Isolierung und Charakterisierung der natürlichen Mikrobiota des Modellnematoden Caenorhabditis elegans

Dieses Protokoll ermöglicht neue Einblicke in die natürliche Mikrobiota von C.elegans. Gleichzeitig können die isolierten Mikroben in kontrollierten Laborexperimenten verwendet werden, um Mikrobiota-Wirt-Interaktionen und C.elegans-Biologie zu charakterisieren. Dieses Protokoll konzentriert sich auf die Isolierung von Mikroben, die mit C. elegans in der Natur assoziiert sind, die daher für das Verständnis der Biologie dieses wichtigen Modellwirts in einem natürlicheren Kontext von entscheidender Bedeutung sind.

Es wird hilfreich sein, mit dem Auftreten von Caenorhabditis im Vergleich zu anderen Nematoden vertraut zu sein. Das Pipettieren unter dem Sezierbereich kann anfangs eine Herausforderung sein, aber Übung wird hilfreich sein. Beginnen Sie mit dem Sammeln der Umweltproben wie Kompost oder faulen Früchten in separaten Plastiktüten, Röhrchen oder sauberen Behältern.

Die Stücke der gesammelten Umweltproben gleichmäßig in einer sterilen, neun Zentimeter leeren Petrischale verteilen und etwa 20 Milliliter steriles viskoses Medium hinzufügen, um die Probe mit dem Medium zu bedecken. Suchen Sie unter dem Seziermikroskop nach Caenorhabditis-Nematoden gemäß den Richtlinien zur Isolierung von Caenorhabditis elegans und verwandten Nematoden. Mit einer 20 bis 100 Mikroliter großen Pipette die kleinstmögliche Menge Flüssigkeit mit den Caenorhabditis-Nematoden von der Platte auffangen und in die drei Zentimeter große Petrischale mit einem bis drei Milliliter sterilem M9T überführen.

Um eine Wurmpopulation zu etablieren, können die einzelnen Würmer mit einem Nematoden-Wachstumsmedium oder NGM auf eine Platte übertragen werden. Um die Nematoden zu waschen und die außerhalb der Nematoden vorhandenen Mikroben zu entfernen, inkubieren Sie sie in M9T für 10 bis 15 Minuten. Pipettieren Sie die kleinstmögliche Menge Flüssigkeit mit den Nematoden und geben Sie sie in eine neue sterile drei Zentimeter große Petrischale mit einem bis drei Milliliter frischem M9T.

Für die unvoreingenommene Identifizierung von Nematoden-assoziierten Mikroben bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit etwa drei sterilen Perlen von einem Millimeterdurchmesser vor und fügen Sie eine Mischung aus 19,5 Mikrolitern PCR-Puffer und 0,5 Mikroliter Proteinase K pro Vertiefung hinzu. Übertragen Sie einen einzelnen gewaschenen Nematoden mit so wenig Flüssigkeit wie möglich in jedes Bohrloch. Zerlegen Sie die übertragenen Nematoden mit einem Perlenhomogenisator für drei Minuten bei 30 Hertz und zentrifugieren Sie die Platten oder Röhrchen bei 8.000 G für 10 Sekunden bei Raumtemperatur, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bekommen.

Um C.elegans zu identifizieren, erhitzen Sie die Proben in einem PCR-Cycler für eine Stunde bei 50 Grad Celsius und 15 Minuten bei 95 Grad Celsius, um DNA einzelner Nematoden zu isolieren, oder verwenden Sie kommerzielle Kits, um DNA von Wurmpopulationen zu isolieren. Frieren Sie die isolierte DNA bei minus 20 Grad Celsius für die Langzeitlagerung ein. Verwenden Sie die DNA und das Primerpaar NLP 30 vorwärts und NLP 30 umgekehrt und erzeugen Sie ein 154-Basenpaar-PCR-Produkt.

Um die Bakterien zu isolieren, bereiten Sie eine 96-Well-Platte mit etwa drei sterilen Ein-Millimeter-Perlen, 20 Mikrolitern M9-Puffer pro Vertiefung vor und pipettieren Sie einen einzelnen gewaschenen Nematoden mit so wenig Flüssigkeit wie möglich zu jedem Brunnen. Zerlegen Sie die Nematoden wie demonstriert, bevor Sie einen Perlenhomogenisator verwenden, gefolgt von einer kurzen Zentrifugation der Platte, um die Flüssigkeit auf den Boden zu bringen. Sobald Sie fertig sind, sammeln Sie die Suspension und verdünnen Sie sie seriell in einem bis 10-Verhältnis.

Platte bis zu 100 Mikroliter der verdünnten Suspension auf neun Zentimeter große Agarplatten. Dann inkubieren Sie die Platten bei 15 bis 20 Grad Celsius für 24 bis 48 Stunden. Um die reine Bakterienkultur zu erhalten, nehmen Sie eine einzelne Kolonie von der inkubierten Platte mit einer sterilen Schlaufe oder einem Zahnstocher und streifen Sie sie auf eine neue Agarplatte, die das gleiche Agarmedium enthält, das während der Reinigung verwendet wurde.

Stellen Sie sicher, dass Sie nur 1/3 der Platte verwenden. Sterilisieren Sie dann eine wiederverwendbare Schlaufe oder verwenden Sie eine neue sterile Schlaufe und ziehen Sie sie durch den ersten Streifen, um einen zweiten Streifen auf einem anderen 1/3 Teil der Probenplatte zu erzeugen. Wiederholen Sie es, indem Sie eine Schleife durch den zweiten Streifen ziehen und den dritten Streifen erstellen, um das Wachstum einer einzelnen Kolonie zu erreichen.

Inkubieren Sie die Platte unter den gleichen Wachstumsbedingungen, die für die Isolierung verwendet werden, und wiederholen Sie bei Bedarf den Reinigungsschritt. Züchten Sie die reinen Kolonien in einem flüssigen Medium mit den gleichen Temperatur- und Wachstumsbedingungen. Als nächstes charakterisieren Sie die Bakterien, indem Sie die bakterielle DNA aus reinen flüssigen Kulturen extrahieren, die 16S ribosomale RNA unter Verwendung von 27 Forward- und 1495 Reverse-Primern amplifizieren und die PCR wie im Text beschrieben durchführen.

Wenn die gesammelten Frucht- und Kompostproben in Petrischalen verteilt und in ein flüssiges oder viskoses Medium getaucht wurden, führte dies dazu, dass die Würmer das Substratmaterial verließen und an die Oberfläche des Mediums schwammen. Die Mikroben wurden als reine Einzelkolonien isoliert und die Reinigung spielte eine wesentliche Rolle, da einige C.elegans-assoziierte Bakterien Biofilme bilden oder leicht aggregieren können, was zu Mehrartenkulturen führt. Die PCR unter Verwendung der C.elegans-spezifischen Primer, nämlich NLP 30 vorwärts und NLP 30 reverse, führte zur Amplifikation eines 154-Basenpaar-Produkts für C.elegans.

Die aus einzelnen Würmern isolierte DNA führte zu schwachen PCR-Banden, während die DNA-Extraktion aus den Wurmpopulationen, die aus mindestens 50 Würmern bestanden, eine größere Menge und klarere Banden ergab. Der Erfolg der C.elegans-spezifischen PCR wurde bestätigt, indem die DNA eines Laborstamms namens N2 als Positivkontrolle gleichzeitig mit der DNA der isolierten Nematoden durchgeführt wurde. Mikroben sind überall. Daher ist es wichtig, unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um sicherzustellen, dass die isolierten Mikroben wirklich mit dem Wurm in der Natur verbunden sind.

Die isolierten Mikroben können verwendet werden, um Wirt-Mikrobiota-Interaktionen oder die Rolle von Mikroben auf die Wirtsbiologie, zum Beispiel Alterung, Entwicklung oder Immunität in kontrollierten Laborexperimenten zu untersuchen. Mikroben, die mit dieser Technik isoliert wurden, werden derzeit von der C.elegans-Gemeinschaft verwendet, um das Verständnis der Mikrobiota-Vielfalt auf die Wirtsfitness oder die Rolle von Mikroben auf die Immunität zu verbessern.