Name: Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-09T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Lernen Sie die automatisierte Fluoreszenzmikroskopie zur Quantifizierung intrazellulärer Salmonella-Phänotypen in Darmepithelzellen mit ImageJ. Diese hochdurchsatzfähige Methode ermöglicht die skalierbare Analyse zahlreicher Bakterienstämme.

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Die Autoren danken Dr. Olivia Steele-Mortimer für das Teilen von pCHAR-Duo-Plasmid. Diese Arbeit wurde vom italienischen Gesundheitsministerium finanziert, gewährt PRC2019014 und PRC2021004.

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</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit diesem Artikel haben.

Die Art und Weise, wie Salmonellen Darmepithelzellen besiedeln, beeinflusst das Infektionsergebnis. Bei der Invasion induziert die zytosolische Hyperreplikation eine Entzündung des Darms3, während die vakuoläre Replikation zu einer systemischen Ausbreitung führen kann4. Salmonellenstämme können in ihrer Fähigkeit variieren, in intestinale Epithelzellen einzudringen und sich darin zu vermehren9. Tatsächlich sind Salmonellen eine äußerst vielfältige Gattung mit mehr als 2.500 Serovaren, die unterschiedliche Fähigkeiten haben, Krankheiten zu verursachen. Darüber hinaus sind Salmonellen die am häufigsten gemeldete Ursache lebensmittelbedingter Krankheitsausbrüche in der Europäischen Union, was auf eine starke Ausbreitung in der menschlichen Bevölkerung hindeutet1. Daher ist die Verfügbarkeit zuverlässiger Hochdurchsatzmethoden zur Quantifizierung der intrazellulären Phänotypen von Salmonellen von großer Bedeutung, um Unterschiede in der Virulenz zwischen einer großen Anzahl von Salmonella-Stämmen zu bewerten und letztendlich eine genaue und stammspezifische Risikobewertung dieses Erregers zu ermöglichen.
Das hier beschriebene Protokoll misst das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen schnell und automatisiert. Die Infektion von Epithelzellen wird in 96-Well-Bildgebungs-Mikrotiterplatten durchgeführt und ein automatisiertes Fluoreszenzmikroskop wird für die Bildaufnahme verwendet, wodurch das Protokoll für Hochdurchsatzanwendungen geeignet ist. Dieses Protokoll nutzt das pCHAR-Duo-Plasmid, das es ermöglicht, vakuoläre von zytosolischen Salmonellen durch die differentielle Expression von zwei fluoreszierenden Reportern zu unterscheiden5. Die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen werden häufig durch manuelles Scoring analysiert, ein zeitaufwändiges Verfahren, das für die Analyse einer großen Anzahl von Stämmen und Zellkulturen pro Stamm ungeeignet ist und anfällig für Bedienerfehler und Variationen zwischen den Bedienern ist. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt, die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse. Für die Entwicklung der beiden Analysen wurde ImageJ verwendet, eine frei verfügbare Software. Um die Protokollausführung zu beschleunigen, werden ImageJ-Skripte für die Batch-Analyse mehrerer Erfassungsdateien ohne Bedienereingriff als ergänzende Dateien bereitgestellt.
Die Flächenanalyse wurde entwickelt, um in wenigen Schritten die Gesamtbesiedlung von Epithelzellen (Infektionsrate) und das Hyperreplikationsniveau (Hyperreplikationsverhältnis) durch die Messung der Bereiche, die spezifisch von den Kernen von Epithelzellen besetzt sind, und durch Salmonellen , die entweder mCherry oder mCherry zusammen mit GFP exprimieren, zu quantifizieren. Die Flächenanalyse wird auf Bilder angewendet, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden, wobei sowohl vakuoläre als auch hyperreplizierende Salmonellen in derselben z-Ebene fokussiert sind und eine große Anzahl von Epithelzellen pro mikroskopischem Feld angezeigt wird, wodurch die Größe und Anzahl der Erfassungsdateien reduziert wird. Die Flächenanalyse ermöglicht eine automatisierte, schnelle und rechnerisch leichte Analyse einer großen Anzahl von Proben und eignet sich daher für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente.
Die Einzelzellanalyse wurde entwickelt, um Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen mit Einzelzellauflösung zu quantifizieren, die durch Zellsegmentierung und Messung des Zellbereichs und des Prozentsatzes der Fläche, die von vakuolären und zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen eingenommen wird, erhalten wird. Die Gesamtkolonisation von Epithelzellen, die durch die Flächenanalyse charakterisiert wird, wird hier in drei quantitative Parameter unterteilt, den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Last und die Hyperreplikationsrate, so dass der Beitrag jedes Phänotyps zur Gesamtkolonisation bewertet und quantifiziert werden kann, wodurch die Ergebnisse der Flächenanalyse ergänzt werden. Die größeren Details, die die Einzelzellanalyse bietet, gehen zu Lasten einer langsameren Bildaufnahme und -analyse. Um eine Einzelzellauflösung zu erreichen, wird die Bildaufnahme bei hoher Vergrößerung durchgeführt. Dies bedeutet, dass mehrere z-Ebenen benötigt werden, um sowohl vakuoläre als auch zytosolische Salmonellen im Fokus zu beobachten, und dass die Erfassung einer großen Anzahl von Feldern pro Probe erforderlich ist, um eine hohe Anzahl von Epithelzellen zu erzielen, wodurch die Erfassungszeit im Vergleich zur Flächenanalyse verlängert wird. Darüber hinaus ist die Analyse mehrerer großer Erfassungsdateien rechenintensiv und erfordert daher eine geeignete Workstation (es wurde eine 6-Core-Workstation mit 32 GB RAM verwendet). Daher kann die Einzelzellanalyse als eigenständige Methode unter begrenzten Durchsatzbedingungen oder als Second-Level-Methode in Verbindung mit der Flächenanalyse eingesetzt werden, um ein tieferes Verständnis der Salmonella-Phänotypen in Epithelzellen zu erlangen.
Die beiden komplementären Analysen wurden mit S validiert. Tm, S. Derby wt, und S. Derby ΔsipA, gewählt, weil ihr Verhalten in Epithelzellen bereits bekannt war, um sich in Bezug auf Invasion oder Replikation zu unterscheiden 9,10. Die Ergebnisse der Flächen- und Einzelzellanalysen zeigen, dass das Protokoll es erlaubte, Unterschiede in intrazellulären Salmonella-Phänotypen entsprechend den Eigenschaften der getesteten Stämme quantitativ zu unterscheiden. Darüber hinaus zeigen diese Ergebnisse, dass die Einzelzellanalyse eine Quantifizierung des Beitrags jedes intrazellulären Phänotyps (Invasion, vakuoläre Last und zytosolische Replikation) zur Gesamtkolonisation ermöglicht, die mit Hilfe der Flächenanalyse bewertet wird.
Dieses Protokoll wurde hier angewendet, um die In-vitro-Pathogenität verschiedener Salmonellenstämme zu untersuchen, aber es kann auch andere Anwendungen haben, wie die Untersuchung zufälliger Mutanten, um Gene zu identifizieren, die an der Invasion und / oder Replikation in Epithelzellen beteiligt sind. Darüber hinaus kann das Protokoll angepasst werden, um das Verhalten von Salmonellen in anderen Zelllinien als INT407-Zellen zu analysieren. Es kann auch als Ausgangspunkt für die Entwicklung ähnlicher Methoden zur Untersuchung der Zell-Pathogen-Interaktion anderer intrazellulärer Mikroorganismen verwendet werden.

Salmonellen sind der am häufigsten gemeldete bakterielle Erreger, der Ausbrüche lebensmittelbedingter Krankheiten in der Europäischen Union verursacht1. Die primäre pathologische Manifestation der Salmonelleninfektion ist die Enteritis, die das Ergebnis des Erregerverhaltens im Darm nach der Einnahme und der daraus resultierenden lokalen Entzündungsreaktion ist2. Salmonellen können sich jedoch auch an extraintestinalen Stellen ausbreiten und systemische Infektionen verursachen, insbesondere bei immungeschwächten Personen. Die Art der Interaktion zwischen Salmonellen und dem Darmepithel bedingt das Ergebnis der Infektion. Einmal im Darmlumen dringt Salmonella in Darmepithelzellen ein und repliziert sich. Auf intrazellulärer Ebene können Salmonellen zwei verschiedene Replikationsphänotypen aufweisen, die zytosolische Hyperreplikation und die intravakuoläre langsame Replikation innerhalb von Salmonellen-haltigen Vakuolen (SCVs). Die zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Wirtszelltod und die Salmonellenextrusion in das Darmlumen3; Die vakuoläre Replikation führt zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung4. Daher beeinflusst das Ausmaß der Invasion und der vakuolären vs. zytosolischen Replikation den Verlauf der Infektion.
Die Gattung Salmonella ist sehr vielfältig, darunter Tausende von Serotypen mit unterschiedlichen Wirtsbereichen und Fähigkeiten, Krankheiten zu verursachen. Beispiel: S. Typhimurium wird als generalistisches Serovar definiert, da es mehrere nicht verwandte Wirte infiziert und eine der Hauptursachen für menschliche Salmonellose darstellt. Anders, S. Derby gilt als schweineangepasster Serovar, da es meist von den Schweinen isoliert ist, aber es wird auch in den Top fünf der Serovare berichtet, die für die Infektion des Menschen verantwortlich sind1. Das Wissen über das bakterielle Verhalten innerhalb der Epithelzellen beschränkt sich jedoch im Wesentlichen auf die Untersuchung einiger weniger Referenzstämme, wie S. Typhimurium SL1344, die nicht die große natürliche Vielfalt der Salmonellenpathogenität repräsentieren. Die Charakterisierung der Interaktion verschiedener Salmonellenstämme mit Epithelzellen würde zum Verständnis ihrer unterschiedlichen Pathogenität beitragen. Aus diesem Grund wurde ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll entwickelt, um das intrazelluläre Verhalten einer großen Anzahl von Stämmen schnell und weitgehend automatisiert zu analysieren. In diesem Protokoll wurde die Infektion von Epithelzellen in 96-Well-Bildgebungsplatten durchgeführt und die Bildaufnahme wurde mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop durchgeführt. Das pCHAR-Duo-Plasmid wurde verwendet, um die Invasions- und Replikationsphänotypen von Salmonellen in Epithelzellen durch Fluoreszenzmikroskopie zu beobachten5. Dieses Plasmid trägt das Gen, das für den rot fluoreszierenden Reporter mCherry kodiert, der konstitutiv von allen transformierten Bakterienzellen exprimiert wird, und das Gen, das für den grün fluoreszierenden Reporter GFP kodiert, dessen Expression durch Glucose-6-phosphat aktiviert wird, das ausschließlich im Zytosol eukaryotischer Zellen vorhanden ist und in SCVs fehlt. Daher ermöglicht das Plasmid die Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry- und GFP-Reportern.
Die vakuolären und zytosolischen Bakterien auf Mikroskopiebildern werden üblicherweise durch manuelles Scoring6 quantifiziert, aber dies ist eine zeitaufwändige Methode, die die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben beschränkt. Daher wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen entwickelt - die Flächenanalyse und die Einzelzellanalyse - mit ImageJ7, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware. Die Flächenanalyse misst die gesamte intrazelluläre Bakterienlast und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation unter Verwendung von Daten von Bereichen, die von Epithelzellen, roten und grünen Salmonellen in jedem aufgenommenen Mikroskopiebild besetzt sind. Diese Methode kann auf Bilder angewendet werden, die bei geringer Vergrößerung aufgenommen wurden. Daher ermöglicht es, eine hohe Anzahl von Epithelzellen mit wenigen Bildern zu bewerten, wodurch die Erfassungszeit verkürzt wird. Die Einzelzellanalyse verwendet die Zellsegmentierung, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung und den Prozentsatz der infizierten Zellen zu bestimmen, die eine zytosolische Hyperreplikation mit Einzelzellauflösung durchlaufen.
In diesem Protokoll werden alle Schritte der Bildanalyse detailliert beschrieben, um manuell durchgeführt zu werden, aber die gleiche Analyse kann durch unsere speziell entwickelten ImageJ-Skripte automatisiert werden. Diese Skripte ermöglichen auch die Durchführung von Batch-Analysen, um mehrere Bilder automatisch zu analysieren und so die Ausführung der Methode zu beschleunigen.

<table><tbody><tr><td>96-Well-Imaging-Mikroplatte</td><td>Eppendorf</td><td>30741030</td><td>Zellkultur und Infektion</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59349</td><td>Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Axio Observer Inverses Mikroskop</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Automatisiertes Fluoreszenzmikroskop</td></tr><tr><td>Axiocam 305 Mono</td><td>ZEISS</td><td></td><td>Mikroskop Kamera</td></tr><tr><td>Atmungsaktive Dichtungsmembran</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z380059</td><td>Infektionsassay</td></tr><tr><td>Colibr&igrave; 5/7</td><td>ZEISS</td><td></td><td>LED-Lichtquelle</td></tr><tr><td>Kollagen I Rattenschwanz</td><td>Life Technologies</td><td>A1048301</td><td>Kollagenbeschichtung</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Zellfärbung</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>10099-141</td><td>Zellkultur und Infektion</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G12664</td><td>Infektionsassay</td></tr><tr><td>Eisessigsäure</td><td>Carlo Erba</td><td>401391</td><td>Kollagenbeschichtung</td></tr><tr><td>HCS CellMask Blue</td><td>Invitrogen</td><td>H32720</td><td>Zellfärbung</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health und das Laboratory for Optical and Computational Instrumentation (LOCI, University of Wisconsin)</td><td></td><td>Bildverarbeitungssoftware</td></tr><tr><td>Minimum Essential Eagle's Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5650-500ML</td><td>Zellkultur und Infektion</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 4%</td><td>Invitrogen</td><td>FB002</td><td>Zellfixierung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131494.1211</td><td>PBS-Präparat</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60220</td><td>PBS-Präparat</td></tr><tr><td>Natriumchlorid</td><td>PanReac AppliChem</td><td>131659.1214</td><td>Bakterienkultur und PBS-Präparat</td></tr><tr><td>Natriumphosphat Dibasic</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71640</td><td>PBS-Präparat</td></tr><tr><td>Gewebekulturflasche 25 cm2 Stopfen Dichtung</td><td>Schraubverschluss Euroclone</td><td>ET7025</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Biorad</td><td>1610407</td><td>Zellfärbung</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0,25%)</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Zellkultur und Infektion</td></tr><tr><td>Trypton-Oxoid</td><td></td>- <td>LP0042B</td><td>Bakterienkultur</td></tr><tr><td>Hefeextrakt</td><td>Biolife</td><td>4122202</td><td>Bakterienkultur</td></tr></tbody></table>

automatisierte analyse intrazellulärer phänotypen von salmonellen mit imagej

Automated Analysis of Intracellular Phenotypes of Salmonella Using ImageJ

Salmonellen sind ein enterischer Erreger, der in das Darmepithel eindringen und sich in Enterozyten vermehren kann, sowohl innerhalb von Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (zytosolische Hyperreplikation). Diese verschiedenen Phänotypen der intrazellulären Replikation treiben zu verschiedenen Wegen der Pathogenese, d.h. zytosolische Hyperreplikation induziert den entzündlichen Zelltod und die Extrusion in das Darmlumen, während die vakuoläre Replikation zu einer Transepithelpenetration und systemischen Ausbreitung führt. Es wurden erhebliche Anstrengungen unternommen, um Mikroskopiewerkzeuge zu entwickeln, um das Verhalten von Salmonellen in eingedrungenen Zellen zu untersuchen, wie das pCHAR-Duo-Fluoreszenzreporterplasmid, das eine Unterscheidung zwischen vakuolären und zytosolischen Bakterien durch differentielle Expression von mCherry und GFP ermöglicht. Intrazelluläre Phänotypen werden jedoch oft manuell bewertet, ein zeitaufwendiges Verfahren, das die Analyse auf eine kleine Anzahl von Proben und Zellen beschränkt. Um diese Einschränkungen zu überwinden, wurden zwei komplementäre und automatisierte Bildanalysen mit ImageJ, einer frei verfügbaren Bildanalysesoftware, entwickelt. Im Hochdurchsatzprotokoll wurden Epithelzellen mit Salmonellen infiziert, die pCHAR-Duo unter Verwendung von 96-Well-Platten trugen. Die Bildgebung erfolgte mit einem automatisierten Fluoreszenzmikroskop. Anschließend wurden zwei Bildanalysemethoden angewendet, um das intrazelluläre Verhalten von Salmonellen auf verschiedenen Detailebenen zu messen. Die erste Methode misst die gesamte intrazelluläre Bakterienbelastung und das Ausmaß der zytosolischen Hyperreplikation. Es ist schnell und ermöglicht die Bewertung einer hohen Anzahl von Zellen und Proben, wodurch es für Hochdurchsatz-Assays wie Screening-Experimente geeignet ist. Die zweite Methode führt Einzelzellanalysen durch, um den Prozentsatz der infizierten Zellen, die mittlere vakuoläre Belastung von Salmonellen und die zytosolische Hyperreplikationsrate zu bestimmen, die mehr Details über das Verhalten von Salmonellen in Epithelzellen liefern. Die Protokolle können von speziell entwickelten ImageJ-Skripten durchgeführt werden, um automatisch Batch-Analysen der wichtigsten Schritte der Salmonella-Enterozyten-Interaktion durchzuführen.

Infektion von Epithelzellen mit Salmonella-Stämmen Dieses Protokoll wurde entwickelt, um die zelluläre Invasion und die zytosolische Replikation (Abbildung 1A) im Vergleich zur vakuolären Belastung (Abbildung 1B) von Salmonellen in Epithelzellen zu analysieren. Das Protokoll wurde anhand der drei folgenden Salmonella-Stämme validiert, S. Typhimurium SL1344 Referenzstamm (S. Tm), S. Derby ER1175 Wildtyp (S. Derby wt) und die isogene Mutante von S. Derby ER1175 ohne sipA-Gen (S. Derby ΔsipA). Der Stamm S. Derby ER1175 wurde aus Schweinen isoliert und gehört zur IZSLER-Überwachungssammlung von Salmonella-Isolaten. Die Stämme wurden ausgewählt, um die Phänotypvielfalt des Protokolls darzustellen. Insbesondere wurden diese Stämme ausgewählt, weil ihr Verhalten innerhalb von Epithelzellen bereits bekannt war, um sich in Bezug auf Invasion oder Replikation zu unterscheiden9; Daher waren sie wertvolle Kontrollen, um zu testen, ob das Protokoll es erlaubt, Unterschiede in intrazellulären Salmonella-Phänotypen quantitativ zu unterscheiden. Insbesondere S. Tm und S. Derby wt wurden aufgenommen, weil wir zuvor gezeigt hatten, dass S. Tm hat eine höhere Invasions- und intrazelluläre Replikationseffizienz als S. Derby wt9 während S. Derby Δ sipA wurde als hyperreplikationsgestörter Stamm hinzugefügt, da der VirulenzeffektorSipA eine entscheidende Rolle beim Beginn der Hyperreplikation spielt10,11. Es wurde zuvor für S berichtet. Tm dass die zytosolische Replikation 4 h nach der Invasion beginnt, und dann hyperrepliziert die zytosolische Population schnell, um die Epithelzelle um 8 h11,12 zu füllen. Konsequenterweise war eine 8 h lange Infektion geeignet, den zytosolischen Hyperreplikationsphänotyp auch in S zu beobachten und zu quantifizieren. Derby wt und S. Derby ΔsipA.
Flächenanalyse Die Flächenanalyse in Schritt 4.1 liefert eine Messung der Gesamtbesiedlung von Epithelzellen durch Salmonellen (Infektionsrate) sowie eine Messung der Hyperreplikation (Hyperreplikationsverhältnis). In dem in Abbildung 2 beschriebenen Workflow für die Bereichsanalyse wird das zufällige Rauschen reduziert, und dann werden die Kanäle aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Für jeden Kanal wird ein Schwellenwert festgelegt, um den Hintergrund von der Flächenmessung auszuschließen. Anschließend wird der Bereich, der von Schwellenwertpixeln belegt ist, für jeden Kanal gemessen. Das Ergebnis der Flächenanalyse ist eine Tabelle, die für jede Akquisitionsdatei die Ausdehnung der Bereiche angibt, die von Epithelzellkernen (blauer Kanal), intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen (roter Kanal) und zytosolischen hyperreplizierenden Salmonellen, die GFP (grüner Kanal) zusammen mit mCherry exprimieren, besetzt sind. Das Infektionsverhältnis wird berechnet, indem die von mCherry-exprimierenden Salmonellen eingenommene Fläche durch die Fläche der Wirtszellkerne geteilt wird. Die Ergebnisse der getesteten Stämme zeigten, dass S. Tm zeigt eine signifikant höhere Infektionsrate im Vergleich zu beiden S. Derby-Stämme, wie erwartet (Abbildung 3A). Daher zeigen diese Ergebnisse die Wirksamkeit der Flächenanalyse bei der Erkennung von Unterschieden in der Fähigkeit von Salmonella-Stämmen, Epithelzellen zu besiedeln. Das Hyperreplikationsverhältnis von Salmonellen wird gemessen, indem der von GFP-exprimierenden Salmonellen besetzte Bereich durch den Bereich geteilt wird, der von intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen besetzt ist. In Übereinstimmung mit der Rolle von SipA bei der Bestimmung der Hyperreplikation wurde ein signifikant reduziertes Hyperreplikationsverhältnis für S. Die Derby-ΔsipA-Belastung wurde im Vergleich zu S gemessen. Derby wt, (Abbildung 3B). Es wurde kein Hyperreplikationsunterschied zwischen S beobachtet. Tm und S. Derby wt. Insgesamt zeigte die Flächenanalyse effektiv unterschiedliche Hyperreplikationsniveaus unter den untersuchten Stämmen.
Einzelzellanalyse Die Einzelzellanalyse ermöglicht die Quantifizierung der Salmonelleninvasion und der vakuolären Last im Vergleich zur zytosolischen Replikation in Epithelzellen mit Einzelzellauflösung. Wie in Schritt 4.2 beschrieben, wurden für jede Erfassungsdatei blaue, rote und grüne Kanäle unabhängig voneinander verarbeitet (Abbildung 4). Insbesondere wurde der blaue Kanal, der Epithelzellen entspricht, in Schritt 4.2.3 verarbeitet, um eine Zellsegmentierung zu erhalten. Anschließend wurden segmentierte Zellen zum ROI-Manager (Region of Interest) hinzugefügt, um eine Liste der ROIs zu erhalten, die allen segmentierten Zellen entspricht, die eindeutig mit y-x-Koordinaten gekennzeichnet sind. Um unscharfe Pixel von GFP-exprimierenden hyperreplizierenden Salmonellen zu entfernen, wurden die Pixel des grünen Kanals von denen des roten Kanals subtrahiert. Die Ausgabetabelle der Einzelzellanalyse gibt für jeden ROI die Fläche und den Prozentsatz der ROI-Fläche an, die von Salmonellen besetzt ist, wobei nur der mCherry-konstitutive Reporter oder der GFP-Zytosol-responsive Reporter ausgedrückt wird. Der Prozentsatz der Zellfläche, der von mCherry-only exprimierenden Salmonellen eingenommen wird, wurde in Schritt 4.2.4 verarbeitet, um den Prozentsatz der infizierten Zellen und die mittlere vakuolare Belastung zu berechnen (Abbildung 5A). Die Analyse der vakuolären Belastung zeigte, dass die S. Derby-Stämme erzeugen eine mittlere vakuolare Belastung, die deutlich niedriger ist als S. Tm (Abbildung 5B). Umgekehrt wurde in S nur eine leichte und nicht signifikante Verringerung des Prozentsatzes infizierter Zellen beobachtet. Derby-Stämme im Vergleich zu S. Tm (Abbildung 5A). Der Prozentsatz der Zellfläche, der von GFP-exprimierenden Salmonellen eingenommen wird, wurde in Schritt 4.2.5 verarbeitet, um die Hyperreplikationsrate zu erhalten. Es wurde kein Unterschied zwischen S beobachtet. Tm und S. Derby wt, während S. Derby Δ sipA zeigte eine signifikante Abnahme der Hyperreplikation, was mit dem Ergebnis der Flächenanalyse (Abbildung 5C) und der Rolle vonSipA bei der Induktion der Hyperreplikation übereinstimmt.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2.jpg"> Abbildung 1: Salmonella zytosolische Hyperreplikation und vakuoläre Belastung. Repräsentative Bilder von (A) der Salmonellen-Hyperreplikation und (B) der Vakuumbelastung, die bei hoher Vergrößerung (40x) erfasst wurde, werden gezeigt. Abbildung B zeigt die unterschiedlichen Fokusebenen von Zellen mit hyperreplizierenden Salmonellen (z:7/8) im Vergleich zu nicht-hyperreplizierenden Salmonellen (z:4/8). Weiße Skalenbalken sind 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig1v2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig02.jpg"> Abbildung 2: Workflow der Flächenanalyse. Der Workflow der Flächenanalyse wird für eine repräsentative Erfassung von INT407-Zellen mit geringer Vergrößerung (10x) gezeigt, die 8 h lang mit Salmonellen infiziert waren, die das pCHAR-Duo-Plasmid (MOI 100) tragen. Zuerst wird das zufällige Rauschen reduziert, und dann werden die Kanäle in C1, C2 und C3 aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Für jeden Kanal wird ein Schwellenwert festgelegt, um den Hintergrund aus dem Messbereich auszuschließen. Dann wird für jeden Kanal die Fläche gemessen, die nur von den Schwellenwertpixeln eingenommen wird - entsprechend den Zellkernen in C1, allen intrazellulären Salmonellen in C2 und zytosolischen Salmonellen in C3. Die hier analysierten Bilder sind die Ergebnisse von vier Kacheln, die bei 10-facher Vergrößerung aufgenommen wurden und durch Stitching miteinander verschmolzen wurden. Weiße Skalenbalken sind 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig03.jpg"> Abbildung 3: Ergebnisse der Flächenanalyse. Die Ergebnisse der Flächenanalyse werden gezeigt. (A) Das Infektionsverhältnis wird berechnet, indem der Bereich, der von mCherry-exprimierenden Salmonellen (C2-Kanal), der alle intrazellulären Bakterien repräsentiert, eingenommen wird, durch den Bereich geteilt wird, der von Wirtszellkernen besetzt ist (C1-Kanal). (B) Das Hyperreplikationsverhältnis wurde gemessen, indem der Bereich, der von GFP-exprimierenden Salmonellen (C3-Kanal), die nur zytosolische hyperreplizierende Bakterien repräsentieren, eingenommen wird, durch den Bereich geteilt wurde, der von allen intrazellulären mCherry-exprimierenden Salmonellen besetzt ist. Jeder Punkt stellt eine Replikation dar. Die Analyse wurde an drei biologischen Replikaten durchgeführt, die jeweils dreifach getestet wurden. Die schwarzen Linien zeigen die Mittelwerte an. Die Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen t-Test berechnet, und es werden p-Werte angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig04.jpg"> Abbildung 4: Workflow der Einzelzellanalyse. Der Workflow der Einzelzellanalyse wird für eine repräsentative Aufnahme mit hoher Vergrößerung (40x) von INT407-Zellen gezeigt, die 8 h lang mit Salmonellen infiziert waren, die das pCHAR-Duo-Plasmid (MOI 100) tragen. Zunächst werden Kanäle in C1, C2 und C3 aufgeteilt und unabhängig voneinander verarbeitet. Blauer Kanal (C1), der Epithelzellen entspricht, wird verarbeitet, um eine Zellsegmentierung zu erhalten, und dann wird jede segmentierte Zelle als Region of Interest (ROI) definiert, die eindeutig mit y-x-Koordinaten gekennzeichnet ist. Der rote Kanal (C2) wird verarbeitet, indem der grüne Kanal (C3) subtrahiert wird, um unscharfe zytosolische hyperreplizierende Salmonellen zu entfernen, so dass alle vakuolären Salmonellen nur mCherry exprimieren, und dann wurde zufälliges Rauschen reduziert, und der Schwellenwert wird so eingestellt, dass der Hintergrund von den Messungen ausgeschlossen wird. Schließlich wird die Fläche gemessen, die von vakuolären Salmonellen für jeden ROI belegt wird. Der grüne Kanal (C3), der den gesamten zytosolischen GFP-exprimierenden Salmonellen entspricht, wird ähnlich verarbeitet. Die hier analysierten Bilder sind das Ergebnis von 16 Kacheln, die durch Stitching miteinander verschmolzen sind. Weiße Skalenbalken sind 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64263/64263fig05.jpg"> Abbildung 5: Ergebnisse der Einzelzellanalyse. Die Ergebnisse der Einzelzellanalyse werden gezeigt. (A) Der Prozentsatz der infizierten Zellen erhält man, indem man die Anzahl der Zellen mit einem Prozentsatz der Fläche, die nur mCherry-exprimierende Salmonellen einnimmt&gt; 0,2 durch die Gesamtzahl der Zellen dividiert. (B) Die mittlere vakuoläre Belastung wurde durch Berechnung des mittleren Prozentsatzes der Fläche ermittelt, die nur mCherry-exprimierende Salmonellen in den infizierten Zellen einnimmt. (C) Die Hyperreplikationsrate wurde berechnet, indem die Anzahl der Zellen mit einem Prozentsatz der Fläche, die von GFP-exprimierenden Salmonellen≥20% eingenommen war, durch die Gesamtzahl der infizierten Zellen geteilt wurde. Es werden Daten von drei bis vier biologischen Replikaten berichtet, die in dreifacher Ausführung getestet wurden. Die Balken zeigen den Standardmessfehler an. Die Signifikanz wurde mit einem zweiseitigen t-Test berechnet, und es werden p-Werte angegeben. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/64263fig05large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.</a>
Ergänzende Datei 1: Flächenanalyseskript. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Area%20analysis%20script.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>
Ergänzende Datei 2: Einzelzellenanalyseskript. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64263/REVIEWED_Single-cell%20analysis%20script.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Salmonellen dringen in intestinale Epithelzellen ein und replizieren sich sowohl in Salmonellen-spezifischen Vakuolen als auch frei im Zytosol (Hyperreplikation). Hier wird ein auf Hochdurchsatz-Fluoreszenzmikroskopie basierendes Protokoll beschrieben, um die intrazellulären Phänotypen von Salmonellen durch zwei komplementäre Bildanalysen durch ImageJ zu quantifizieren, um Einzelzellauflösung und Scoring zu erreichen.

Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

Salmonella is an enteric pathogen able to invade the intestinal epithelium and replicate in enterocytes, both inside Salmonella-specific vacuoles and free ...

Diese fluoreszenzmikroskopische Methode quantifiziert Salmonellen-Phänotypen in Darmepithelzellen auf automatisierte Weise und ermöglicht so die Untersuchung von Salmonellen an einer großen Anzahl von Stämmen mit skalierbarer Auflösung. Unsere Methode hat den Vorteil, dass sie quantitativ, hoch durchsatzfähig und gleichzeitig automatisiert ist und sowohl auf einer Flächen- als auch auf einer Einzelzellanalyse beruht. Das intrazelluläre Verhalten ist zentral für die Wirt-Pathogen-Interaktion vieler Bakterien.Unsere Methode kann leicht an andere bakterielle Krankheitserreger als Salmonellen angepasst werden, was zum Verständnis ihrer Pathogenese beiträgt. Führen Sie nach der Aufnahme der Bilder eine Einzelzellanalyse durch, indem Sie die Erfassung öffnen. czi-Datei in ImageJ.Teilen Sie die Kanäle, indem Sie auf das Bild klicken und Farbe auswählen, gefolgt von Kanäle teilen. Wählen Sie für die Zellsegmentierung das Bild der Z-Ebene im Titelfenster der C1-Erfassung aus. Wählen Sie das Titelfenster der C1-Erfassung aus und klicken Sie auf das Bild gefolgt von dem Duplikat.Schreiben Sie dann die Nummer der ausgewählten Z-Ebene. Schreiben Sie C1Zplane in das Titelfeld, deaktivieren Sie den Stapel duplizieren und klicken Sie auf OK, um nur das ausgewählte Bild der Z-Ebene zu duplizieren. Ein Fenster namens C1Zplane mit dem ausgewählten Bild der Z-Ebene wird geöffnet.Verbessern Sie nun den Bildkontrast des erhaltenen C1Zplane-Bildes, indem Sie Prozess auswählen und auf Kontrast verbessern klicken. Passen Sie die gesättigten Pixel an, aktivieren Sie Normalisieren und klicken Sie auf OK, um die Kontrastverstärkungstechnik anzuwenden und ein kontrastnormalisiertes C1Zplane-Bild zu erhalten. Gehen Sie zum Prozess und klicken Sie auf Maxima suchen, um die Epithelzellen im kontrastnormalisierten C1Zplane-Bild zu segmentieren.Wenn Sie dann jeder Epithelzelle nur einen Maximalpunkt zuweisen möchten, kennzeichnen Sie die Auswahl des Vorschaupunkts und legen Sie die Rauschtoleranz fest. Um das segmentierte C1Zplane-Bild zu erhalten, ein neues binäres maskenähnliches Bild, das jedes segmentierte Partikel pro markiertem Maximalpunkt zeigt, markieren Sie die Kantenmaxima ausschließen, wählen Sie die segmentierten Partikel als Ausgabetyp aus und klicken Sie auf OK. Erstellen Sie als Nächstes eine Maske segmentierter Zellen im segmentierten C1Zplane-Bild. Klicken Sie auf Analysieren, gefolgt von Partikel analysieren, und wählen Sie dann die Optionen Masken anzeigen und An Kanten ausschließen.Legen Sie das Größenintervall fest und klicken Sie auf OK, um die Maske der segmentierten C1Zplane-Binärmaske zu erhalten. Klicken Sie auf die Nachschlagetabelle, und wählen Sie in der Symbolleiste Nachschlagetabelle umkehren aus. Um den Schwellenwert für das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild festzulegen, wechseln Sie zum Bild, wählen Sie "Anpassen", wählen Sie "Schwellenwert" und überprüfen Sie den dunklen Hintergrund.Setzen Sie die Einstellung für den automatischen Schwellenwert auf Standard und wählen Sie die rote Option. Passen Sie den minimalen Cutoff-Wert an, bis die Zellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen. Klicken Sie auf Anwenden, um das kontrastnormalisierte C1Zplane-Bild in ein Binärbild mit weißen Zellen und schwarzem Hintergrund zu konvertieren.Um die Zellsegmentierung in der Maske der segmentierten binären C1Zplane-Maske zu korrigieren, wählen Sie Prozess und klicken Sie auf den Bildrechner. Wählen Sie dann die Maske von C1Zplane aus, die als Bild eins segmentiert ist, wählen Sie die Operation AND in der Dropdown-Liste und wählen Sie die kontrastnormalisierte C1Zplane als Bild zwei. Klicken Sie auf OK und ImageJ benennt das Ausgabebild automatisch als Ergebnis von Mask of C1Zplane Segmented.Um jede einzelne segmentierte Zelle von C1Zplane als Interessenbereich zu kennzeichnen, klicken Sie auf Analysieren und anschließend auf Partikel analysieren. Passen Sie die Größe wie zuvor gezeigt an und wählen Sie die Option "Nichts anzeigen". Fügen Sie alle Partikel zum ROI-Manager-Tool hinzu, indem Sie Zu Manager hinzufügen aktivieren.Aktivieren Sie außerdem das Kontrollkästchen An Kanten ausschließen und klicken Sie auf OK. Speichern Sie die ROI-Daten als roi-cells-acquisitiontitle. Navigieren Sie durch das ROI-Manager-Menü, indem Sie auf Mehr klicken und Speichern auswählen. Arbeiten Sie nach Abschluss der Zellsegmentierung am Titelfenster der C2-Akquisition, um vakuoläre Salmonellen zu analysieren.Gehen Sie zuerst zum Prozess, klicken Sie auf den Bildrechner, wählen Sie den C2-Erfassungstitel als Bild aus und wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdown-Liste. Wählen Sie dann den C3-Erfassungstitel als Bild zwei aus, aktivieren Sie Neues Fenster erstellen und klicken Sie auf OK. Wenden Sie die Subtraktion auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken. Duplizieren Sie die Ergebnisse des C2-Erfassungstitelfensters, indem Sie auf das Menü Bild klicken und Duplizieren auswählen.Überprüfen Sie dann den doppelten Stapel und drücken Sie OK, um die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels in einem Fenster zu erhalten. Wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels an, indem Sie zum Prozess wechseln, auf den Filter klicken und die Gaußsche Unschärfe auswählen. Lassen Sie den Sigma-Wert zwei oder passen Sie ihn an.Klicken Sie auf OK und wenden Sie Gaußsche Unschärfe auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken. Subtrahieren Sie die Gaußschen gefilterten Ergebnisse des C2-Erfassungstitels eins zu den Ergebnissen des C2-Erfassungstitels, indem Sie auf Prozess klicken und den Bildrechner auswählen. Wählen Sie nun die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels als Bild eins aus, wählen Sie die Operation Subtrahieren in der Dropdown-Liste, wählen Sie die Ergebnisse des C2-Erfassungstitels eins als Bild zwei aus und klicken Sie auf OK. Wenden Sie die Subtraktion auf den gesamten Z-Stapel an, indem Sie im Fenster Prozessstapel auf Ja klicken, um ein Fenster zu erhalten, das von ImageJ automatisch als Ergebnis der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels benannt wird.Um Salmonellen vom Hintergrund der Ergebnisse der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels zu trennen, klicken Sie auf das Bild, wählen Sie Anpassen und klicken Sie auf den Schwellenwert. Überprüfen Sie dann den dunklen Hintergrund und stellen Sie den automatischen Schwellenwert auf Otsu ein. Passen Sie den minimalen Grenzwert an, bis Salmonellen vollständig rot erscheinen und einen dunklen Hintergrund hinterlassen.Klicken Sie auf Übernehmen und ein Fenster mit dem Namen Convert to Binary wird geöffnet. Überprüfen Sie den schwarzen Hintergrund und klicken Sie auf OK. Wählen Sie die mittlere Z-Ebene, die der intrazellulären Salmonellen-Fokusebene im binären Fenster Ergebnisse der Ergebnisse des C2-Erfassungstitels entspricht. Klicken Sie auf das Bild gefolgt von Stapel, und wählen Sie dann Slice festlegen aus.Geben Sie nun die Nummer der Z-Ebene Ihrer Wahl ein und klicken Sie auf OK. Legen Sie als Nächstes die Messungen fest, die für jeden ROI aufgezeichnet werden sollen, indem Sie auf Analysieren klicken und Messung festlegen auswählen. Überprüfen Sie dann den Bereich, der der Gesamtfläche jedes ROI entspricht. Um den Flächenanteil aufzuzeichnen, der von Schwellenwertpixeln für jeden ROI belegt wird, aktivieren Sie den Flächenanteil und Grenzwert auf Schwellenwert.Aktivieren Sie das Etikett Anzeige, um jeden einzelnen ROI mit Bildtitel, Kanal, Z-Ebene und X/Y-Koordinaten zu beschriften. Verwenden Sie die gewählte Z-Ebene intrazellulärer Salmonellen, um Labels, Fläche und prozentuale Fläche aufzuzeichnen, die von Salmonellen für jede einzelne Zelle belegt sind. Öffnen Sie den Titel roi-cells-acquisition.ZIP-Datei, indem Sie auf das Menü Datei klicken und Öffnen auswählen. Klicken Sie dann im ROI-Manager-Menü auf Messen. Die Ausgabe ist eine Tabelle, die die ausgewählten Messungen angibt.Speichern Sie abschließend die Ergebnistabelle, indem Sie die Datei auswählen und im Ergebnisfenster auf Speichern unter klicken. Die zelluläre Invasion, die vakuolare Belastung und die zytosolische Hyperreplikation von Salmonellen wurden in Epithelzellen visualisiert. Die Flächenanalyse ergab eine signifikant höhere Infektionsrate bei Salmonella typhimurium im Vergleich zu beiden Salmonella-Derby-Stämmen, was die Wirksamkeit der Flächenanalyse bei der Erkennung von Unterschieden in der Fähigkeit von Salmonella-Stämmen, Epithelzellen zu besiedeln, zeigt.Salmonella derby sipA-deleted mutant Stamm zeigte eine reduzierte Hyperreplikationsrate im Vergleich zum Salmonella derby Wildtyp, was mit der Rolle von sipA bei der Induktion der Hyperreplikation übereinstimmt. Es wurde kein Hyperreplikationsunterschied zwischen Salmonella typhimurium und Salmonella derby Wildtyp beobachtet. Die Einzelzellanalyse zeigte keinen signifikanten Unterschied im Prozentsatz infizierter Zellen in Salmonella-Derby-Stämmen im Vergleich zu Salmonella typhimurium.Andernfalls erzeugten Salmonella-Derby-Stämme eine signifikant niedrigere mittlere vakuoläre Belastung als Salmonella typhimurium. Es wurde kein Unterschied zwischen Salmonella typhimurium und Salmonella derby Wildtyp beobachtet, während Salmonella derby sipA eine signifikante Abnahme der Hyperreplikation zeigte, was mit dem Ergebnis der Flächenanalyse übereinstimmt. Salmonellen umfassen mehrere Serovare mit unterschiedlicher Virulenz.Die Untersuchung einer großen Anzahl von Stämmen mit dieser schnellen und automatisierten Methode trägt wesentlich zum Verständnis des tatsächlichen Virulenzpotenzials dieses Erregers bei.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Wir berichten über die Entwicklung eines Systems zur automatisierten Abbildung und Analyse von Zebrafisch-transgenen Embryos in Mikrotiterplatten. Dies demonstriert die Fähigkeit, dosisabhängige Wirkung eines kleinen Moleküls, BCI, auf Fibroblast Growth Factor Expression des Reportergens zu messen und Technologie für den Aufbau High-Throughput-Zebrafisch chemische Bildschirme.

Entwicklung von automatisierten Imaging und Analyse für Zebrafisch chemische Bildschirme.

In diesem Artikel beschreiben wir ein Verfahren unter Verwendung von Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie, um die Internalisierung von Polyanhydrid Nanopartikel oder Bakterien durch RAW 264.7-Zellen zu quantifizieren.

Die Analyse der zellulären Internalisierung Nanopartikel und Bakterien durch Multi-Spectral Imaging Durchflusszytometrie

Hier beschreiben wir einen phänotypischen Assay, der auf die High-Throughput/High-Content-Screens von klein-interferierender synthetischer RNA (siRNA), chemischer Verbindung und Mycobacterium tuberculosis mutierte Bibliotheken anwendbar ist. Diese Methode beruht auf dem Nachweis von fluoreszierend gekennzeichneter Mycobacterium tuberculosis in fluoreszierend markierten Wirtszellen mittels automatisierter konfokaler Mikroskopie.

Ein mikroskopischer phänotypischer Assay zur Quantifizierung intrazellulärer Mykobakterien angepasst für High-Throughput/High-Content Screening

Eine Hochdurchsatz-Assay in vitro Phänotyp Salmonellen oder andere bakterielle Verein, Invasion und Replikation in Fresszellen mit hoher Durchsatzleistung entwickelt. Die Methode wurde eingesetzt, um Salmonellen Gen-Knockout-Mutanten-Stämme für ihre Verstrickungen in der Wirt-Pathogen-Interaktionen zu bewerten.

Hochdurchsatz-Assay zum Phänotyp Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion und Replikation in Makrophagen

Dieser Artikel beschreibt Methoden für die Synthese und die Fluoreszenzmarkierung von Nanopartikeln (NPs). Die Nanopartikel wurden in Pulse-Chase-Experimenten angewandt, um die Endo-lysosomalen System von eukaryotischen Zellen zu kennzeichnen. Eine Manipulation der endo-lysosomalen System Aktivitäten des intrazellulären Pathogen Salmonella ente wurden von Live Cell Imaging und quantifizierte gefolgt.

Die Anwendung der Fluoreszenz-Nanopartikel zur Umgestaltung des Endo-lysosomalen System-Studie durch intrazelluläre Bakterien

Wir beschreiben die Quantifizierung von zytosolischen und vakuolären Salmonella typhimurium in Knochenmark-abgeleiteten Makrophagen mittels differentieller Digitonin-Permeabilisierung.

Die Quantifizierung der Cytosolic vs. Vacuolar<em&gt; Salmonellen</em&gt; In Primäre Makrophagen durch Differential Permeabilisierung

Der Zweck der hier vorgestellten Methode ist es, zu zeigen, wie Mikroumgebungsmikroarrays (MEMA) hergestellt und verwendet werden können, um die Auswirkungen von Tausenden von einfachen kombinatorischen Mikroumgebungen auf den Phänotyp kultivierter Zellen abzufragen.

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Diese Studie skizziert quantitative Messungen der synaptischen Größe und Lokalisation, Muskelmorphologie und mitochondrialen Form in C. elegans mit frei verfügbaren Bildverarbeitungswerkzeugen. Dieser Ansatz ermöglicht es zukünftigen Studien in C. elegans, das Ausmaß der strukturellen Veränderungen von Gewebe und Organellen infolge genetischer Mutationen quantitativ zu vergleichen.

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Spalthefe wird hier als heterologer Wirt verwendet, um bakterielle Zytoskelettproteine wie FtsZ und MreB als translationale Fusionsproteine mit GFP zu exprimieren, um deren Polymerisation sichtbar zu machen. Auch Verbindungen, die die Polymerisation beeinflussen, werden durch Bildgebung mit einem Fluoreszenzmikroskop identifiziert.

Spalthefe als Plattform für antibakterielle Wirkstoffscreenings, die auf bakterielle Zytoskelettproteine abzielen

Hier finden Sie eine Anleitung zur effektiven Nutzung von SegElegans, einem von uns entwickelten Deep-Learning-System zur automatisierten Segmentierung einzelner Würmer in Weitfeldmikroskopiebildern, für die anschließende Verwendung in Bildanalysesoftware wie ImageJ. Wir bieten Möglichkeiten, das System sowohl online als auch offline zu nutzen.

Automatisierte Analyse von C. elegans-Fluoreszenzbildern mit SegElegans

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Automatisierte Analyse intrazellulärer Phänotypen von Salmonellen mit ImageJ

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