Sie die Lipidlösung und injizieren Sie sie durch eines der Löcher in der Bildgebungskammer. Wischen Sie die überschüssige Lösung, die aus der Kammer kommt, mit sauberem Tuch ab, um die Kontamination benachbarter Kanäle zu verhindern. Bereiten Sie eine Befeuchtungskammer vor, indem Sie nasses Tuch am Ende eines 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchens platzieren.Legen Sie den Schieber in die Röhre und schließen Sie die Schlauchkappe. Legen Sie das Rohr seitlich und lassen Sie diese Baugruppe 90 Minuten in einer befeuchteten Kammer, vorzugsweise in einem Inkubator bei 37 Grad Celsius. Waschen Sie die Kammer gründlich mit einer großen Menge PBS-Puffer, um zu verhindern, dass während des Waschens Luftblasen in die Kammer gelangen, da dies zu Defekten in der Membran führen kann.Bevor Sie ein Experiment zur Mobilität und Montage durchführen, richten Sie das TIRF-Mikroskop aus, indem Sie eine fluoreszierende Perlenprobe vorbereiten und sie in niedrigen Konzentrationen in den mikrofluidischen Kanal geben, so dass sich fluoreszierende Flecken von einzelnen Perlen in den Bildern nicht überlappen. Visualisieren Sie zunächst die Perlen im Epifluoreszenzmodus. Während sich die Beleuchtung im Epifluoreszenzmodus befindet, bewegen Sie den M5-Spiegel auf einem Translationstisch sitzend, so dass sich der aus dem Objektiv kommende Strahl biegt, bis eine vollständige interne Reflexionskonfiguration erreicht ist.Um zu überprüfen, ob die TIR-Beleuchtung erreicht wurde, ist zu überprüfen, ob nur die Perlen auf der Oberfläche sichtbar sind, wenn das TIR-Evaneszenzfeld die Perlenprobe beleuchtet und keine frei schwebenden Perlen von der Oberfläche entfernt beobachtet werden. Stellen Sie zu Beginn des Experiments die Laserleistung an der hinteren Brennebene des Objektivs auf fünf bis 10 Milliwatt ein, um eine Photozerstörung der Fluorophore zu verhindern. Halten Sie den Objektträger auf dem Mikroskoptisch und konzentrieren Sie sich zuerst auf die nackte Membran, kleine Spuren von Verunreinigungen in Lipidmembranen reichen aus, um die Membran sichtbar zu machen.Injizieren Sie die Probe mit einer Mikropipette in die PEG SLB-beschichtete Bildgebungskammer. Zur Messung der Einzelmolekülbindungskinetik werden die markierten Biomoleküle mit einer Spritzenpumpe mit einer Durchflussrate von 50 bis 500 Mikrolitern pro Minute durch die Einlasslöcher in die mikrofluidische Kammer geleitet. Um 5.000 Bilder mit 25 bis 50 Bildern pro Sekunde aufzunehmen, legen Sie die erforderlichen Filmaufnahmeparameter fest.Starten Sie die Filmaufnahme und erfassen Sie mehr als 5.000 Bilder unter kontinuierlichem Durchfluss von der Spritzenpumpe, bis das Auftreten neuer Flecken auf der Membranoberfläche nicht weiter zunimmt, und analysieren Sie die Bindungskinetik, wie im Manuskript beschrieben. Für die Einzelpartikelverfolgung fügen Sie die markierten Biomoleküle in geringen Konzentrationen mit einer Mikropipette in den Kanal ein. Um die hohe Genauigkeit der aus den Datensätzen gewonnenen Spuren zu gewährleisten, optimieren Sie die Konzentration auf eine Dichte von weniger als 0,1 Partikeln pro Quadratmikrometer, so dass sich einzelne Partikel selten kreuzen.Falls erforderlich, inkubieren Sie die Kammer in einer befeuchtenden Umgebung und waschen Sie sie vor der Bildgebung mit dem Puffer. Für die Analyse der Flugbahn einzelner Partikel erfassen Sie 200 bis 500 Bilder bei 10 bis 100 Bildern pro Sekunde und halten Sie das Objektiv während der Bildaufnahme mit minimaler Stufendrift auf die Doppelschichtebene fokussiert. Für die Messung von Untereinheiten fügen Sie die entsprechende Konzentration der markierten Biomoleküle in die mikrofluidische Bildgebungskammer hinzu und inkubieren den Objektträger in einer Befeuchtungskammer bei der gewünschten Temperatur für die erforderliche Zeit.Vor der Bildgebung waschen Sie die Bildgebungskammer mit einem Puffer. Legen Sie den Objektträger auf ein Mikroskop und passen Sie den Fokus an, um die markierten Moleküle sichtbar zu machen. Stellen Sie die Laserleistung auf ein Niveau ein, bei dem das Bleichen des Fluorophors allmählich erfolgt.Ideal für jede zusammengesetzte komplexe Steuerung der Laserleistung, um die Photobleichschrittrate zwischen 10 und 20 Bildern auseinander zu halten, wie im Manuskript beschrieben, und die Bilder zu erfassen, bis alle Moleküle vollständig photogebleicht sind. Führen Sie eine zeitabhängige Montagemessung durch, indem Sie die Filmaufnahme starten, sobald die Probe in die Kammer eingeführt wird, und neue Fotobleichfilme in festen Zeitintervallen nach der Membranbindung aus verschiedenen Segmenten des PEG SLB aufnehmen. Die Bindung von Cytolysin A an Lipidmembranen mit fünf Molprozent DOPE-PEG(2000) zeigte eine erhöhte Partikeldichte und erreichte eine erreichte Sättigung.Eine exponentielle Zerfallsfunktion, die an die gebundenen Partikel angepasst ist, ergibt die Zeitkonstante für die Cytolysin-A-Membranbindung. Ohne PEG-Polymer in der Membran zeigten die meisten Tracer eine eingeschränkte Diffusion auf SLBs. Kleine Mengen von PEG 2000 in der Membrandoppelschicht hoben sich von der darunter liegenden Oberfläche ab, so dass die Tracermoleküle ohne Oberflächenbeschränkungen diffundieren konnten.Ein extremer Einschluss wird jedoch bei einer hohen Konzentration von PEG in der Doppelschichtmembran beobachtet. Die ISD2-Verteilung für die Diffusion lipophiler DNA-Tracer in zwei verschiedenen PEG 2000-Lipidmembranen zeigte eine verminderte Mobilität bei hohen PEG-Konzentrationen. Nach dem Inkubieren auf der überfüllten Lipiddoppelschichtmembran zeigte Cytolysin A viele verschiedene Photobleichschritte, was auf die Bildung verschiedener Montagezwischenprodukte hindeutet.Nach Korrektur der Markierungseffizienz zeigte die endgültige Verteilung der Oligomere die dodekamere Cytolysin-A-Spezies als dominante Struktur. Die Membranproteinbindungsmontage und andere Reaktionen sollten in geeigneten Membran-Crowding-Umgebungen durchgeführt werden. Es sollte darauf geachtet werden, die Bildgebungskammer zu reinigen, eine Unterbrechung der Doppelschicht zu vermeiden und das TIRF-Mikroskop einzurichten.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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