Name: Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 11 s
Description: Lernen Sie die Synthese zyklischer Peptide durch Bisalkylierung zwischen Cystein und Methionin. Diese effiziente Methode ohne Met-Katalysator ermöglicht eine einfache Peptidstabilisierung für biochemische Forschung.

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Wir danken der finanziellen Unterstützung durch das National Key R&D Program of China (2021YFC2103900); die Zuschüsse der Natural Science Foundation of China (21778009 und 21977010); die Natural Science Foundation der Provinz Guangdong (2022A1515010996 und 2020A1515010521): das Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (RCJC20200714114433053, JCYJ201805081522131455 und JCYJ20200109140406047); und das Shenzhen-Hong Kong Institute of Brain Science-Shenzhen Fundamental Research Institutions Stipendium (2019SHIBS0004). Die Autoren bestätigen die Unterstützung der Zeitschrift durch Chemical Science, die Royal Society of Chemistry für Referenz 30 und das Journal of Organic Chemistry, American Chemical Society, für Referenz 31.

1. Vorbereitung der Ausrüstung
ACHTUNG: Morpholin, N,N-Dimethylformamid (DMF), Dichlormethan (DCM), N,N-Diisopropylethylamin (DIPEA), TFA, Morpholin, Piperidin, Diethylether und Methanol sind giftig, flüchtig und ätzend. Diese Reagenzien können den menschlichen Körper durch Einatmen, Verschlucken oder Hautkontakt schädigen. Verwenden Sie für alle chemischen Experimente Schutzausrüstung, einschließlich Einweghandschuhe, experimentelle Mäntel und Schutzbrillen.
<ol><li>Konstruieren Sie alle Peptidsubstrate auf Rink-amid-4-Methylbenzhydrylamin (MBHA)-Harz durch standardmäßige manuelle Fmoc-basierte Festphasenpeptidsynthese (SPPS)29, wie in Abbildung 1 gezeigt.</li>
	<li>Verwenden Sie eine der beiden Optionen zum Aufbau linearer Peptide: erstens, synthetisieren Sie das Peptid unter Verwendung des Kondensationsmittels 2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N,N'-Tetramethyluroniumhexafluorophosphat (HATU) und einem Reagenz von DIPEA; oder zwei, unter Verwendung von 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und N,N'-Diisopropylcarbodiimid (DIC) als Amidkondensationsreagenz synthetisieren. Wählen Sie ein geeignetes Protokoll für die Peptidsynthese entsprechend der Sequenz des Peptids aus.</li>
	<li>Um eine manuelle Peptidsynthesevorrichtung einzurichten, stellen Sie eine modifizierte Vakuum-Festphasenextraktionsanlage in einem Abzug auf und verbinden Sie sie mit einem Dreiwegehahn. Als nächstes platzieren Sie eine Polypropylen-Filterpatrone oder einen Glasreaktor auf dem Gerät, während es an Stickstoffgas (N2) angeschlossen ist. HINWEIS: Um die Vakuum-Festphasenextraktionsausrüstung zu modifizieren, entfernen Sie das Absaugrohr und halten Sie das vakuumdichte System.</li>
	<li>Laden Sie MBHA-Harz in die harzgefüllten Säulen und lösen Sie es in DMF auf. Stellen Sie den Schalter der Dreiwege-Absperrhähne aufN2-Sprudeln ein und entfernen Sie dann das Lösungsmittel in der Kolonne mit einer Arbeitspumpe, die an ein Vakuumsystem angeschlossen ist. Berechnen Sie die Menge an Aminosäure oder Kondensationsmittel, die benötigt wird, indem Sie die folgende Formel verwenden: Aminosäure (g) und Kondensationsmittel (g) = Harzskala (g) × Harzladekapazität (mM/g) × äquivalent (5 Äq) × Molekulargewicht (g/M) HINWEIS: Wählen Sie die Menge des geladenen Harzes entsprechend der Länge des Kopplungspeptids. Mehrere Äquivalente (eq) von Aminosäuren werden verwendet, um vollständiger zu reagieren. Flüssige Lösungsmittel müssen durch Dichte in Volumen umgewandelt werden. Die 5 eq zeigt, dass die Eingangsmenge der berechneten Verbindung um den Faktor fünf verstärkt wird.</li>
</ol>2. Harzaufbereitung
HINWEIS: Wählen Sie die Menge des geladenen Harzes entsprechend der Länge des Kopplungspeptids.
<ol><li>Wiegen Sie 302 mg Rink-amid MBHA-Harz (0,331 mM/g geladen) in eine Säule (20 mL Reservoir). Geben Sie 5-10 mL DCM oder DMF in die Säule, um das Harz unter N2 blubbernd für 30 min aufzuquellen.</li>
	<li>Schließen Sie anschließend den Schalter N2 und schalten Sie dann den Vakuumpumpen-Saugschalter ein, um das Lösungsmittel zu entfernen. Dann waschen Sie die Harze nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>3. N-Terminal Fmoc Deprotection
HINWEIS: Die Deprotektion durch Morpholin dauert 30 min, und die Deprotektion durch Piperidin dauert 5 min.
<ol><li>Bereiten Sie die N-terminale 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc)-Deschutzlösung vor: Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen (500 ml) von 20% (v/v) Piperidin oder 50% (v/v) Morpholin in DMF in einem Glasbehälter für den Deschutz der Fmoc-Gruppe vor.</li>
	<li>10 ml der Deprotection-Lösung in die Säule geben,N2 für 30 min oder 5 min 2x in die Lösung blasen und die Deprotection-Verfahren 2x wiederholen.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Detektieren Sie das Harz als dunkelgelbe Farblösung durch 5% Ninhydrin (Kaiser-Test) nach jeder Deprotektion, um das Fehlen der Fmoc-Gruppe vor dem Kopplungsschritt zu bestätigen. Im Detail fügen Sie 1 ml DMF zu einer kleinen Menge Harz hinzu und geben Sie 200 μL 5% Ninhydrin in ein Glasrohr, das 3 min lang bei 130 °C erhitzt wird, um Änderungen der Harzfarbe zu beurteilen.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
</ol>4. Kopplung des linearen Peptids (Abbildung 2)
HINWEIS: Wenn die synthetischen Peptidsequenzen zwei oder mehr sich wiederholende Einheiten enthalten, kann der Kopplungsvorgang direkt durch Auswahl des Aminosäuretyps wie Fmoc-AA-OH oder Fmoc-AAA-OH usw. durchgeführt werden. Einige spezielle Aminosäuren mit sterischer Behinderung und Peptide mit längeren Aminosäuresequenzen sind erforderlich, um die Reaktionszeit für die Kopplung richtig zu verlängern.
<ol><li>Nehmen Sie für einen einzelnen Kopplungsschritt die Kopplung von Cys-Rückständen als Beispiel (synthetisieren Sie 300 mg Harzwaagen). Eine Mischungslösung mit Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 Äq., 292 mg) und HATU (5 Äq., 206 mg) oder Fmoc-Cys(Trt)-OH (5 Äq., 292 mg) und HOBT (5 Äq., 106 mg) wird in einem Polypropylenröhrchen hergestellt und in 3 ml DMF gelöst.</li>
	<li>Fügen Sie 173 μL DIPEA (10 Äq) oder 154 μL DIC (10 Äq) zur Lösung von Cys hinzu, um die Aminosäure zu aktivieren. Lassen Sie die Mischung für 1 min voraktivieren. Die Mischung mit Harz in die Säule geben und mitN2 für 2 h blasen. HINWEIS: Die spezifische Reaktionszeit sollte standardisiert werden, um 5% Ninhydrin nachzuweisen.</li>
	<li>Nach dem Ankuppeln 1 mL DMF zu einer kleinen Menge Harz geben und 200 μL 5% Ninhydrin in ein Glasrohr geben, das 3 min lang bei 130 °C erhitzt wird. Beobachten Sie, wie sich das Harz in farblos ändert, um das Fehlen einer freien Aminogruppe vor dem Deprotektionsschritt zu bestätigen.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>10 ml der Deprotection-Lösung in die Säule geben, mitN2 für 30 min oder 5 min 2x blasen, frische Lösung hinzufügen und die Deprotection-Verfahren 2x wiederholen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die folgenden Schritte: Deprotection der Fmoc-Gruppe; Erkennung des Harzschutzes; Waschen des Harzes; Kopplung der Aminosäure; Detektion der Kopplungsreaktion. Wiederholen Sie den Kopplungsschritt, bis alle Peptide synthetisiert sind. HINWEIS: Verwenden Sie den Kaiser-Test, um zu überwachen, ob jeder Schritt der Deprotektion abgeschlossen ist oder ob jeder Schritt der Aminosäurekupplung gründlich ist. Alternativ kann eine kleine Menge Peptid aus dem Harz abgespalten und von LC-MS auf eine erfolgreiche Kopplung überprüft werden.</li>
</ol>5. Bisalkylierung zwischen Met und Cys (Abbildung 3)
<ol><li>Konstruieren Sie ein lineares Peptid mit Met und Cys, indem Sie die Schritte 4.1-4.6 wiederholen. 10 ml wasserfreies Methanol in die Säule mit Harz zur Dehydrierung geben und mitN2 für die nächste Verwendung (Wiederholung 2x) nach linearer Peptidkopplung trocknen.</li>
	<li>100 mg des im vorherigen Schritt erhaltenen Harzes werden in eine Säule (20-ml-Reservoir) eingewogen und das Harz vor dem Kupplungsschritt mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) gewaschen.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung zum Entfernen der Cys trt(trityl)-Schutzgruppe vor. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen (100 ml) TFA/TIS/DCM (3:5:92) Gemisch in einem Glasbehälter vor, um die Schutzgruppe zu entfernen.</li>
	<li>Geben Sie 5-10 ml der Lösung von TFA/TIS/DCM (3:5:92) in die Säule, um die Schutzgruppe für 10 min zu entfernen. Sechsmal wiederholen, wobei N2 blubbert, bis die gelbe Farbe vollständig verschwindet.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung für die Reaktion mit degeschützten Cys vor. Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen (50 ml) Mischungslösung (DMF) einschließlich dihalogenierter Linker (2 Äq) und DIPEA (4 Äq) für die Reaktion mit degeschützten Cys vor.</li>
	<li>5-10 mL der Reaktionslösung in die Säule geben, um mit degeschützten Cys für mindestens 3 h mitN2-Blubbern zu reagieren. Mit wasserfreiem Methanol dehydrieren und für die nächste Verwendung mitN2 trocknen.</li>
	<li>Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) 5x.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Lösung für die Peptidcyclisierung vor: Bereiten Sie ein ausreichendes Volumen (20 ml) TFA-Gemisch (TFA:TIS:H2O= 95:2,5:2,5) in einem Glasbehälter im Abzug für die Peptidcyclisierung vor.</li>
	<li>5-10 mL der TFA-Mischlösung in das Polypropylenrohr geben und das Harz unter dem TFA-Cocktail für 3 h spalten. ACHTUNG: TFA ist stark ätzend und reizend; Der Peptidspaltprozess sollte in einem Abzug durchgeführt werden.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 7.1-7.5 durch, um eine lineare Peptidlösung durch Umkehrphasen-Flüssigphasenreinigung (HPLC) zu erhalten. Gefriertrocknen Sie die Lösung für die nächste Verwendung.</li>
</ol>6. Propargyl sulfonium Salzcyclisierung (Abbildung 4)
<ol><li>Konstruieren Sie ein lineares Peptid mit Met und Cys, indem Sie die Schritte 4.1-4.6 wiederholen. 10 ml wasserfreies Methanol in die Säule mit dem Harz zur Dehydrierung geben und mitN2 für die nächste Verwendung (zweimal wiederholen) nach linearer Peptidkopplung trocknen.</li>
	<li>100 mg des im vorherigen Schritt erhaltenen Harzes werden in eine Säule (20-ml-Reservoir) eingewogen und das Harz vor dem Kupplungsschritt mit DCM (5-10 ml) und DMF (5-10 ml) gewaschen.</li>
	<li>Führen Sie die Schritte 7.1-7.5 durch, um eine lineare Peptidlösung mittels HPLC zu erhalten, und gefriertrocknen Sie die Probe wie erwähnt für die nächste Verwendung.</li>
	<li>Eine 1%ige wässrige HCOOH-Lösung (in Volumen) und 1,0 mM Propargybromid (5 Äq.) hergestellt und zur Met-Peptidlösung (0,2 mM, 1 Äq.; 0,2 mL MeCN/H2O[1:1, v/v]) gegeben.</li>
	<li>Als nächstes schütteln Sie die Kupplungsreaktion von Met und Propargylabromid bei Raumtemperatur für 12 h.</li>
	<li>Nach der Reaktion wird das Produkt in einem Polypropylenrohr in Acetonitril gelöst und durch eine 0,22 μmFiltermembran filtriert. Dann reinigen Sie die Lösung sofort durch Umkehrphasen-HPLC und gefriertrocknen Sie sie zu Pulver für die nächste Verwendung.</li>
	<li>Im letzten Schritt wird das Peptid mit Propargybromid in ein Polypropylenröhrchen gegeben, der pH-Wert der Reaktionslösung durch Zugabe von (NH4)2CO3-Lösung bei 8,0 gehalten und das Reaktionsgemisch bei 37 °C für 12 h geschüttelt. Dieser Schritt erhält das cyclische Peptid von Propargysulfoniumsalz.</li>
	<li>Sammeln Sie das letzte Reaktionsgemisch: Lösen Sie es in einem Polypropylenrohr in Acetonitril und filtrieren Sie es durch eine 0,22 μm Filtermembran. Dann reinigen Sie die Lösung sofort durch Umkehrphasen-HPLC und gefriertrocknen Sie sie zu Pulver für die nächste Verwendung.</li>
</ol>7. Reinigung von cyclischen Peptiden
<ol><li>Konstruieren Sie lineare Peptidsubstrate auf Rink-amid-MBHA-Harz, indem Sie die Schritte 4.1-4.6 wiederholen. 10 mL wasserfreies Methanol mit Harz zur Dehydrierung in die Säule geben und mitN2 für die nächste Verwendung (zweimal wiederholen) nach linearer Peptidkopplung trocknen.</li>
	<li>Bereiten Sie im Abzug eine ausreichende Menge Dekolleté-Cocktail (TFA/H 2 O/TIS, v/v/v, 95:2,5:5:2,5) zu. 1-5 mL TFA-Mischlösung in das Polypropylenrohr geben und das Harz unter dem TFA-Cocktail für 3 h spalten.</li>
	<li>Als nächstes trocknen Sie das Harz nacheinander unter einem Dampf vonN2 in der Säule. Alternativ können Sie eine Filtervorrichtung verwenden, um das Harz zu filtern und die Peptidlösung zu sammeln. Dann fügen Sie 20 ml Ether zur Peptidlösung hinzu, um das Peptid auszufällen, zentrifugieren Sie bei 3.500 x g für 5 min und wiederholen Sie zweimal. Sammeln Sie den rohen Peptidniederschlag und trocknen Sie ihn unter einem Strom von N2 für den nächsten Schritt.</li>
	<li>200 mg Rohpeptid werden in einem Polypropylenröhrchen in 4 ml Acetonitril-Wasser-Lösung gelöst und durch einen 0,22-μm-Filter filtriert. Übertragen Sie das Peptid in einen HPLC-Fläschcheneinsatz. Legen Sie den Einsatz in den Autosampler eines semipräparativen Umkehrphasen-HPLC-Systems, das mit einer C18 5 μm, 4,6 mm x 250 mm Säule und einer 1 ml Injektionsschleife ausgestattet ist.</li>
	<li>Reinigen und isolieren Sie das Peptid mit einem Gradientenprogramm von 5% -95% Acetonitril in Wasser mit 0,1% TFA über 30 Minuten, während die HPLC-Spektren mit UV bei 254 nm überwacht werden. Bestätigen Sie das Molekulargewicht des Peptids durch LC-MS, sammeln Sie die Lösung des Peptids und gefriertrocknen Sie es für die nächste Verwendung zu Pulver.</li>
</ol>

<ol><li>Arkin, M. R., Tang, Y. Y., Wells, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Small-molecule+inhibitors+of+protein-protein+interactions%3A+Progressing+toward+the+reality%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry+Biology%22%5BJournal%5D)">Small-molecule inhibitors of protein-protein interactions: Progressing toward the reality.</a> Chemistry Biology. 21 (9), 1102-1114 (2014).</li>
<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bis-alkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bis-alkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Muttenthaler, M., King, G. F., Adams, D. J., Alewood, P. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trends+in+peptide+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Trends in peptide drug discovery.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 20 (4), 309-325 (2021).</li>
<li>White, C. J., Yudin, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contemporary+strategies+for+peptide+macrocyclization%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Contemporary strategies for peptide macrocyclization.</a> Nature Chemistry. 3 (7), 509-524 (2011).</li>
<li>Victoria, G. G., Reddy, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advances+in+the+synthesis+of+organic+chloramines+and+their+insights+into+health+care%5BTitle%5D)+AND+%22New+Journal+of+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Recent advances in the synthesis of organic chloramines and their insights into health care.</a> New Journal of Chemistry. 45, 8386-8408 (2021).</li>
<li>Kim, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conformation+and+stereoselective+reduction+of+hapten+side+chains+in+the+antibody+combining+site%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Conformation and stereoselective reduction of hapten side chains in the antibody combining site.</a> Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9392-9394 (1991).</li>
<li>Waddington, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organometallic+strategy+for+cysteine+borylation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">An organometallic strategy for cysteine borylation.</a> Journal of the American Chemical Society. 143 (23), 8661-8668 (2021).</li>
<li>Luong, H. X., Bui, H. T. P., Tung, T. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+all-hydrocarbon+stapling+technique+in+the+design+of+membrane-active+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Application of the all-hydrocarbon stapling technique in the design of membrane-active peptides.</a> Journal of Medicinal Chemistry. 65 (4), 3026-3045 (2022).</li>
<li>Góngora-Benítez, M., Tulla-Puche, J., Albericio, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifaceted+roles+of+disulfide+bonds.+peptides+as+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multifaceted roles of disulfide bonds. peptides as therapeutics.</a> Chemical Reviews. 114 (2), 901-926 (2014).</li>
<li>Li, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+stapling+of+native+peptides+at+lysine+and+tyrosine+or+arginine+with+formaldehyde%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Cooperative stapling of native peptides at lysine and tyrosine or arginine with formaldehyde.</a> Angewandte Chemie International Edition. 60 (12), 6646-6652 (2021).</li>
<li>Blaum, B. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lysine+and+arginine+side+chains+in+glycosaminoglycan-protein+complexes+investigated+by+NMR%2C+cross-Linking%2C+and+mass+spectrometry%3A+a+case+study+of+the+factor+h-heparin+Interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+American+Chemical+Society%22%5BJournal%5D)">Lysine and arginine side chains in glycosaminoglycan-protein complexes investigated by NMR, cross-Linking, and mass spectrometry: a case study of the factor h-heparin Interaction.</a> Journal of the American Chemical Society. 132 (18), 6374-6381 (2010).</li>
<li>Petitdemange, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+tuning+of+elastin-like+polypeptide+properties+via+methionine+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Selective tuning of elastin-like polypeptide properties via methionine oxidation.</a> Biomacromolecules. 18 (2), 544-550 (2016).</li>
<li>Kadlcik, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+modification+of+a+methionine+residue+in+the+amyloid-beta+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Reductive modification of a methionine residue in the amyloid-beta peptide.</a> Angewandte Chemie International Edition. 45 (16), 259(2006).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
<li>Reddy, C. B. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+activity+of+3-%281-chloropiperidin-4-yl%29-6-fluoro+benzisoxazole+2+against+white+spot+syndrome+virus+in+freshwater+crab%2C+Paratelphusa+hydrodomous%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+Research%22%5BJournal%5D)">Antiviral activity of 3-(1-chloropiperidin-4-yl)-6-fluoro benzisoxazole 2 against white spot syndrome virus in freshwater crab, Paratelphusa hydrodomous.</a> Aquaculture Research. 47 (8), 2677-2681 (2015).</li>
<li>Embaby, A. M., Schoffelen, S., Kofoed, C., Meldal, M., Diness, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rational+tuning+of+fluorobenzene+probes+for+cysteine-selective+protein+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Rational tuning of fluorobenzene probes for cysteine-selective protein modification.</a> Angewandte Chemie International Edition. 57 (27), 8022-8026 (2018).</li>
<li>Jiang, H. F., Chen, W. J., Wang, J., Zhang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+N-terminal+modification+of+peptides+and+proteins%3A+recent+progresses+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+Chemical+Letters%22%5BJournal%5D)">Selective N-terminal modification of peptides and proteins: recent progresses and applications.</a> Chinese Chemical Letters. 33 (1), 80-88 (2022).</li>
<li>Yu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDZ-reactive+peptide+activates+ephrin-B+reverse+signaling+and+inhibits+neuronal+chemotaxis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">PDZ-reactive peptide activates ephrin-B reverse signaling and inhibits neuronal chemotaxis.</a> ACS Chemical Biology. 11 (1), 149-158 (2016).</li>
<li>Huhn, A. J., Guerra, R. M., Harvey, E. P., Bird, G. H., Walensky, L. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+covalent+targeting+of+anti-apoptotic+BFL-1+by+cysteine-reactive+stapled+peptide+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective covalent targeting of anti-apoptotic BFL-1 by cysteine-reactive stapled peptide inhibitors.</a> Cell Chemical Biology. 23 (9), 1123-1134 (2016).</li>
<li>Chow, H. Y., Zhang, Y., Matheson, E., Li, X. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ligation+technologies+for+the+synthesis+of+cyclic+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Ligation technologies for the synthesis of cyclic peptides.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9971-10001 (2019).</li>
<li>Zhang, H. Y., Chen, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclic+peptide+drugs+approved+in+the+last+two+decades+%282001-2021%29%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Chemical+Biology%22%5BJournal%5D)">Cyclic peptide drugs approved in the last two decades (2001-2021).</a> RSC Chemical Biology. 3 (1), 18-31 (2021).</li>
<li>Lee, Y. J., Han, S. H., Lim, Y. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+stabilization+and+multimerization+of+a+peptide+alpha-helix+by+stapling+polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22Macromolecular+Rapid+Communications%22%5BJournal%5D)">Simultaneous stabilization and multimerization of a peptide alpha-helix by stapling polymerization.</a> Macromolecular Rapid Communications. 37 (13), 1021-1026 (2016).</li>
<li>Karthikeyan, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-viral+activity+of+methyl+1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo%5Bd%5D+imidazole-5-carboxylate+against+white+spot+syndrome+virus+in+freshwater+crab+%28Paratelphusa+hydrodromous%29%5BTitle%5D)+AND+%22Aquaculture+International%22%5BJournal%5D)">Anti-viral activity of methyl 1-chloro-7-methyl-2-propyl-1h-benzo[d] imidazole-5-carboxylate against white spot syndrome virus in freshwater crab (Paratelphusa hydrodromous).</a> Aquaculture International. 30, 989-998 (2022).</li>
<li>Zhao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crosslinked+aspartic+acids+as+helix-nucleating+templates%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).</li>
<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-tether+chiral+center+modulates+the+helicity%2C+cell+permeability%2C+and+target+binding+affinity+of+a+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie+International+Edition%22%5BJournal%5D)">An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide.</a> Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).</li>
<li>Hu, K., Sun, C., Li, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+and+versatile+on-tether+modification+of+chiral-center-induced+helical+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides.</a> Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).</li>
<li>Kramer, J. R., Deming, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+chemoselective+tagging+and+functionalization+of+methionine+containing+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Communications%22%5BJournal%5D)">Reversible chemoselective tagging and functionalization of methionine containing peptides.</a> Chemical Communications. 49 (45), 5144-5146 (2013).</li>
<li>Shi, X. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversible+stapling+of+unprotected+peptides+via+chemoselective+methionine+bisalkylation%2Fdealkylation%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">Reversible stapling of unprotected peptides via chemoselective methionine bisalkylation/dealkylation.</a> Chemical Science. 9 (12), 3227-3232 (2018).</li>
<li>Merrifield, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+phase+synthesis.+Nobel+lecture%2C+8+December+1984%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Reports%22%5BJournal%5D)">Solid phase synthesis. Nobel lecture, 8 December 1984.</a> Bioscience Reports. 5 (5), 353-376 (1985).</li>
<li>Wang, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+tethered+peptide+ligand+rapidly+and+selectively+modifies+protein+cysteine+in+vicinity%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Science%22%5BJournal%5D)">A sulfonium tethered peptide ligand rapidly and selectively modifies protein cysteine in vicinity.</a> Chemical Science. 10 (19), 4966-4972 (2019).</li>
<li>Hou, Z. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sulfonium+triggered+thiol-yne+reaction+for+cysteine+modification%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Organic+Chemistry%22%5BJournal%5D)">A sulfonium triggered thiol-yne reaction for cysteine modification.</a> The Journal of Organic Chemistry. 85 (3), 1698-1705 (2020).</li>
<li>Reguera, L., Rivera, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicomponent+reaction+toolbox+for+peptide+macrocyclization+and+stapling%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Reviews%22%5BJournal%5D)">Multicomponent reaction toolbox for peptide macrocyclization and stapling.</a> Chemical Reviews. 119 (17), 9836-9860 (2019).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Der in diesem Artikel beschriebene synthetische Ansatz bietet eine Methode zur Synthese zyklischer Peptide unter Verwendung von Cys und Met in der Peptidsequenz, in der die grundlegenden linearen Peptide durch gängige Festphasen-Peptidsynthesetechniken aufgebaut werden. Für die Bisalkylierung von cyclischen Peptiden zwischen Cys und Met kann die gesamte Syntheseroute in drei Hauptprozesse unterteilt werden: die Deprotection von Cys auf dem Harz, die Kopplung des Linkers und die Cyclisierung zwischen Cys und Met in einer ...

Protein-Protein-Interaktionen (PPI)1 spielen eine zentrale Rolle in der Arzneimittelforschung und -entwicklung. Die Konstruktion stabilisierter Peptide mit fester Konformation durch chemische Mittel ist eine der wichtigsten Methoden zur Entwicklung mimetischer Motive von PPI2. Bisher wurden mehrere zyklische Peptide, die auf PPI abzielen, für den klinischen Einsatz entwickelt3. Die meisten Peptide sind auf eine α-Helix-Konformation beschränkt, um die Konformationsentropie zu verringern und die metabolische Stabilität, Zielbindungsaffinität und Zellpermeabilität zu verbessern 4,5. In den letzten 2 Jahrzehnten wurden die Seitenketten von Cys 6,7, Lysin8,9, Tryptophan 10, Arginin 11 und Met12,13 in unnatürliche Aminosäuren eingefügt, um das Peptid in eine zyklische Konformation zu fixieren. Solche zyklischen Peptide können auf einen einzigartigen chemischen Raum oder spezielle Stellen abzielen und dadurch eine kovalente Reaktion auslösen, um eine kovalente Protein-Peptid-Bindung14,15,16,17 zu bilden. In einem kürzlich veröffentlichten Bericht von Yu et al. wurde ein Chloracetamid in der Domäne von Peptidliganden verankert, was eine kovalente Konjugationsreaktion mit ausgezeichneter Proteinspezifität gewährleistet18. Darüber hinaus wurden elektrophile Gefechtsköpfe wie Acrylamid und Arylsulfonylfluorid (ArSO2F) von Walensky et al.19 weiter in Peptide eingebaut, um stabilisierte kovalente Peptidinhibitoren zu bilden und die Antitumorwirkung von Peptidinhibitoren zu verbessern. Daher ist es sehr wichtig, eine zusätzliche funktionelle Gruppe einzuführen, um Protein-Peptid-Liganden kovalent zu modifizieren20. Diese Gruppen reagieren nicht nur mit Proteinen auf der Seitenkette, sondern stabilisieren auch die Sekundärstruktur des Peptids21. Die Anwendung kovalent modifizierter Proteine, die durch Peptidliganden induziert werden, ist jedoch aufgrund des komplizierten Syntheseweges und der unspezifischen Bindung der chemischen Gruppen22,23 begrenzt. Effektive Strategien zur Synthese zyklischer Peptide sind daher dringend erforderlich.
Inspiriert von den vielfältigen Strategien der zyklischen Peptide 2,24,25,26 versucht dieses Protokoll, eine einfache und effiziente Methode zur Stabilisierung von Peptiden zu entwickeln. Darüber hinaus stellten wir fest, dass die Seitenkettengruppe eines stabilen Peptids kovalent mit einem Zielprotein reagieren konnte, wenn es räumlich nahe an den Peptidliganden war. Der Mangel an chemisch modifiziertem Met wurde 2013 von der Deming-Gruppe durch die Entwicklung einer neuartigen Methode zur Herstellung des selektiv modifizierten Peptids Methionin27 behoben. Vor diesem Hintergrund konzentrierten sich die Shi et al. auf die Entwicklung des Ringverschlusses von Seitenketten zu einem Sulfoniumsalzzentrum. Wenn sich der Peptidligand mit dem Zielprotein verbindet, reagiert die Sulfoniumsalzgruppe kovalent mit dem räumlich nahen Cys-Protein. In den letzten Jahren haben Shi et al. eine neue Methode zur Stabilisierung des zyklischen Peptids28 entwickelt. Das Sulfoniumsalz auf dem cyclischen Peptid wurde durch ein Reduktionsmittel mit einer Sulfhydrylgruppe reduziert, die reversibel zu Met reduziert wurde. Die Reaktion hatte jedoch eine geringe Effizienz, was für nachfolgende biologische Anwendungsstudien schädlich war. In der aktuellen Studie wurde eine Met-Cys- und Propargybromid-Cys-Ringschlussreaktion entworfen, bei der ein einzelnes Sulfoniumsalz auf der Seitenkette des cyclischen Peptids verbleibt. Das Sulfoniumsalz fungierte als neuer Gefechtskopf, der in räumlicher Nähe kovalent mit dem Protein Cys reagierte. Kurz gesagt, ein Cys- und Met-mutiertes Peptid wurde durch intramolekulare Alkylierung zyklisiert, was zur Erzeugung eines On-Tether-Sulfoniumzentrums führte. In diesem Prozess war die Bildung einer Seitenkettenbrücke entscheidend für cyclische Peptide. Insgesamt beschreibt dieses Protokoll eine detaillierte sulfoniumbasierte Peptidcyclisierung, die unter einfachen Reaktionsbedingungen und Operationen erreicht wird. Ziel ist es, eine mögliche Methode für weitere breite biologische Anwendungen zu entwickeln.

<table><tbody><tr><td>1,3-Bis(brommethyl)-benzon</td><td>Energy</td><td>D0215</td><td></td></tr><tr><td>1,3-Dimethylbarbitursäure</td><td>Energy</td><td>A46873</td><td></td></tr><tr><td>1H NMR und HSQC</td><td>Bruker</td><td>&nbsp; AVANCE-III 400</td><td></td></tr><tr><td>1-Hydroxybenzotriazol-Hydrat</td><td>Energy</td><td>E020543</td><td></td></tr><tr><td>2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-Tetramethyluroniumhexafluorphosphat (HATU)</td><td>Energy</td><td>A1797</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptopyridin</td><td>Energy</td><td>Y31130</td><td></td></tr><tr><td>6-Aminocapronsäure</td><td>Energy</td><td>A010678</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureanhydrid</td><td>Energie</td><td>A01021454</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitril</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumcarbonat</td><td>Energie</td><td>12980</td><td></td></tr><tr><td>Dichlormethan (DCM)</td><td>Energie</td><td>W330229</td><td></td></tr><tr><td>Digital Heizung Kühlung Trockenbad</td><td>&nbsp; Thermo Scientific</td><td>88880029</td><td></td></tr><tr><td>Diisopropylethylamin (DIPEA)</td><td>Energy</td><td>W320014</td><td></td></tr><tr><td>Dimethylformamid (DMF)</td><td>Energy</td><td>B020051</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Energy</td><td>A10027</td><td></td></tr><tr><td>Elektrospray Ionisationsmasse</td><td>SHIMADZU2020</td><td>&nbsp; LC-MS2020</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ala-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30101</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Arg(Pbf)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Cys(Trt)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Gln(Trt)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Glu(OtBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-His(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R30902</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ile-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31001</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31201</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Met-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31301</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Pro-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31501</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Ser(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31601</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Thr(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31701</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Trp(Boc)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31801</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Tyr(tBu)-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R31901</td><td></td></tr><tr><td>Fmoc-Val-OH</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd</td><td>R32001</td><td></td></tr><tr><td>Ameisensäure</td><td>Energie</td><td>W810042</td><td></td></tr><tr><td>Hochleistungsflüssigkeit Chromatographie</td><td>SHIMADZU</td><td>LC-2030</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Aldrich</td><td>9758</td><td></td></tr><tr><td>Morpholin</td><td>Aldrich</td><td>M109062</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-Diisopropylcarbodiimid</td><td>Energie</td><td>B010023</td><td></td></tr><tr><td>Ninhydrin Reagenz</td><td>Energy</td><td>N7285</td><td></td></tr><tr><td>Propargylbromid</td><td>Energy</td><td>W320293</td><td></td></tr><tr><td>Rink Amide MBHA Harz</td><td>Nanjing Peptide Biotech Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Probenentnahmeplatten für die Festphasenextraktion (SPE)</td><td> Thermo Scientific</td><td>60300-403</td><td></td></tr><tr><td>Tetrakis (Triphenylphosphin) Palladium</td><td>Energy</td><td>T1350</td><td></td></tr><tr><td>Dreiwege-Absperrhähne</td><td>Bio-Rad</td><td>7328107</td><td></td></tr><tr><td>Triethylamin</td><td>Energy</td><td>B010737</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure (TFA)</td><td>J& K</td><td>101398</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilan (TIS)</td><td>Energie</td><td>T1533</td><td></td></tr></tbody></table>

konstruktion zyklischer peptide mit einem on-tether-sulfoniumzentrum

Constructing Cyclic Peptides Using an On-Tether Sulfonium Center

In den letzten Jahren haben zyklische Peptide aufgrund ihrer hervorragenden biologischen Aktivitäten zunehmend Aufmerksamkeit im Bereich der Wirkstoffforschung erregt und werden daher klinisch eingesetzt. Es ist daher wichtig, effektive Strategien für die Synthese zyklischer Peptide zu suchen, um ihre Anwendung im Bereich der Wirkstoffforschung zu fördern. Dieser Artikel berichtet über ein detailliertes Protokoll für die effiziente Synthese zyklischer Peptide unter Verwendung von Harz- oder intramolekularer (intermolekularer) Bisalkylierung. Unter Verwendung dieses Protokolls wurden lineare Peptide synthetisiert, indem die Festphasenpeptidsynthese mit Cystein (Cys) und Methionin (Met) gleichzeitig auf dem Harz gekoppelt wurde. Ferner wurden cyclische Peptide durch Bisalkylierung zwischen Met und Cys unter Verwendung eines abstimmbaren Tether und eines On-Tether-Sulfoniumzentrums synthetisiert. Die gesamte Syntheseroute kann in drei Hauptprozesse unterteilt werden: die Deprotection von Cys auf dem Harz, die Kopplung des Linkers und die Cyclisierung zwischen Cys und Met in einer Trifluoressigsäure (TFA) -Spaltlösung. Darüber hinaus wurde, inspiriert von der Reaktivität des Sulfoniumzentrums, eine Propargylgruppe an das Met gebunden, um die Thiol-In-Addition auszulösen und ein zyklisches Peptid zu bilden. Danach wurden die Rohpeptide getrocknet und in Acetonitril gelöst, getrennt und anschließend mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) gereinigt. Das Molekulargewicht des cyclischen Peptids wurde durch Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie (LC-MS) bestätigt, und die Stabilität der cyclischen Peptidkombination mit dem Reduktionsmittel wurde weiter mittels HPLC bestätigt. Zusätzlich wurde die chemische Verschiebung im cyclischen Peptid mittels 1 H Kernspinresonanz (1H NMR) Spektren analysiert. Insgesamt zielte dieses Protokoll darauf ab, eine effektive Strategie für die Synthese zyklischer Peptide zu etablieren.

Alle linearen Peptide wurden auf Rink-amid-MBHA-Harz durch manuelle Fmoc-Festphasensynthese synthetisiert. Ein Modell zyklisches Hexapeptid (Ac (cyclo-I)-WMAAAC-NH2) wurde wie in Abbildung 5A beschrieben konstruiert. Insbesondere wurde durch Met-Alkylierung ein neues chirales On-Tether-Zentrum erzeugt, wobei die beiden Epimere des zyklischen Peptids (Ia, Ib) durch Reverse-Phase-HPLC bestätigt wurden. Weiterhin wurden die Umwandlung und das Verhältnis von Epimeren mittels der Integ...

Dieses Protokoll stellt die Synthese zyklischer Peptide durch Bisalkylierung zwischen Cystein und Methionin und die einfache Thiol-In-Reaktion dar, die durch das Propargylsulfoniumzentrum ausgelöst wird.

Konstruktion zyklischer Peptide mit einem On-Tether-Sulfoniumzentrum

In recent years, cyclic peptides have attracted increasing attention in the field of drug discovery due to their excellent biological activities, and, as ...

In diesem Protokoll wurde das Sulfoniumsalz konstruiert, das als neue Hand fungieren konnte, die mit dem Protein Cystein auf die besondere Nähe reagierte. Der Vorteil dieser Technik war, dass diese Reaktion schnell und effizient und Met-katalysatorfrei war und eine einfache und effiziente Methode zur Stabilisierung von Peptiden entwickelte. Zu Beginn wird die N-terminale 9-Fluorinylmethyloxycarbonyl-Deprotection-Lösung aus 20% Piperidin oder 50% Morpholin und DMF in einem 500-Milliliter-Becherglas oder -Kolben hergestellt.Dann fügen Sie 10 Milliliter der Deprotection-Lösung in die Säule und blasen Stickstoff für 30 Minuten oder zweimal für fünf Minuten in die Lösung. Lassen Sie die Lösung mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander fünfmal mit Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid. Um das Harz als dunkelgelbe Farblösung zu erkennen, fügen Sie einen Milliliter N, N-Dimethylformamid zu einer kleinen Menge Harz hinzu und fügen Sie 200 Mikroliter 5% Ninhydrin zu einem Glasrohr hinzu.Erhitzen Sie es drei Minuten lang bei 130 Grad Celsius, um Veränderungen in der Harzfarbe zu beurteilen. Für die Kopplung von Peptiden wird eine Mischungslösung wie im Manuskript beschrieben in einem Polypropylenröhrchen hergestellt und in drei Milliliter N,N-Dimethylformamid gelöst. Dann fügen Sie 173 Mikroliter N, N-Diisopropylethylamin oder 154 Mikroliter N, N'diisopropylcarbodiimid zur Lösung hinzu, um die Aminosäure zu inaktivieren.Als nächstes fügen Sie die Mischung mit Harz in die Säule und blasen Sie sie zwei Stunden lang mit Stickstoff auf. Nach dem Ankuppeln einen Milliliter N,N-Dimethylformamid zu einer kleinen Menge Harz hinzufügen und 200 Mikroliter 5% Ninhydrin in ein Glasrohr geben. Erhitzen Sie es drei Minuten lang bei 130 Grad Celsius, während das Harz farblos wird, was das Fehlen einer freien Aminogruppe vor dem Deprotektionsschritt bestätigt.Nach dem Abtropfen der Lösung waschen Sie das Harz wie zuvor demonstriert und geben Sie 10 Milliliter der Deprotection-Lösung in die Säule. Dann 30 Minuten oder zweimal fünf Minuten lang mit Stickstoff sprudeln. Und wieder fügen Sie eine neue Lösung hinzu.Fügen Sie 10 Milliliter wasserfreies Methanol mit Harz zur Dehydrierung in die Säule und trocknen Sie sie mit Stickstoff für die nächste Verwendung. Wiegen Sie 100 Milligramm des Harzes in eine Säule und waschen Sie das Harz vor dem Kupplungsschritt mit Dichlormethan und N,N-Dimethylformamid. Eine Lösung zum Entfernen der Trityl-L-Cystein-Schutzgruppe wird durch Zugabe von Trifluoressigsäure, Triisopropylsilan und Dichlormethan in einem 100-Milliliter-Becherglas oder -kolben zum Entfernen der Schutzgruppe hergestellt.Geben Sie fünf bis 10 Milliliter der vorbereiteten Lösung in die Säule, um die Schutzgruppe für 10 Minuten zu entfernen. Wiederholen Sie sechsmal mit stickstoffsprudelndem Stickstoff, bis die gelbe Farbe vollständig verschwindet. Nach dem Ablassen der Lösung durch eine Vakuumpumpe waschen Sie das Harz wie zuvor gezeigt.Anschließend wird eine Lösung für die Reaktion mit degeschütztem Cystein durch Zugabe von dihalogeniertem Linker und N,N-Diisopropylethylamin in einem 50-Milliliter-Becherglas oder -Kolben mit N,N-Dimethylformamid hergestellt. Geben Sie fünf bis 10 Milliliter der Reaktionslösung in die Säule, um mindestens drei Stunden lang mit geschütztem Cystein zu reagieren, wobei Stickstoff sprudelt. Lassen Sie die Lösung erneut mit einer Vakuumpumpe ab und waschen Sie das Harz nacheinander, wie zuvor gezeigt.Zur Herstellung der Peptidcyclisierungslösung wird ein Trifluoressigsäuregemisch in ein 20-Milliliter-Becherglas oder einen Kolben im Abzug für die Peptidcyclisierung gegeben. Dann fünf bis 10 Milliliter der Mischungslösung in das Polypropylenrohr geben und das Harz drei Stunden lang unter dem Trifluoressigsäurecocktail spalten. Nach dem Dehydrieren und Waschen des Harzes, bevor der Kupplungsschritt zuvor demonstriert wurde, wird eine 1%ige Ameisensäure-wässrige Lösung und ein Millimolarpropargylbromid hergestellt und der Methioninpeptidlösung zugegeben.Als nächstes schütteln Sie die Kopplungsreaktion von Methionin und Propargylabromid bei Raumtemperatur für 12 Stunden. Nach der Reaktion das Produkt in einem Polypropylenrohr und Acetonitril lösen und durch eine 0,22 Mikrometer lange Filtermembran filtrieren. Dann reinigen Sie die Lösung sofort durch Umkehrphasen-HPLC und gefriertrocknen Sie sie zu Pulver für die nächste Verwendung.Die synthetisierten cyclischen Peptide mittels Bis-Alkylierung zwischen Cystein und Methionin wurden durch HPLC- und LCMS-Spektrum charakterisiert, was zeigt, dass die Epimere unterschiedliche Retentionszeiten und identische Molekulargewichte aufwiesen. Die HPLC-Spuren der Epimere und ihres konjugierten Produkts zeigten die zeitabhängige Umwandlung zwischen dem cyclischen Peptid und seinem Produkt. Das Molekulargewicht zyklischer Peptide, die unter Verwendung einer Thiol-In-Reaktion synthetisiert wurden, wurde mittels LCMS bestimmt und das Peptid wurde mittels HPLC isoliert und gereinigt.Die Peptide wurden weiter durch Protonen-NMR und heteronukleäre einzelne quantenkohärente Spektren charakterisiert, was die chemische Verschiebung enthüllte. Protonen-NMR-Spektren der zeitabhängigen Umwandlung zwischen cyclischem Peptid und Dithiothreitol und Deuteriumoxid wurden erhalten, um die Stabilität des Peptids aufgrund der Öffnung des Sulfoniumrings zu untersuchen. Die Ergebnisse zeigten, dass nach 24 Stunden keine Additions- oder Ringöffnungsprodukte gebildet wurden.Dieses Verfahren etablierte eine effektive Strategie zur Synthese zyklischer Peptide. Die Reaktion besagt, dass die Selektivität auch durch die Bildung einer Bestätigung verbessert wird, die das Cyclisierungspeptid stabilisiert, was darauf hindeutet, dass zyklische Peptide vielversprechende Arzneimittelkatalysatoren waren.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Chemistry

Chemie

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