Effiziente Transfektion von in vitro transkribierter mRNA in kultivierten Zellen mit Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln

Peptid-Poloxamin-Nanopartikel sind eines der potenziellen pulmonalen mRNA-Abgabesysteme. Unser Protokoll stellt die Peptid-Poloxamin-Nanopartikel mit höherer Produktivität und Effizienz her, was die Entwicklung des mukosalen mRNA-Impfstoffs erleichtert. Die für die Technik erforderlichen Materialien sind kostengünstig und das Protokoll kann in kurzer Zeit fertiggestellt werden.

Die Peptid-Poloxamin-Nanopartikel haben die Fähigkeit, eine effiziente mRNA-Transfektion zu vermitteln. Peptid-Poloxamin-Nanopartikel zeigten eine erfolgreiche mRNA-Transfektion in menschlichen Bronchialepithelzellen, was zusätzliche Anwendungen für schleimige COVID-19-Impfstoffe, die Behandlung von Lungenkrebs und die Mukoviszidose-Gentherapie impliziert. Ich erwarte, dass der Einzelne einige Grundkenntnisse in einem verwandten Bereich und mit dem Protokoll und vielen Techniken hat, bevor er oder sie mit der Durchführung der Experimente beginnt.

Nachdem Sie den offenen Leserahmen von Metridia luciferase synthetisiert und in den pUC57-Vektor geklont haben, bereiten Sie eine linearisierte DNA-Vorlage mit BamHI und KpnI bei 37 Grad Celsius für eine Stunde vor. Bereiten Sie eine Reaktion von 20 Mikrolitern Volumen für die mRNA-Synthese mit einem T7-Transkriptionskit und Pseudouridin vor, wie im Manuskript beschrieben. Die Komponenten gründlich mischen und drei Stunden bei 37 Grad Celsius inkubieren.

Entfernen Sie dann die Sekundärstruktur von 50 Mikrogramm ungedeckelter IVT-mRNA, indem Sie sie 10 Minuten lang bei 65 Grad Celsius erhitzen. Verwenden Sie das Cap 1-Capping-System für das IVT-mRNA-Capping und bereiten Sie Cap 1 vor, indem Sie die 7-Methylguanosin-Cap-Struktur unter Verwendung von S-Adenosylmethionin und 2'O-Methyltransferasen bei 37 Grad Celsius für 30 bis 60 Minuten modifizieren. Messen Sie die Konzentration der gekappten IVT-mRNA mit einem UV-sichtbaren Spektralphotometer.

Analysieren Sie mit einem RNA-Marker die Molekülgröße der verschlossenen IVT-mRNA in einem 1% formaldehyddenaturierenden Agarosegel, das 18% Formaldehyd enthält. Bereiten Sie 10 Milligramm pro Milliliter Stammlösung von Poloxamin 704 durch Solubilisieren des T704 in nukleasefreiem Wasser vor. Bereiten Sie 2 Milligramm pro Milliliter Stammlösung des Peptids durch Solubilisierung des Peptids in nukleasefreiem Wasser vor.

Lagern Sie die vorbereitete Lösung bei 4 Grad Celsius. Die IVT-mRNA auf Eis auftauen. Bevor Sie das Röhrchen öffnen, zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 300 mal G für drei Sekunden bei Raumtemperatur und verdünnen Sie die IVT-mRNA-Lösung mit nukleasefreiem Wasser.

T704 und synthetische Peptidmischungslösung werden durch Verdünnen der T704-Lösung auf acht Mikrogramm pro Mikroliterkonzentration und der synthetischen Peptidlösung auf 0,555 Mikrogramm pro Mikroliterkonzentration mit nukleasefreiem Wasser hergestellt. Die Mischlösung vor der weiteren Verwendung 15 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Ziehen Sie die IVT-mRNA-Lösung in eine Ein-Milliliter-Spritze und vermeiden Sie Luftspalte oder Blasen in der Spritzenspitze.

Legen Sie die Spritze in eine Seite der Patrone neben dem rotierenden Block ein. Füllen Sie dann eine Ein-Milliliter-Spritze mit T704 und synthetischer Peptidmischungslösung und entfernen Sie alle Blasen oder Luftspalte an der Spritzenspitze. Setzen Sie die Spritze in den anderen Einlass der Pumpe ein und stellen Sie die Pumpe auf eine Gesamtdurchflussrate von 4 bis 10 Milliliter pro Minute ein.

Platzieren Sie ein zehn-Milliliter-RNase-freies konisches Röhrchen, um die gemischte IVT-mRNA/PP-sNp-Lösung am Ende des Fließwegs der Mischvorrichtung zu sammeln. Führen Sie die Pumpe aus, um das Mischen zu starten, und stellen Sie sicher, dass die Parameter korrekt eingegeben werden. Nachdem Sie die Pumpe sechs Sekunden lang laufen lassen, entnehmen Sie die IVT-mRNA/PP-sNp-Probe aus dem konischen Röhrchen.

Plate humane Bronchialepithelzellen und eine dendritische Zelllinie in 96-Well-Platten 24 Stunden vor der Transfektion. Züchten Sie die Zellen in einem Kulturmedium, das mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin ergänzt wird. Nach dem Entfernen des Wachstumsmediums waschen Sie die plattierten Zellen mit 0,2 Milliliter pro Vertiefung PBS.

In jede Vertiefung, die die plattierten Zellkulturen enthält, werden 170 Mikroliter serumfreies Kulturmedium gegeben. Dann fügen Sie 30 Mikroliter IVT mRNA / PP-sNp Formulierung mit 0,4 Mikrogramm Metridia luciferase mRNA tropfenweise in jede Vertiefung hinzu. Inkubieren Sie die Zellen mit der IVT mRNA / PP-sNp Formulierung in einer befeuchteten 5% Kohlendioxid-angereicherten Atmosphäre bei 37 Grad Celsius für vier Stunden.

Das Transfektionsmedium absaugen und 0,2 Milliliter frisches Kulturmedium hinzufügen, ergänzt mit 10% hitzeinaktiviertem fetalem Rinderserum und 1% Penicillin-Streptomycin. Inkubieren Sie die transfizierten Zellen für 24 Stunden, wie zuvor gezeigt, und sammeln Sie die zu erkennenden Überstände aus jedem Bohrloch. Bereiten Sie eine frische Assaylösung vor, indem Sie PBS zum Coelenterazin-Substrat hinzufügen.

Mischen Sie die Lösung gründlich, indem Sie 10 Sekunden lang wirbeln. Fügen Sie 50 Mikroliter des gesammelten Überstands zu einer 96-Well-Platte hinzu. Stellen Sie den Mikrotiterplattenleser mit einer Lesezeit von 1.000 Millisekunden ein und geben Sie 30 Mikroliter Coelenterazin-Lösung manuell oder durch automatisierte Injektion in jede Vertiefung.

Klicken Sie unmittelbar nach der Zugabe der Coelenterazin-Lösung zum Überstand auf Start, um das Lumineszenzsignal zu messen. Das rekombinante Plasmid wurde isoliert und verdaut, um die linearisierte DNA-Vorlage herzustellen. Die In-vitro-Transkription erzeugte Upcapped und Capped MetLuc mRNA.

Zellen, die mit Metridia luciferase mRNA/PP-sNp transfiziert wurden, zeigten eine signifikant höhere Expression von Luciferase im Vergleich zu denen, die mit kommerziell erhältlichem lipidbasiertem Transfektionsreagenz, nackter Metridia luciferase mRNA, PBS oder synthetischen T7044-Peptiden, gemischter Lösung in menschlichen Bronchialepithelzellen, 16 HBE und dendritischen Zelllinien DC2.4 Metridia luciferase mRNA/PP-sNp transfiziert wurden, zeigten eine höhere Luciferase-Expression als LP, was darauf hindeutet, dass das PP-sNp-Abgabesystem wichtig ist für Schutz der MetLuc mRNA vor Abbau und zur Förderung der Transfektionseffizienz der exogenen Metridia luciferase mRNA. Bitte stellen Sie sicher, dass die synthetische Struktur der ungekappten Met-mRNA erfolgreich entfernt wird. Berechnen und laden Sie die Met-mRNA T704 und die Peptidverbindung sorgfältig herunter, um die Poloxamin-Nanopartikel vorzubereiten und zu verdichten.

Transmissionselektronenmikroskopie kann durchgeführt werden, um die Morphologie von Peptid-Poloxamin-Nanopartikeln zu beobachten. Diese Technik hilft Forschern, mukosale mRNA-Impfstoffe zu entwickeln und ermöglicht ein Hochdurchsatz-Screening von Gentherapieformulierungen für alle verwandten Zellen.