Name: In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:35:00.000+00:00
Duration: 8 min 15 s
Description: Erfahren Sie die Bewertung zellulärer Immunantworten mit dem Nanoemulsionsadjuvans Ophiopogonin D. Dieses Protokoll demonstriert die Zelllieferung und Toxizität an L929-Zellen für die Impfstoffentwicklung.

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Diese Studie wurde unterstützt durch die Zuschüsse Nr. 2021YFC2302603 des National Key Research and Development Program of China, Zuschüsse Nr. 31670938, 32070924, 82041045 und 32000651 des National Natural Science Foundation Program of China, Zuschüsse Nr. 2014jcyjA0107 und Nr. 2019jcyjA-msxmx0159 des Natural Science Foundation Project Program of Chongqing, Grant No. CYS21519 des Postgraduate Research and Innovation Project of Chongqing, Zuschuss Nr. 2020XBK24 der Army Medical University Sonderprojekte und Zuschuss Nr. 202090031021 des National Innovation and Entrepreneurship Program für College-Studenten.

Alle Zellexperimente wurden in einem zelltechnischen Labor durchgeführt, das mit einfachen Operationssälen, Pufferräumen, sterilen Kulturräumen sowie Identifikations- und Analyseräumen ausgestattet war. Die Arbeitsumgebung und die Arbeitsbedingungen waren frei von mikrobieller Kontamination und anderen schädlichen Faktoren. Die Tierversuche wurden auf der Grundlage der Richtlinien für die Pflege und Verwendung von Versuchstieren durchgeführt und von der Versuchstierschutz- und Ethikkommission der Dritten Militärmedizinischen Universität genehmigt.
1. Autoklavieren und Materialaufbereitung
<ol><li>Bereiten Sie die Reagenzien und Verbrauchsmaterialien wie phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), Schere, Pinzette und Schleifgewebe durch Sterilisation mit feuchter Hitze durch Autoklavieren bei 121 °C für 20 min vor.</li>
	<li>Informationen zu den erforderlichen Reagenzien und Geräten finden Sie in der Materialtabelle. Die Formel der Blank-Nanoemulsion (BNE) finden Sie in Tabelle 1.</li>
</ol>2. L929 Zytotoxizitätstest
<ol><li>Schalten Sie das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 °C ein. Ein Röhrchen gefrorener L929-Zellen wird aus flüssigem Stickstoff entnommen und in einem 37 °C warmen Wasserbad schnell aufgetaut.</li>
	<li>Pipettieren Sie die Zellen schnell nach dem Auftauen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen, fügen Sie 2 ml DMEM hinzu und mischen Sie gut.</li>
	<li>Die Proben werden bei 129 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Fügen Sie dann 2 ml DMEM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren, und zentrifugieren Sie die Proben erneut bei 129 x g für 5 Minuten.</li>
	<li>Der Überstand wird verworfen, 6 ml vollständiges DMEM-Medium (mit 10 % FBS) zur Resuspension zugegeben und 48 h in einen T25-Kulturkolben in einem 37 °C-Inkubator mit 5 %CO2 in die Kultur überführt.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Nährmedium im Kulturkolben und waschen Sie die Zellen zweimal mit 2 ml PBS. Dann fügen Sie 1 ml 0,25% Trypsin hinzu, um die Zellen für 1-2 min bei 37 ° C zu verdauen.</li>
	<li>Wenn eine Rundung der Zellen beobachtet wird, fügen Sie 4 ml DMEM-Füllmedium hinzu, um die Verdauung sofort zu beenden und gut zu mischen. Anschließend werden die Zellen in ein steriles 15-ml-Zentrifugenröhrchen abgesaugt und bei 129 x g für 5 min zentrifugiert.</li>
	<li>Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM-Vollmedium. Verwenden Sie eine 20 μL Zellsuspension für die Zellzählung mit Zellzählplatten und verdünnen Sie die verbleibenden Zellen auf 1 x 105 Zellen/ml mit DMEM-Füllmedium.</li>
	<li>Geben Sie 100 μL Reinstwasser an den Rand einer 96-Well-Platte und geben Sie 100 μL Zellverdünnungsmittel nur in die internen Vertiefungen. Legen Sie die Platte für 4 h bei 37 °C in den Inkubator für adhärente Kultur.</li>
	<li>Nachdem die Zellen anhaften, fügen Sie OP-D und NOD separat im vollständigen DMEM-Medium zu einem Endvolumen von 200 μl / Well hinzu (die Endkonzentrationen jedes Arzneimittels betragen 480 μg / ml, 240 μg / ml, 120 μg / ml, 60 μg / ml und 30 μg / ml). Verwenden Sie für jede Konzentration drei Vertiefungen als Replikate. Dann legen Sie die Zellen für weitere 24 Stunden zurück in den Inkubator und kultivieren Sie.</li>
	<li>CCK-8 wird mit vollständigem DMEM-Medium auf 10 % verdünnt und 100 μL/Well-Verdünnungen, die das Adjuvans und die Zelllösungen enthalten, in die 96-Well-Platte gegeben. Legen Sie die Platte zurück in den Inkubator und inkubieren Sie für weitere 2-3 h.</li>
	<li>Mischen Sie häufig, während Sie die Zelllösung plattieren, um Inhomogenität durch Zellausfällung zu vermeiden. Schütteln Sie die Platte vor und nach der Zugabe des CCK-8 vorsichtig mehrmals, um das Medium und die CCK-8-Lösung gut zu mischen.</li>
	<li>Die Extinktion wird bei 450 nm mit einem Mikrotiterplatten-Reader gemessen. Richten Sie eine Nullbohrung mit nur Medium und CCK-8 ein, um einen Absorptionswert zu erhalten. Berechnen Sie genaue Extinktionswerte, indem Sie beim Plotten den Null-Absorptionswert vom erhaltenen Absorptionswert subtrahieren.</li>
	<li>Vergewissern Sie sich, dass keine Blasen in den Vertiefungen vorhanden sind, bevor Sie mit dem Mikrotiterplatten-Reader testen, da die Blasen den Assay stören.</li>
</ol>3. Stimulation der Splenozyten
<ol><li>Immunisierung von BALB/c-Mäusen im Alter von 6-8 Wochen mit 30 μg Proteinantigen plus 30 μg Adjuvans über eine intramuskuläre Injektion (200 μl) an Tag 0, Tag 7 und Tag 14 gemäß den folgenden Versuchsgruppen: (1) PBS-Gruppe, (2) Antigengruppe (Ag), (3) Antigen + OP-D (Ag/OP-D)-Gruppe, (4) Antigen + BNE (Ag/BNE)-Gruppe, (5) Antigen + NOD (Ag/NOD) Gruppe und (6) Antigen + AlPO4 (Ag/Al) Gruppe.</li>
	<li>Vorbereitungsraum: Am 24. Tag nach der Grundimmunisierung werden die Mäuse aus dem Tierraum entnommen und durch eine intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital eingeschläfert. Die Mäuse in eine Glasschale geben und 5 Minuten in 75% Alkohol einweichen.</li>
	<li>Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Zentrifugenröhrchengestell, nummerieren Sie die Einweg-Petrischalen und geben Sie 5 ml PBS mit einer 10-ml-Pipette in jede Petrischale.</li>
	<li>Machen Sie einen 6-8 cm langen Schnitt mit einer Schere in der Mitte der linken Bauchseite der Maus, reißen Sie die Haut auf, legen Sie die Bauchdecke frei und lokalisieren Sie den langen roten Streifen der Milz.</li>
	<li>Heben Sie das Peritoneum auf der unteren Seite der Milz mit einer Pinzette an, schneiden Sie es auf und drehen Sie es nach oben, um die Milz freizulegen. Heben Sie die Milz mit einer Pinzette an, trennen Sie das Bindegewebe unter der Milz mit einer Augenschere und entfernen Sie die Milz.</li>
	<li>Die Milz in eine Petrischale mit 5 ml PBS geben und mit einem Sieb (200 mesh, 70 μm) und einem Mahlstab mahlen. Nach dem Mahlen wird die Flüssigkeit entsprechend der Nummerierung in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen mit einem Winkeltropfer überführt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Flüssigkeit bei 453 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 3 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen in jedes Röhrchen, resuspendieren Sie die Zellen und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten.</li>
	<li>Geben Sie 10-12 ml PBS in jedes Röhrchen, mischen Sie das Röhrchen kopfüber und zentrifugieren Sie es bei 453 x g für 5 Minuten. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 10 ml PBS in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen.</li>
	<li>Nehmen Sie 20 μL jeder Probe in eine Vertiefung der Zellzählplatte und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler.</li>
	<li>Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. Die Zellen resuspendieren, auf 2,5 x 106 Zellen/ml mit RF-10-Medium verdünnen (Formulierungsinformationen in Tabelle 2) und bei 100 μl/Well auf eine 96-Well-Platte geben.</li>
	<li>Das Antigen wird mit RF-10-Medium auf 10 μg/ml verdünnt, 100 μl in jede Vertiefung gegeben und 3 Tage bei 37 °C in 5%CO2 inkubiert.</li>
	<li>Die aus jeder Zellgruppe erhaltene Zellsuspension wird in 1,5 ml Zentrifugenröhrchen abgesaugt, 20 Minuten lang bei 453 x g zentrifugiert und der Überstand in ein sauberes Zentrifugenröhrchen abgesaugt.</li>
	<li>Führen Sie die IFN-γ- und IL-17A-Inhaltserkennung streng gemäß den Anweisungen des ELISA-Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.</li>
	<li>Bereiten Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung (im Lieferumfang enthalten), Standard-Gradientenkonzentrationslösung (verdünnte Zytokin-Standardlösung auf 500 pg/ml, 250 pg/ml, 125 pg/ml, 62,5 pg/ml, 31,3 pg/ml und 15,6 pg/ml in dem mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffer R [1x]), biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung (verdünnte biotinylierte Antikörperlösung auf 1:100 unter Verwendung des mit dem Kit gelieferten Verdünnungspuffers R [1x] zur Bildung der Arbeitslösung), und Streptavidin-HRP-Arbeitslösung nach Bedarf.</li>
	<li>Geben Sie 100 μl/Well verdünnte Zytokin-Standardlösung in die Standardvertiefung, 100 μL/Well der Probe in die Probenvertiefung (der mit dem Kit gelieferte Verdünnungspuffer R [1x] wird für die Probenverdünnung verwendet) und 100 μL/Well des Verdünnungspuffers R (1x) in die Blindkontrollmulde.</li>
	<li>Fügen Sie eine biotinylierte Antikörper-Arbeitslösung in einer Dosis von 50 μl/well hinzu. Gut mischen, mit einer Dichtungsmembran abdecken und bei 37 °C 90 min inkubieren.</li>
	<li>Entfernen Sie die Flüssigkeit aus den Vertiefungen und fügen Sie 1x Waschpuffer-Arbeitslösung bei 300 μL/Welle hinzu. Entsorgen Sie die Flüssigkeit nach 1 Minute aus den Vertiefungen. Wiederholen Sie diesen Vorgang 4x und lassen Sie die Flüssigkeit jedes Mal auf Filterpapier trocknen.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μl/Well Streptavidin-HRP-Arbeitslösung hinzu. Die Proben werden abgedeckt und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Proben werden bei 453 x g 5 min lang zentrifugiert und der Überstand verworfen. HINWEIS: Die Waschlösung, die während des Waschvorgangs in der Reaktionsmulde verbleibt, sollte gründlich abgeklopft werden, bis kein Wasserzeichen mehr auf dem Filterpapier zu sehen ist.</li>
	<li>TMB bei 100 μL/Welle zugeben, die Platten bei 37 °C für 5-30 min im Dunkeln inkubieren und die Abbruchreaktion entsprechend der Farbtiefe in der Vertiefung (dunkelblau) beurteilen. In der Regel können 10-20 Minuten für die Farbentwicklung gute Ergebnisse erzielen.</li>
	<li>Beenden Sie die Reaktion schnell durch Zugabe von Stopplösung bei 100 μl/Well. Der Extinktionswert bei 450 nm ist innerhalb von 10 Minuten nach Beendigung zu bestimmen. HINWEIS: Gleichgewichten Sie das Reagenz vor Gebrauch 30 Minuten lang bei Raumtemperatur.</li>
</ol>4. ELISpot-Assay
<ol><li>Führen Sie die Immunisierung der Mäuse und die Entnahme von Splenozyten genau wie in den Schritten 3.1-3.10 oben beschrieben durch. Führen Sie die Tests für IFN-γ und IL-17A in strikter Übereinstimmung mit den Anweisungen des Kits durch. Die Methoden und Verfahren sind wie folgt.</li>
	<li>Nehmen Sie die Platte aus der versiegelten Verpackung, waschen Sie sie 4x mit sterilem PBS (200 μL/Well) und fügen Sie 1640 komplettes Kulturmedium (200 μL/Well) hinzu, um sie bei Raumtemperatur für 2 h auszugleichen.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium und verdünnen Sie die Splenozytensuspension mit RF-10-Medium auf 2 x 105 Zellen/ml, wobei 50 μL Zellen und Antigen pro Vertiefung hinzugefügt werden (Endkonzentration: 10 μg/ml).</li>
	<li>Stellen Sie die Platte in einen befeuchteten Inkubator bei 37 °C mit 5%CO2 für 48 h. Bewegen Sie die Platte während dieser Zeit nicht und ergreifen Sie Maßnahmen, um Verdunstung zu vermeiden (z. B. die Platte mit Alufolie umwickeln).</li>
	<li>Verdünnen Sie den Nachweisantikörper (BVD6-24G2-Biotin) auf 1 μg/ml (1:1.000) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (0,5 ml:100 ml), die 0,5 % fötales Rinderserum (PBS-0,5 % FBS) enthält. Geben Sie 100 μL/Well in die Platte und inkubieren Sie sie nach der Filtration durch eine 0,22 μm Membran 2 h bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Dekantieren Sie die Flüssigkeit in den Vertiefungen, geben Sie 1x Waschpuffer bei 200 μL/Well, und waschen Sie 5x. Jeweils 30-60 s einwirken lassen und ein letztes Mal auf Löschpapier trocknen lassen.</li>
	<li>Verdünnen Sie die Streptavidin-Meerrettichperoxidase (1:1.000) in PBS-0,5% FBS und fügen Sie 100 μL/Well hinzu. Inkubieren Sie die Platte für 1 h bei Raumtemperatur. Waschen Sie die Platte wie in Schritt 4.6.</li>
	<li>Fügen Sie 100 μL/Well gebrauchsfertige TMB-Substratlösung hinzu und entwickeln Sie, bis ein klarer Fleck erscheint. Stoppen Sie die Farbentwicklung, indem Sie ausgiebig in entionisiertem Wasser waschen (5x-6x wiederholt spülen). Entfernen Sie bei Bedarf den Düker (den weichen Kunststoff unter der Platte) und spülen Sie die Unterseite der Membran ab.</li>
	<li>Untersuchen und zählen Sie die Flecken auf einem ELISpot-Lesegerät oder Seziermikroskop, nachdem die Platte getrocknet ist.</li>
</ol>5. Aufnahme durch die Entwicklungsländer
<ol><li>Einschläferung normaler BALB/c-Mäuse durch intraperitoneale Injektion von 100 mg/kg 1%igem Natriumpentobarbital. Die Mäuse 5 Minuten lang in 75% Alkohol einweichen.</li>
	<li>Schneiden Sie mit einer Schere einen 6-8 cm langen Schnitt unter dem Bauch der Maus und klemmen Sie die beiden Enden der Öffnung ein, um sie in verschiedene Richtungen zu trennen und die Beine der Maus freizulegen. Trennen Sie den Oberschenkelknochen der Maus vom Körper der Maus und das Schienbein vom Gelenk und halten Sie die Knochen an beiden Enden intakt.</li>
	<li>Entfernen Sie das restliche Gewebe und den Knorpel aus den Gelenkgelenken an beiden Enden des Oberschenkelknochens mit Schere und Pinzette. Weichen Sie die Oberschenkelknochen 5 Minuten lang in 75% igem Alkohol ein und weichen Sie sie dann in steriler PBS-Lösung ein, um den Oberflächenalkohol abzuwaschen.</li>
	<li>Schneiden Sie die Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere ab und spülen Sie das Knochenmark in einer sterilen Petrischale mit steriler PBS-Lösung ab, gefolgt von einer Aspiration mit einer 1-ml-Spritze. Wiederholen Sie das Waschen 3x-5x.</li>
	<li>Mit einem Zellsieb (200 mesh, 70 μm) filtrieren und die BMDCs in einem 15 ml Zentrifugenröhrchen sammeln. Zentrifugieren Sie die Proben bei 290 x g für 5 min. Verwerfen Sie den Überstand, fügen Sie 4 ml Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu, resuspendieren Sie und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 5 Minuten.</li>
	<li>Fügen Sie 10 ml sterile PBS-Lösung hinzu, um das Lysat zu neutralisieren, zentrifugieren Sie bei 290 x g für 5 min und verwerfen Sie den Überstand.</li>
	<li>Resuspendieren Sie die Zellen in 1 ml DMEM, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% FBS enthält, und zählen Sie. Geben Sie dann GM-CSF (20 ng / ml) plus IL-4 (10 ng / ml) in das Medium, stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 105 / ml ein und impfen Sie die Zellen auf Deckgläsern.</li>
	<li>Die Zellsuspension wird auf eine 6-Well-Platte mit 2 ml/Vertiefung gegeben und 48 h lang bei 37 °C mit 5 %CO2 in einen befeuchteten Inkubator gestellt. Wechseln Sie das Medium nach 2 Tagen vollständig und wechseln Sie die Hälfte des Mediums nach 4 Tagen.</li>
	<li>Wählen Sie fünf Vertiefungen mit Zellen in gutem Zustand (große und röntgendurchlässige Zellen mit dendritischen Vorsprüngen auf der Zelloberfläche) mit einem inversen Mikroskop mit 100-facher Vergrößerung für das Experiment am siebten Tag der Kultur. Verwerfen Sie den Überstand, geben Sie 2 ml GFP-, OP-D + GFP- und NOD + GFP-Lösungen, verdünnt mit DMEM-Komplettmedium (GFP-Endkonzentration: 20 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml) in jede Vertiefung und inkubieren Sie die Platten bei 37 °C für 30 min im Dunkeln.</li>
	<li>Waschen Sie die Platten 3x mit PBS, geben Sie 1 ml 4% Paraformaldehyd in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für 15 min. Entfernen Sie das Paraformaldehyd nach der Fixierung, inkubieren Sie die Zellen mit Phalloidin und DAPI auf eine Endkonzentration von 10 μg/ml für 10 min zur Färbung und waschen Sie dann 3x mit PBS.</li>
	<li>Geben Sie 1 ml PBS in jede Vertiefung und beobachten Sie die Antigenaufnahme mit CLSM, wie unten beschrieben.<ol><li>Öffnen Sie die CLSM-Software, klicken Sie auf ZEN-System und warten Sie, bis die Hardwareinitialisierung abgeschlossen ist.</li>
		<li>Klicken Sie auf die GFP- und DAPI-Verknüpfungen auf der Registerkarte "Suchen", um den Bereich zu finden, der beobachtet werden kann. Schalten Sie das Leuchtstofflicht und das Durchlicht aus.</li>
		<li>Klicken Sie im Erfassungsmenü auf Smart Setup , um die Farbstoffbibliothek zu öffnen, und fügen Sie drei Fluoreszenzfarbstoffe hinzu: EGFP, Phalloidin und DAPI. Klicken Sie auf Bestes Signal > OK. Klicken Sie auf den EGFP-Kanal auf der Registerkarte Kanäle und klicken Sie auf Live , um das richtige Sichtfeld auf der rechten Benutzeroberfläche auszuwählen.</li>
		<li>Wählen Sie 1 AE für die Lochblende, drehen Sie die Feinfokussierschraube, um die Brennweite einzustellen, und wählen Sie die entsprechende Brennebene. Klicken Sie auf Reichweitenanzeige und passen Sie die Kombination aus Laserleistung und Hauptverstärkung so an, dass nur sporadische rote Punkte auf dem Bild erscheinen.</li>
		<li>Stellen Sie die Phalloidin- und DAPI-Kanäle mit den gleichen Parametern ein, ohne die Laserleistung zu ändern.</li>
		<li>Wählen Sie Live stoppen und klicken Sie auf Aufnahmemodus, um die Aufnahmeparameter zu ändern: Bildgröße: 1024 Pixel x 1024 Pixel; Scan-Geschwindigkeit: 7; Mittelwert: 2x. Klicken Sie auf Snap und wählen Sie Split, um alle aufgenommenen Bilder anzuzeigen. Speichern Sie die Bilder.</li>
	</ol></li>
</ol>6. Makrophagenaktivierung
<ol><li>Tauchen Sie C57BL / 6-Mäuse nach der Euthanasie in 75% Alkohol ein und legen Sie sie mit dem Gesicht nach oben in eine gläserne Petrischale in nummerierter Reihenfolge.</li>
	<li>Führen Sie die Mäuse durch das Transferfenster in den sterilen Operationssaal und legen Sie sie für 5 Minuten auf den Operationstisch.</li>
	<li>Mit einer Spritze 10 ml Kochsalzlösung absaugen, die Mäuse um ca. 45° nach unten kippen und in die Mitte der Bauchhöhle injizieren. Ziehen Sie etwa 5 ml Zellsuspension in ein 15-ml-Zentrifugenröhrchen für jeweils 10 ml und wiederholen Sie die Injektion 3x.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für 5 Minuten, um peritoneale primäre Makrophagen der Maus zu erhalten. Resuspendieren Sie die Zellen, stellen Sie die Zellkonzentration auf 2 x 106 Zellen/ml mit RPMI 1640 vollständigem Medium (mit 10% FBS) ein und beimpfen Sie die Zellsuspension in einer 24-Well-Platte, um eine konstante Anzahl von Zellen pro Welle (1 ml/Well) zu gewährleisten.</li>
	<li>Kultur bei 37 °C in 5%CO2 über Nacht (ca. 16-20 h), gefolgt von Inkubation mit PBS, Ag, Ag/OP-D, Ag/NOD und Ag/Al (Ag-Endkonzentration: 5 μg/ml; adjuvante Endkonzentration: 10 μg/ml; Gesamtvolumen: 2 ml) für 24 h. Die Konzentrationen von IL-1β, IL-6 und TNF-α im Kulturüberstand werden mit ELISA-Kits unter Verwendung der in den Schritten 3.12-3.19 beschriebenen Methoden und Verfahren nachgewiesen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren erklären, dass es keine konkurrierenden finanziellen oder persönlichen Interessen gibt, die die in diesem Artikel berichtete Arbeit beeinflusst haben könnten.

Subunit-Impfstoffe bieten eine ausgezeichnete Sicherheit, aber eine schlechte Immunogenität. Die Hauptstrategie zur Verbesserung der Immunogenität besteht darin, Antigene physisch zu adsorbieren oder mit Adjuvantien zu koppeln und sie in die Wirkstoffabgabesysteme zu integrieren, um die Aufnahme und Präsentation durch DCs zu fördern. Natürliche Pflanzensaponine wie Quillaia-Saponin und seine Derivate sind hochtoxisch und nicht für die Entwicklung von Humanimpfstoffengeeignet 17. Daher ist die Unte...

Impfstoffe sind ein wichtiges Mittel zur Verhütung und Behandlung von Infektionskrankheiten und nichtübertragbaren Krankheiten. Die angemessene Zugabe von Adjuvantien und Verabreichungsvehikeln zu Impfstoffformulierungen ist vorteilhaft für die Verbesserung der Immunogenität von Antigenen und die Erzeugung lang anhaltender Immunantworten1. Neben dem klassischen Adjuvans Alaun (Aluminiumsalz) gibt es sechs Arten von Adjuvantien für Impfstoffe, die derzeit auf dem Markt sind: MF592,3, AS04 3, AS03 3, AS01 3, CpG10184 und Matrix-M5. Wenn der menschliche Körper auf einen Virusangriff trifft, übernehmen im Allgemeinen die erste und zweite Verteidigungslinie (Haut, Schleimhaut und Makrophagen) die Führung bei der Beseitigung des Virus, und schließlich wird die dritte Verteidigungslinie, an der die Immunorgane und Immunzellen beteiligt sind, aktiviert. Aluminium und Aluminiumsalze sind seit den frühen 1920er Jahren die am häufigsten verwendeten Adjuvantien für Impfstoffe beim Menschen und lösen eine wirksame angeborene Immunantwort aus6. Es wurde jedoch vorgeschlagen, dass die Aktivierung von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) durch klassische Adjuvantien, die die Immunzellen dazu anregen, spezifische Sätze von Zytokinen und Chemokinen zu erzeugen, der Mechanismus ist, durch den Adjuvantien wirken und einer der Gründe sein kann, warum Adjuvantien nur vorübergehende Wirkungen auf spezifische Immunantworten ausüben7. Das Vorhandensein von begrenzt zugelassenen Adjuvantien für den menschlichen Gebrauch ist ein einschränkender Faktor für die Entwicklung von Impfstoffen, die wirksame Immunantworten hervorrufen8.
Derzeit zeigen immer mehr adjuvante Studien die Fähigkeit, eine starke zelluläre Immunantwort bei Mäusen zu induzieren. Es wurde gezeigt, dass QS-21 eine ausgewogene T-Helfer-1 (Th1) und T-Helfer 2 (Th2) Immunantwort induziert, höhere Konzentrationen von Antikörpertitern produziert und den Schutz als Adjuvans verlängert, aber seine starke Toxizität und hämolytischen Eigenschaften begrenzen seine Entwicklung als eigenständiges klinisches Adjuvans 9,10. OP-D (Ruscogenin-O-α-L-rhamnopyranosy1-(1→2)-β-D-xylopyranosyl-(1→3)-β-D-fucopyranosid) ist eines der steroidalen Saponine, die aus der Wurzel der chinesischen Heilpflanze Ophiopogon japonicas4 isoliert wurden. Darüber hinaus ist es die pharmakologisch aktive Hauptkomponente (Shen Mai San), die in Radix Ophiopogonis gefunden wird und von der bekannt ist, dass sie bestimmte pharmakologische Eigenschaften aufweist11. Darüber hinaus ist es ein Mitglied der Familie der Liliaceae und wird häufig wegen seiner hemmenden und schützenden Wirkung bei zellulären Entzündungen und Myokardverletzungen verwendet. Zum Beispiel verbessert OP-D DNCB-induzierte atopische Dermatitis-ähnliche Läsionen und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) entzündliche HaCaT-Zellen in BALB/c-Mäusen12. Wichtig ist, dass OP-D den antioxidativen Schutz des Herz-Kreislauf-Systems fördert und das Herz vor Doxorubicin-induzierten autophagischen Verletzungen schützt, indem es sowohl die Bildung reaktiver Sauerstoffspezies als auch die Schädigung der mitochondrialen Membran reduziert. Experimente haben gezeigt, dass die Einnahme von OP-D mit Monodesmosid dazu beiträgt, die Immungesundheit zu stärken, die Anzahl der weißen Blutkörperchen und die DNA-Synthese zu erhöhen und die Antikörper länger haltbar zu machen13. Es wurde bereits festgestellt, dass OP-D eine adjuvante Wirkunghat 14.
Nanoemulsionen sind Öl-in-Wasser-Nanoformulierungen, die aus einer Kombination von Tensiden, Öl, Cotensiden und Wasser12,15 bestehen. Diese Nanoimpfstoff-Designs ermöglichen es, Antigene und Adjuvantien zusammen zu verkapseln, um die Immunstimulation zu verbessern, die Antigene zu schützen und die Reifung der dendritischen Zellen (DC) zu fördern16. Für die Entwicklung dieser neuartigen Adjuvantien, die aus dem Screening gewonnen werden, ist es wichtig, geeignete Methoden zu finden, um ihre zellulären Reaktionsfähigkeiten zu bewerten.
Ziel dieses Protokolls ist es, systematisch zu bewerten, ob Adjuvantien die Phagozytose und die Expression von Immunzellen in In-vitro-Zellkulturen verbessern können, und die wichtigsten experimentellen Methoden zu erläutern. Das Experiment ist in vier Unterabschnitte unterteilt: (1) Die Toxizität von OP-D und NOD für L929-Zellen wird durch den Zellzählkit-8 (CCK-8) Assay bestimmt; (2) Die Zytokinspiegel von endokrinem IFN-γ und IL-17A und die entsprechenden Zellzahlen in immunisierten Mäusen werden durch Splenozytenstimulation und ELISpot-Assays nachgewiesen. (3) Die Antigenpräsentationsfähigkeit von DCs nach adjuvanter Stimulation wird mittels konfokaler Mikroskopie beobachtet. und (4) die drei Arten von Zytokinen, IL-1β, IL-6 und TNF-α, in den Überständen nachgewiesen werden, die aus Peritonealmakrophagen (PMs) in normalen Mäusen gewonnen werden, die mit Adjuvantien kokultiviert wurden.

<table><tbody><tr><td>0,25 % Trypsin-EDTA (1x)</td><td>GIBCO, USA</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>96-Well-Filterplatten</td><td>Millipore. Billerica, MA</td><td>CLS3922</td><td></td></tr><tr><td>AlPO4</td><td>General Chemical Company, USA</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Automated Cell Counter Countstar</td><td>, China</td><td>IC1000</td><td></td></tr><tr><td>BALB/c Mäuse und C57BL/6 Mäuse</td><td>Beijing HFK Bioscience Co. Ltd</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>Caprylic/Capric Triglyceride (GTCC)</td><td>Beijing Fengli Pharmaceutical Co. Ltd., Peking, China</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 Kits</td><td>Dojindo, Japan</td><td>CK04</td><td></td></tr><tr><td>Zellzählplatte</td><td>Costar, Corning, USA</td><td>CO010101</td><td></td></tr><tr><td>Cell Sieve</td><td>biosharp, China</td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5810 R</td><td>Eppendorf, Deutschland&nbsp;</td><td></td><td></td>5811000398</tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DMEM basic(1x) medium</td><td>GIBCO, USA</td><td>C11885500BT</td><td></td></tr><tr><td>DSZ5000X Inverses Mikroskop</td><td>Nikon,Japan</td><td>DSZ5000X</td><td></td></tr><tr><td>EL-35 (Cremophor-35)</td><td>Mumbai, Indien</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>ELISpot classic</td><td>AID, Deutschland</td><td>ELR06</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>GIBCO, USA</td><td>10099141C</td><td></td></tr><tr><td>Voll funktionsfähiger Mikroplatten-Reader</td><td>Thermo Fisher Scientific, USA</td><td>VL0000D2</td><td></td></tr><tr><td>GFP</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, USA</td><td>P42212</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Invitrogen, USA</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor</td><td>GM-CSF, R& D Systems, USA</td><td>315-03</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15630106</td><td></td></tr><tr><td>HF 90/240 Inkubator</td><td>Heal Force, Schweiz</td><td>null</td><td></td></tr><tr><td>IL-4</td><td>PeproTech, USA</td><td>042149</td><td></td></tr><tr><td>L929 Zelllinie</td><td>FENGHUISHENGWU, China</td><td>&nbsp; NCTC Klon 929 (RRID:CVCL_0462)</td><td></td></tr><tr><td>Laser Scanning Konfokalmikroskopie</td><td>Zeiss, Deutschland</td><td>LSM 980</td><td></td></tr><tr><td>MONTANE 85 PPI</td><td>SEPPIC, Frankreich</td><td>L12910</td><td></td></tr><tr><td>MONTANOX 80 PPI</td><td>SEPPIC, Frankreich</td><td>36372K</td><td></td></tr><tr><td>Maus IFN-&gamma; ELISA-Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>1210002</td><td></td></tr><tr><td>Maus IFN-& gamma vorbeschichtetes ELISPOT Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>DKW22-2000-096</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-17A ELISA Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>1211702</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-17A ELISpotPLUS Kit</td><td>ebiosciences, USA</td><td>3521-4HPW-2</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-1&beta; ELISA-Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>1210122</td><td></td></tr><tr><td>Maus IL-6 ELISA-Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>1210602</td><td></td></tr><tr><td>Maus TNF-&alpha; ELISA-Kit</td><td>Dakewe, China</td><td>1217202</td><td></td></tr><tr><td>Nicht-essentielle Aminosäuren(100x)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>Ophiopogonin-D</td><td>Chengdu Purui Technology Co. Ltd</td><td>945619-74-9</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin-Lösung</td><td>Invitrogen, USA</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin</td><td>Solarbio, China</td><td>CA1620</td><td></td></tr><tr><td>Phosphat Gepufferte Kochsalzlösung</td><td>ZSGB-BIO, China</td><td>ZLI-9062</td><td></td></tr><tr><td>Puffer zur Lyse roter Blutkörperchen</td><td>Solarbio, China</td><td>R1010</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 Medium</td><td>Hyclone (Life Technology), USA</td><td>SH30809.01</td><td></td></tr><tr><td>Natriumpyruvat (100 mM)</td><td>Invitrogen, USA</td><td>11360070</td><td></td></tr><tr><td>Squalene</td><td>Sigma, USA</td><td>S3626</td><td></td></tr><tr><td>&beta;- Mercaptoethanol</td><td>Invitrogen, USA</td><td>21985023</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro bewertung der zellulären aktivität des nanoemulsionsimpfstoff-adjuvans ophiopogonin d

In Vitro Cellular Activity Evaluation of the Nanoemulsion Vaccine Adjuvant Ophiopogonin D

Als Hauptbestandteil von Impfstoffen können Adjuvantien die starken, weit verbreiteten, angeborenen und adaptiven Immunantworten, die mit Antigenen verbunden sind, direkt induzieren oder verstärken. Ophiopogonin D (OP-D), eine gereinigte Komponente, die aus der Pflanze Ophiopogon japonicus extrahiert wird, hat sich als nützliches Impfstoff-Adjuvans erwiesen. Die Probleme der geringen Löslichkeit und Toxizität von OP-D können durch die Verwendung eines niederenergetischen Emulgierungsverfahrens zur Herstellung der Nanoemulsion Ophiopogonin D (NOD) effektiv überwunden werden. In diesem Artikel wird eine Reihe von In-vitro-Protokollen zur Bewertung der Zellaktivität untersucht. Die zytotoxischen Wirkungen von L929 wurden mit einem Zellzähl-Kit-8-Assay bestimmt. Dann wurden die sezernierten Zytokinspiegel und die entsprechenden Immunzellzahlen nach der Stimulation und Kultur von Splenozyten von immunisierten Mäusen durch ELISA- und ELISpot-Methoden nachgewiesen. Darüber hinaus wurde die Antigenaufnahmefähigkeit in aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen (BMDCs), die aus C57BL/6-Mäusen isoliert und nach Inkubation mit GM-CSF plus IL-4 gereift waren, durch konfokale Laserscanning-Mikroskopie (CLSM) beobachtet. Wichtig ist, dass die Makrophagenaktivierung durch die Messung der Zytokine von IL-1β, IL-6 und Tumornekrosefaktor alpha (TNF-α) durch ELISA-Kits bestätigt wurde, nachdem Peritonealmakrophagen (PMs) von leeren Mäusen mit dem Adjuvans für 24 Stunden kokulturiert wurden. Es ist zu hoffen, dass dieses Protokoll anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze zur Verfügung stellen wird, um die Wirksamkeit der zellulären Reaktion neuartiger Impfstoffadjuvantien zu bewerten.

Die Bewertung der zellulären Aktivität der Adjuvantien OP-D und NOD wurde in vitro gemäß dem Protokoll durchgeführt. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD (Abbildung 1). Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann den Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen (Abbildung 2). Die Überwachung von CTLs mit ELISpot ist der Goldstandard für die Beur...

Das Protokoll enthält detaillierte Methoden, um zu beurteilen, ob die Nanoemulsion Ophiopogonin D Adjuvans eine effektive zelluläre Immunantwort fördert.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

As a principal ingredient of vaccines, adjuvants can directly induce or enhance the powerful, widespread, innate, and adaptive immune responses associated ...

Dieses Protokoll kann anderen Forschern direkte und effektive experimentelle Ansätze und die detaillierten Schritte zur Bewertung der zellulären Reaktionswirksamkeit neuartiger Impfstoffadjuvantien liefern. Es kann den Forschern nicht nur spezifische zelluläre Bewertungsmethoden für Adjuvantien zur Verfügung stellen, sondern auch Extraktionsmethoden wie BM-Erkrankungen aufschlüsseln. Diese Protokolle zeigen nicht nur keine Toxizität und eine hohe zelluläre Abgabe, sondern bieten auch detaillierte Verfahren für die adjuvante Bewertung.Schalten Sie zunächst das Wasserbad ein und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein. Nach dem Sammeln eines Röhrchens mit gefrorenen L929-Zellen aus flüssigem Stickstoff schnell im Wasserbad auftauen. Nachdem Sie die Zellen in ein steriles 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pipettiert haben, fügen Sie zwei Milliliter DMEM hinzu und mischen Sie gut.Die Proben werden fünf Minuten lang bei 129 x g zentrifugiert. Und nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie zwei Milliliter DMEM hinzu, um die Zellen zu resuspendieren. Zentrifugieren Sie die Proben erneut.Und nachdem der Überstand verworfen wurde, fügen Sie sechs Milliliter DMEM-Vollmedium zur Resuspension hinzu und geben Sie sie in einen T25-Zentimeter-Quadrat-Kulturkolben in einem 37-Grad-Inkubator mit 5% Kohlendioxid für 48 Stunden. Am 24. Tag nach der Grundimmunisierung nehmen Sie die Mäuse aus dem Tierzimmer, legen Sie sie in eine Glasschale und weichen Sie fünf Minuten lang 75% Alkohol ein. Legen Sie die Zentrifugenröhrchen auf ein Zentrifugengestell, nummerieren Sie die Einweg-Petrischalen und geben Sie mit einer 10-Milliliter-Pipette fünf Milliliter PBS in jede Petrischale.Machen Sie einen sechs bis acht Zentimeter langen Schnitt mit einer Schere in der Mitte der linken Bauchseite der Maus. Reißen Sie die Haut auf, um die Bauchdecke freizulegen und den langen roten Streifen der Milz zu finden. Als nächstes heben Sie das Peritoneum auf der unteren Seite der Milz mit einer Pinzette an.Schneiden Sie es auf und drehen Sie es nach oben, um die Milz freizulegen. Heben Sie die Milz mit einer Pinzette an. Trennen Sie das Bindegewebe unter der Milz mit einer Augenschere und entfernen Sie die Milz.Geben Sie die Milz in eine Petrischale mit fünf Millilitern PBS und mahlen Sie sie mit einem Sieb und einem Spritzenkolben. Nach dem Mahlen wird die Flüssigkeit mit einer Pipette entsprechend der Nummerierung in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen überführt. Anschließend wird die Flüssigkeit bei 453 x g fünf Minuten lang zentrifugiert.Und nachdem Sie den Überstand verworfen haben, fügen Sie jedem Röhrchen drei Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzu. Resuspendieren Sie die Zellen und lysieren Sie bei Raumtemperatur für 10 Minuten. Dann fügen Sie 10 bis 12 Milliliter PBS zu jeder Tube hinzu.Und nach dem Mischen und Zentrifugieren bei 453 x g für fünf Minuten verwerfen Sie den Überstand und geben Sie 10 Milliliter PBS in jedes Zentrifugenröhrchen und resuspendieren Sie die Zellen. Nehmen Sie 20 Mikroliter jeder Probe in eine Vertiefung der Zellzählplatte und erfassen Sie die Anzahl der lebenden Zellen mit einem automatisierten Zellzähler. Anschließend werden die Proben fünf Minuten lang bei 453 x g zentrifugiert.Und nach dem Verwerfen des Überstands auf 2,5 x 10 bis sechs Zellen pro Milliliter mit RF10-Medium verdünnen und zu einer 96-Well-Platte bei 100 Mikrolitern pro Vertiefung hinzufügen. Schneiden Sie mit einer Schere einen sechs bis acht Zentimeter langen Schnitt unter dem Bauch der Maus und klemmen Sie die beiden Enden der Öffnung ein, um sie in verschiedene Richtungen zu trennen und die Beine der Maus freizulegen. Trennen Sie den Oberschenkelknochen der Maus vom Körper der Maus und die Tibia vom Gelenk.Und halten Sie die Knochen an beiden Enden intakt. Als nächstes entfernen Sie das restliche Gewebe und den Knorpel aus den Gelenkgelenken an beiden Enden des Oberschenkelknochens mit Schere und Pinzette. Die Oberschenkelknochen fünf Minuten lang in 75%igem Alkohol einweichen und dann in einer sterilen PBS-Lösung einweichen, um den Oberflächenalkohol abzuwaschen.Dann schneiden Sie die Enden der Oberschenkelknochen mit einer Schere ab und spülen Sie das Knochenmark in einer sterilen Petrischale mit steriler PBS-Lösung ab, gefolgt von einer Aspiration mit einer Ein-Milliliter-Spritze. Wiederholen Sie das Waschen drei- bis fünfmal. Als nächstes wird mit einem Zellsieb filtriert und die aus dem Knochenmark stammenden dendritischen Zellen in einem 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gesammelt.Nach dem Zentrifugieren der Proben bei 290 x g für fünf Minuten wird der Überstand verworfen und vier Milliliter Lysepuffer für rote Blutkörperchen hinzugefügt, resuspendiert und fünf Minuten lang bei Raumtemperatur lysiert. Als nächstes fügen Sie 10 Milliliter sterile PBS-Lösung hinzu, um das Lysat zu neutralisieren, und verwerfen Sie nach dem Zentrifugieren bei 290 x g für fünf Minuten den Überstand. Resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DMEM, das 1% Penicillin-Streptomycin-Lösung und 10% fötales Rinderserum enthält, und zählen Sie.Dann fügen Sie dem Medium den Granulozyten-Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor plus Interleukin-4 hinzu. Stellen Sie die Zellkonzentration auf 5 x 10 auf das Fünftel pro Milliliter ein und impfen Sie die Zellen auf Deckgläsern. Nach Zugabe der Zellsuspension zu einer Sechs-Well-Platte mit zwei Millilitern pro Vertiefung legen Sie die Platte 48 Stunden lang in einen befeuchteten Inkubator bei 37 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid.Wechseln Sie das Medium nach zwei Tagen vollständig und wechseln Sie die Hälfte des Mediums nach vier Tagen. Tauchen Sie die Mäuse nach der Euthanasie in 75% Alkohol und legen Sie sie mit dem Gesicht nach oben in eine gläserne Petrischale in nummerierter Reihenfolge. Führen Sie die Mäuse durch das Transferfenster in den sterilen Operationssaal und legen Sie sie für fünf Minuten auf den Operationstisch.Mit der Spritze 10 Milliliter Kochsalzlösung absaugen. Kippen Sie die Mäuse um ca. 45 Grad nach unten und injizieren Sie sie in die Mitte der Bauchhöhle. Pro 10 Milliliter etwa fünf Milliliter Zellsuspension in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen geben und die Injektion dreimal wiederholen.Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 129 x g für fünf Minuten, um peritoneale primäre Makrophagen der Maus zu erhalten. L929-Fibroblasten sind ein nützliches Screening-Modell für die In-vitro-Toxizitätsprüfung von NOD. Die Quantifizierung der inflammatorischen Zytokinspiegel in der Milz kann Forschern helfen, die Immunantwort besser zu verstehen.Die Überwachung zytotoxischer T-Lymphozyten mit enzymgebundenem Immunospot ist der Goldstandard für die Beurteilung der antigenspezifischen T-Zell-Immunität in klinischen Studien und für das Screening von Impfstoffkandidaten. Die erhöhte Aufnahme eines Antigens durch dendritische Zellen kann eine verstärkte adaptive Immunantwort hervorrufen. Makrophagen spielen eine wichtige Rolle bei der Präsentation von Antigenen für T-Zellen sowie bei der Induktion anderer Antigen-präsentierender Zellen, ko-stimulatorische Moleküle zu exprimieren und dadurch adaptive Immunantworten zu initiieren.Die Isolierung von Zellen unter dem Verhältnis von Wirkstoff- zu Zellwirkung ist von größter Bedeutung.

in-vitro-cellular-activity-evaluation-nanoemulsion-vaccine-adjuvant

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Dieses Video zeigt eine Methode zur Bewertung der Antikörper-Immunantwort auf einen neuartigen adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoff bei präimmunisierten Mäusen. Die Immunisierung verstärkt die Antikörperantwort, was durch die Bestimmung der IgG-Antikörpertiter bestätigt wird.

Messung des Immunglobulin-G-Spiegels im Vergleich zu einem Testimpfstoff in einem Mausserum

Dieses Video zeigt die Herstellung von Nanoemulsions-Tumorimpfstoffen. Die stabilen Ölreservoir-Depots, die synthetische Peptide und Adjuvantien enthalten, werden durch niederenergetische Nanoemulsionen hergestellt, was für die Tumorimmuntherapie vielversprechend ist.

Herstellung eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs

Wir stellen Ihnen hier einen Antrag auf eine immunologische Standardtechnik (CFSE gebeizt OT-ich Verbreitung) schnell Adjuvans-vermittelten zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Generation überwachen sollen in-vivo. Diese schnelle Abschätzung der CTL-Kapazitäten ist nützlich für die Entwicklung der prophylaktische Impfstoffe gegen intrazelluläre Erreger sowie therapeutische krebsimpfstoffe.

Schnelle In-Vivo Beurteilung des Adjuvans der zytotoxischen T-Lymphozyten Generation Fähigkeiten für die Impfstoffentwicklung

Experimentelle Verfahren für die spätere Gewinnung von lymphatischen Gewebe, lymphatischen Dendritische Zelle Aktivierung testen werden nach der Behandlung eine immunstimulierende Nanomaterials beschrieben.

Immunstimulierenden Agent Bewertung: Lymphatischen Gewebe Extraktion und Injektion Route-Dependent Dendritische Zelle Aktivierung

Hier wird ein einfaches Protokoll zur Herstellung von mRNA-Nanopartikeln auf Basis von Poly(beta-Aminoester)-Polymeren vorgestellt, das einfach durch Änderung der verkapselten mRNA angepasst werden kann. Der Workflow für die Synthese der Polymere, der Nanopartikel und deren in vitro essentielle Charakterisierung werden ebenfalls beschrieben. Ein Proof-of-Concept zur Immunisierung wird ebenfalls hinzugefügt.

Synthese und Charakterisierung von mRNA-beladenen Poly(beta-Aminoestern) Nanopartikeln für Impfzwecke

Hier stellen wir detaillierte Methoden zur Herstellung und Evaluierung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo vor.

Herstellung, Eigenschaften, Toxizität und Wirksamkeitsbewertung des nasalen selbstassemblierten Nanoemulsions-Tumorimpfstoffs in vitro und in vivo

Um effiziente Adjuvantien rational zu gestalten, haben wir die Poly-Milchsäure-Co-Glykolsäure-Nanopartikel-stabilisierte Pickering-Emulsion (PNPE) entwickelt. Das PNPE besaß eine einzigartige Weichheit und eine hydrophobe Schnittstelle für einen potenten zellulären Kontakt und bot eine Antigenladung mit hohem Gehalt, was die zelluläre Affinität des Abgabesystems zu Antigen-präsentierenden Zellen verbesserte und eine effiziente Internalisierung von Antigenen induzierte.

Zelluläre Affinität der partikelstabilisierten Emulsion zur Förderung der Antigeninternalisierung

Das vorliegende Protokoll bereitet die physikalischen Eigenschaften, die Immunantwort und die In-vivo-Schutzwirkung eines neuartigen Nanoemulsions-Adjuvans-Impfstoffs vor und bewertet sie.

Evaluierung der Immunantwort eines adjuvanten Nanoemulsionsimpfstoffs gegen Methicillin-resistente Staphylococcus aureus (MRSA)-Infektion

In diesem Protokoll haben wir eine mit einer kationischen Nanoemulsion verkapselte Retinsäure (RA) entwickelt, die als Adjuvans verwendet werden kann, um antigenspezifische systemische und mukosale Reaktionen zu fördern. Durch die Zugabe der von der FDA zugelassenen RA zur Nanoemulsion wurde antigenspezifisches sIgA in der Vagina und im Dünndarm nach intramuskulärer Injektion der Nanoemulsion gefördert.

Kationische Nanoemulsions-verkapselte Retinsäure als Adjuvans zur Förderung von OVA-spezifischen systemischen und mukosalen Reaktionen

T-Lymphozyten-Migration tritt bei der Referenzfahrt zu lymphatischen Organen, Ausfahrt aus dem Gefäßsystem, und das Eintreten in den peripheren Geweben. Hier beschreiben wir ein Protokoll, das verwendet werden, um T-Lymphozyten-Migration zu analysieren...

Menschliche T-Lymphozyten-Isolierung, Kultur und Analyse der Migration In Vitro</em

Erfahren Sie die Bewertung zellulärer Immunantworten mit dem Nanoemulsionsadjuvans Ophiopogonin D. Dieses Protokoll demonstriert die Zelllieferung und Toxizität an L929-Zellen für die Impfstoffentwicklung.

In vitro Bewertung der zellulären Aktivität des Nanoemulsionsimpfstoff-Adjuvans Ophiopogonin D

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