Polysomenreinigung aus Sojabohnen-Symbiose-Knötchen
July 1st, 2022
Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur eukaryotischen Polysomenreinigung aus intakten Sojaknollen. Nach der Sequenzierung können Standardpipelines für die Genexpressionsanalyse verwendet werden, um differentiell exprimierte Gene auf Transkriptom- und Translatomebene zu identifizieren.
Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es unseres Wissens das erste ist, das ein neues zentrifugenbasiertes Metall für die kinetische Polysomenreinigung aus symbiotischen Sojabohnenknollen beschreibt. Der große Vorteil dieser Technik ist, dass in Kombination mit RNA-Seq die Untersuchung der Beziehung ermöglicht und in einem komplexen Gewebe wie dem symbiotischen Knoten organisiert ist. Wiegen Sie zunächst etwa 0,2 Gramm intakte Knötchen in einer Waagschale und geben Sie sie in ein vorgekühltes Zwei-Milliliter-Rohr.
Dann fügen Sie 1,2 Milliliter Polysomenextraktionspuffer hinzu, lassen Sie die Probe zwei Minuten auftauen und homogenisieren Sie mit einem Gewebemahlwerk bis zur vollständigen Auflösung und Homogenisierung der Knötchen. Als nächstes inkubieren Sie die Proben auf Eis mit leichtem Rühren für 10 Minuten oder bis alle Proben verarbeitet wurden, und zentrifugieren Sie bei 16.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Trümmer zu pelletieren. Stellen Sie dann den Überstand wieder her und wiederholen Sie den Zentrifugenschritt.
Nach sorgfältiger Rückgewinnung des geklärten zytosolischen Extrakts wird ein 200-Mikroliter-Aliquot zur vollständigen Isolierung in ein sauberes 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen überführt. Dann gießen Sie 4,5 Milliliter der 33,5% igen Saccharoseschicht in die Zentrifugenröhrchen und fügen Sie 4,5 Milliliter der 12%-Schicht vorsichtig und langsam mit einer P-1000-Mikropipette hinzu. Als nächstes legen Sie die Röhrchen auf Eis, bis der geklärte zytosolische Extrakt hinzugefügt wird.
Laden Sie einen Milliliter des geklärten zytosolischen Extrakts auf das Saccharosekissen, indem Sie vorsichtig auf die Seitenwand des Röhrchens pipettieren. Dann die Ultrazentrifugenröhrchen in vorgekühlte Eimer geben und bei 217, 874 g zwei Stunden lang bei vier Grad Celsius zentrifugieren. Nach Verwerfen des verbleibenden zytosolischen Extrakts und des Saccharosepolsters wird das polysomale Pellet mit 200 Mikrolitern vorgekühltem Resuspensionspuffer wieder suspendiert.
Als nächstes 30 Minuten auf Eis inkubieren und dann die polysomale Resuspension in 1,5 Milliliter vorgekühlte Röhrchen überführen, um mit der RNA-Extraktion fortzufahren. Nach der Homogenisierung der Proben mit 750 Mikrolitern des RNA-Isolierreagenz für fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Dann fügen Sie 200 Mikroliter kaltes Chloroform hinzu und schütteln Sie die Röhrchen 15 Sekunden lang kräftig.
Als nächstes 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Zentrifugieren Sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius zur Phasentrennung und überführen Sie 500 Mikroliter der oberen wässrigen Phase in ein sauberes Röhrchen, ohne die rosa organische Phase zu stören. Dann fügen Sie 375 Mikroliter kaltes Isopropanol und 0,5 Mikroliter RNAs freies Glykogen hinzu.
Danach gründlich mischen, indem Sie auf und ab pipettieren. Inkubieren Sie die Mischung für 10 Minuten bei vier Grad Celsius und zentrifugieren Sie sie bei 12.000 mal G für 15 Minuten. Dann verwerfen Sie den Überstand und waschen Sie den RNA-Niederschlag mit einem Milliliter kaltem 75% Ethanol.
Durch kurzes Wirbeln mischen. Als nächstes zentrifugieren Sie bei 7, 500 G für fünf Minuten bei vier Grad Celsius. Entsorgen Sie den Überstand und trocknen Sie das RNA-Pellet an der Luft.
Dann lösen Sie das Pellet in 50 Mikroliter RNA-freiem Wasser auf und inkubieren Sie es fünf Minuten lang bei 65 Grad Celsius. Die RNA-Konzentration und -Integrität wird mit hochempfindlicher Kapillarelektrophorese und/oder Elektrophorese auf einem 2%RNAs-freien Agarosegel beurteilt. Nach der Schätzung des Probenvolumens fügen Sie 0,1 Volumina von drei molaren Natriumacetat, drei Volumina kaltes Ethanol und 0,5 Mikroliter RNAs, freies Glykogen hinzu.
Dann mischen Sie sie gründlich. Die Kapillarelektrophorese wurde für mehrere totale und polysomal assoziierte RNA-Probenfraktionen durchgeführt, die scharfe ribosomale RNA-Banden ohne verschmiertes Aussehen zeigten. Dies spiegelt sich jedoch nicht in den RIN-Werten wider, da sie zwischen 5,9 und 7,5 liegen, was nicht intakten Stichproben entspricht.
Der Bioanalysator konnte die 18S- und 25S-Peaks, wie sie in den Elektropherogrammen zu sehen sind, nicht identifizieren, sowohl für Gesamt- als auch für Polysom-assoziierte RNA-Proben. Es gab keine visuellen Anzeichen für eine Verschlechterung der Probe. Es wurde jedoch eine Probe analysiert, um das Ergebnis einer fast vollständig degradierten Probe zum Vergleich zu visualisieren.
Das Wichtigste ist, während des gesamten Protokolls unter Polysomen- und RNA-erhaltenden Bedingungen zu arbeiten. Nach der Sequenzierung der Gesamt- und Par-RNA-Fraktionen können Standardmuster für die analysierte Genexpression verwendet werden, um differentielle Exprimierungsgene auf Transkriptions- und Translationsebene zu identifizieren.
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Überblick
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode zur Reinigung von eukaryotischen Polysomen aus intakten Sojabohnen-Knöllchen. Diese Technik ermöglicht die Untersuchung der Genexpression auf Transkriptom- und Translatom-Ebene.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Pflanzenbiologie
- Genexpressionsanalyse
Hintergrund
- Die Polysomreinigung ist wesentlich für die Untersuchung der Translationsregulation.
- Das Verständnis der Genexpression in symbiotischen Knöllchen kann Einblicke in Pflanzen-Mikroben-Interaktionen liefern.
- Diese Methode ist die erste, die einen zentrifugationsbasierten Ansatz für die kinetische Polysomreinigung aus Sojabohnen-Knöllchen nutzt.
- RNA-Seq kann mit dieser Technik für eine umfassende Analyse kombiniert werden.
Zweck der Studie
- Eine zuverlässige Methode für die Polysomreinigung aus Sojabohnen-Knöllchen zu entwickeln.
- Die Untersuchung der Genexpression in komplexen Geweben zu erleichtern.
- Das Verständnis der Beziehung zwischen Transkriptom und Translatom zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Intakte Sojabohnen-Knöllchen wiegen und in ein Röhrchen übertragen.
- Homogenisieren der Knöllchen mit einem Gewebehomogenisator in Polysom-Extraktionspuffer.
- Inkubation der Proben auf Eis und Zentrifugieren, um Zelltrümmer abzuschöpfen.
- Rekognoszieren des Überstandes und Wiederholen der Zentrifugation für die Reinigung.
Hauptergebnisse
- Die Methode reinigt erfolgreich Polysomen aus Sojabohnen-Knöllchen.
- Ermöglicht die anschließende RNA-Seq-Analyse zur Identifizierung von differenziell exprimierten Genen.
- Demonstriert das Potenzial für die Untersuchung komplexer Gewebeinteraktionen.
- Etabliert ein neues Protokoll für zukünftige Forschung in der Pflanzenbiologie.
Schlussfolgerungen
- Dieses Protokoll bietet einen neuartigen Ansatz für die Polysomreinigung.
- Es eröffnet neue Wege für das Verständnis der Genexpression in symbiotischen Beziehungen.
- Zukünftige Studien können diese Methode für tiefere Einblicke in die Pflanzenbiologie nutzen.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Polysome purification from soybean symbiotic nodules enables direct interrogation of translational regulation in complex plant tissues, supporting mechanistic de-risking in early discovery. By isolating both total and polysome-associated mRNA for RNA-seq, this method provides quantitative insight into gene expression at both transcriptome and translatome levels. These capabilities enhance predictive confidence for target validation and pathway analysis in plant biotechnology pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables functional assessment of translational control in disease-relevant plant systems.
- Supports mechanistic de-risking by distinguishing transcriptional from translational regulation.
- Facilitates target validation through quantitative comparison of mRNA pools.
Screening & Assay Development
- Prepares high-quality, reproducible RNA samples for downstream RNA-seq workflows.
- Standardizes sample integrity assessment using capillary electrophoresis for sequencing readiness.
- Enables robust differential gene expression analysis at both transcriptional and translational levels.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression outputs with translational biomarker discovery in plant-microbe interaction models.
- Provides continuity from molecular discovery to functional validation in complex tissues.
- Supports risk-adjusted advancement of candidate targets based on translational evidence.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early hypothesis testing through lead identification and translational research in plant biotechnology.
- Discovery Biology: Enables hypothesis-driven analysis of translational regulation in symbiotic nodules.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative RNA outputs for comparative analysis.
- Analytics: Provides high-quality mRNA fractions for differential expression and pathway analysis.
- Translational Research: Connects molecular findings to functional outcomes in complex plant tissues.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow adaptable to other plant systems requiring translational profiling.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by resolving translational regulation.
- Operational Value: Delivers standardized, scalable RNA purification for high-throughput sequencing.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by integrating transcriptome and translatome data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on translational evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant tissue handling and RNA integrity assessment.
- Demands access to ultracentrifugation and capillary electrophoresis instrumentation.
- Necessitates rigorous cross-team standardization for reproducible RNA quality.
- May require adaptation for other plant species or tissue types.
- Sample integrity must be preserved throughout to ensure reliable downstream analysis.
