Kombination von Clearing- und Fluoreszenzmikroskopie zur Visualisierung von Veränderungen der Genexpression und physiologischen Reaktionen auf Plasmodiophora brassicae

Plasmodiophora brassicae ist der bodenbürtige obligatorische biotrophe Erreger, der Pflanzen aus der Familie der Kreuzblütengewächse (Brassicaceae) befällt. Bei der Infektion löst der Erreger die Entwicklung von Gallen in den unterirdischen Teilen der Pflanze aus, daher der Name der Krankheit Clubroot. Die Entwicklung von Gallen geht mit einer sehr komplexen Umprogrammierung einher.

Daher ist die Möglichkeit, interne Veränderungen während der Krankheit zu verfolgen, entscheidend für das Verständnis dieser Pflanzen-Pathogen-Interaktion. Unser Protokoll verbessert die Bildgebung von komplexen, dicken und Gallen. Es erleichtert die Visualisierung von Veränderungen der Genexpression, physiologischen Reaktionen, des Phytohormonhaushalts, des Krankheitsverlaufs, der Sporenverteilung und der lokalen Verholzung.

Das Protokoll bewahrt fluoreszierende Proteine in Proben, was die Lagerung und Verarbeitung von Objekten über einen langen Zeitraum ermöglicht. Es ermöglicht auch die Verfolgung biochemischer und struktureller Veränderungen, die das Fortschreiten der Krankheit begleiten. Sara Blicharz, Postdoktorandin in unserer Gruppe, Deeksha Singh, Doktorandin aus unserem Labor, und Kornel Michalak, Doktorandin der Gruppe Professor Agnieszka Bagniewska-Zadworna an der Adam-Mickiewicz-Universität, demonstrieren das Verfahren.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung des Pflanzengewebes. Entfernen Sie vorsichtig Erde aus den Wurzelsystemen von Clubroot-infizierten und nicht infizierten Pflanzen. Gründlich mit Wasser reinigen und Hypokotylen und Gallen in Mikrozentrifugenröhrchen sammeln.

Fixieren Sie die Proben in 200 bis 500 Mikrolitern Paraformaldehyd-Fixiermittel für eine Stunde bei Raumtemperatur unter Anwendung eines konstanten Vakuums von 700 Millibar mit einer Vakuumpumpe. Stellen Sie sicher, dass das Objekt vollständig in die Paraformaldehydlösung eingetaucht ist. Verwenden Sie 4% Agarose zum Einbetten von nicht infizierten Hypokotylen und infizierten Gallen.

Kochen Sie die Lösung, um Agarose aufzulösen, und gießen Sie sie, wenn sie abkühlt, während sie noch viskos ist. Trocknen Sie das Objekt einige Sekunden lang leicht auf einem Gewebe, um überschüssiges Paraformaldehyd zu entfernen. Verwenden Sie Zahnstocher oder Pinzetten, um das Pflanzenobjekt sorgfältig in Agarose einzubetten und zu orientieren.

Um schräge Abschnitte zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass das Objekt richtig ausgerichtet und geformt ist, so dass seine Achse senkrecht zur Ebene der Vibrationsklinge steht. Um die Erstarrung der Agarose zu beschleunigen, stellen Sie eine Petri- oder Multikulturplatte für 10 Minuten bei vier Grad Celsius auf. Schneiden und formen Sie das Objekt vorsichtig mit einer Klinge innerhalb eines Agaroseblocks und notieren Sie die bevorzugte Ausrichtung für das Schneiden.

Kleben Sie den Agaroseblock oder die große Galle, um ihn mit Cyanacrylat oder Sofortkleber und Abdeckband ordnungsgemäß auf dem Probenhalter zu befestigen. Passen Sie die Dicke für Abschnitte, Geschwindigkeit und Vibrationsamplitude entsprechend der Dicke und Größe der Galle an. Fügen Sie destilliertes Wasser in das Wasserbad und beginnen Sie mit dem Schneiden.

Sammeln Sie Abschnitte vorsichtig mit Pinzette oder Bürste und geben Sie sie in ein Mikrozentrifugenröhrchen, das einen Milliliter 1X PBS-Puffer enthält. Entfernen Sie 1X PBS aus dem Mikrozentrifugenröhrchen und fügen Sie 200 bis 500 Mikroliter Klärlösung hinzu. Ersetzen Sie die Clearing-Lösung durch die neue, wenn sich ihre Farbe nach einiger Zeit während der Probenverarbeitung ändert.

Führen Sie eine Calcofluor-Weiß-Färbung für die Zellwände der auslagernden Pflanzenzellen durch, indem Sie 5% der Calcofluor-Weiß-Färbung in der Reinigungslösung vorbereiten. Dann färben Sie die Zellen im Dunkeln für mindestens fünf Minuten. Färben Sie Lipide mit Nilrot und Lignine mit Basic Fuchsin Lignin-Färbung wie im Textmanuskript beschrieben und montieren Sie die geklärten Abschnitte auf den Mikroskopie-Objektträger.

Dann beobachten Sie die Zellen unter einem Epifluoreszenz- oder Konfokalmikroskop. Verwenden Sie mehrere Aufnahmemodi, um mehr als ein Fluoreszenzspektrum gleichzeitig abzubilden. Krankheitsdynamik und Krankheitserregerakkumulation wurden in Gallen verfolgt, die von Plasmodiophora brassicae besiedelt waren, und große Zellen mit P.brassicae-Ruhesporen wurden nach Nilrotfärbung beobachtet.

Veränderungen in der Xylemdifferenzierung bei einer P.brassicae-Infektion wurden mit Basic Fuchsin-Färbung visualisiert. Die Arabidopsis-Pflanzen, die das pHCA2:erRFP-Konstrukt beherbergen, wurden verwendet, um die HCA2-Genexpression im Phloemgewebe in Klumpwurzelgallen sichtbar zu machen. HCA2 kolokalisierte sich mit dem Phloem in den späten Stadien der P.brassicae-getriebenen Gallenentwicklung, und die Genaktivität spiegelte den Mechanismus wider, durch den P. brassicae die Phloemkomplexität erhöht.

16 Tage nach der Inokulation wurden die differentiellen Cytokinin-Reaktionen zwischen infizierten und nicht infizierten Pflanzen durch Überprüfung der Expression des TCS:GFP-Markers in sich entwickelnden Gallen bewertet. Die Cytokinin-Reaktionen scheinen in infizierten Gallen signifikant vermindert zu sein, während sie vor allem im Phloempool bei nicht infizierten Pflanzen stark blieben. Die kritischsten Schritte sind die Fixierung in PFA, das Einbetten und Schneiden.

Für die Vibrationsschnitte müssen die Parameter Geschwindigkeit, Amplitude und Dicke optimiert und sorgfältig angepasst werden, um qualitativ hochwertige Abschnitte zu erhalten. Vibratomschnitt- und Gewebereinigungstechniken haben den Weg für die Verbesserung der mikroskopischen Analyse physiologischer Reaktionen während Pflanzen-Mikroben-Interaktionen und Geweben mit sekundärem Wachstum mit komplexer zellulärer Anatomie geebnet.